水蛭素对牙龈成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β₁表达的影响

Abstract

目的

观察水蛭素对人牙龈成纤维细胞（HGFs）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及转化生长因子-β₁（TGF-β₁）表达变化的规律，探讨水蛭素影响牙龈改建的可能作用机制。

方法

体外培养并鉴定HGFs，利用不同浓度的水蛭素分别作用于正常（对照组）和受长期机械外力作用后增生的HGFs（实验组），通过实时定量聚合酶链反应法和免疫细胞化学法检测TGF-β₁及bFGF的表达。

结果

未加入水蛭素时，受长期机械外力作用后，实验组促进HGFs增殖胶原合成的TGF-β₁表达升高，而抑制胶原合成的bFGF表达降低（P<0.05）。加入水蛭素干预增生的HGFs后，可正向调节bFGF表达，而负向调节TGF-β₁的表达（P<0.05）。

结论

外力作用干扰了HGFs胶原合成与降解之间的平衡，水蛭素可能通过调节这一平衡而促进牙龈改建过程。

近年来，牙周组织在正畸力作用下改建机理的研究蓬勃发展，牙槽骨和牙周膜的改建机理已有了较为详尽的研究，而牙龈组织的改建规律和模式还知之甚少。正畸临床中，在关闭间隙、扭转牙的改正以及牙齿唇倾移动等情况下，常可观察到牙龈受压、堆积、退缩、内陷或形成裂隙等现象，这些情况可在正畸治疗后继续存在，甚至持续多年。当去除矫治力并进入保持阶段后，经关闭间隙和扭转改正治疗的牙齿有复发到治疗前位置的倾向。目前认为，牙龈纤维受牵拉、弹性纤维量增加和牙龈受压堆积后的弹性性能增加是复发的主要原因之一。

正畸治疗过程也是牙周组织损伤与修复的过程，其中牙龈的变化与增生瘢痕有着相似的病理过程和临床表现[1]–[2]。瘢痕形成是皮肤损伤达到一定程度后组织修复的必然结果。皮肤瘢痕可分为增生性瘢痕、萎缩性瘢痕、挛缩性瘢痕、凹陷性瘢痕，其病理特征是以成纤维细胞（fibroblasts，FB）为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞外基质的过度沉积。有学者[3]报道，水蛭素可抑制体外培养的增生瘢痕成纤维细胞的生长，抑制动物实验性瘢痕的增生。本项目组从中国传统中药的角度出发，将水蛭素成功抑制增生瘢痕的作用和影响引入正畸牙龈改建的研究中，前期研究显示：水蛭素能直接抑制正常人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）的增殖活性，其抑制效应呈浓度依赖性。那么，压应力作用下的HGFs改建模式怎样？水蛭素对压应力作用下HGFs生物学行为有何影响？本研究拟采用不同浓度水蛭素分别作用于来源于正常和增生牙龈的HGFs，通过检测碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β₁在药物处理前后的表达变化，以期探讨水蛭素影响牙龈改建的可能作用机制。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂

根据Genbank human β-actin、bFGF、TGF-β₁的cDNA序列，利用软件Primer Premier 5.0设计特异引物，并由上海生物工程技术服务公司合成。各基因的上下游引物序列如下。β-actin：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′；bFGF：5′-CCAGTTCGATTCAGTGCCACA-3′，5′-GTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG-3′；TGF-β₁：5′-AGCGACTCGCCAGAGTGGTTA-3′，5′-GCAGTGTAGTATCCCTGCTGTCA-3′。天然水蛭素（专利号ZL03113566.8，广西科康生物科技有限责任公司）。

1.2. 实验分组

牙龈组织标本供体均为广西医科大学附属口腔医院的就诊患者，取材前均经患者知情同意。对照组牙龈标本取自需行正畸或阻生牙拔除的年轻患者，患者无系统性疾病，无牙龈炎症及牙龈增生。试验组牙龈取自正畸治疗经过定期龈上洁治术后，但牙龈仍明显增生、质韧而需行牙龈成形术的年轻患者，患者无系统性疾病，未使用过可导致牙龈增生的药物。

试验组及对照组每组5例，共10例，其中男性3例，女性7例，年龄22~34岁，平均年龄26岁。

1.3. 建立HGFs细胞系

参考经典的组织块培养法进行HGFs原代培养，鉴定细胞来源，建立HGFs的细胞系。取第3~6代细胞用于实验。

1.4. 实时定量聚合酶链反应（real time quantity polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测不同浓度水蛭素作用下TGF-β₁、bFGF mRNA表达

1.4.1. 药物作用

取生长状态良好的第3~6代HGFs，培养瓶中常规培养72 h，吸弃原培养液，用DMEM将水蛭素冻干粉配制成1、2、4 U·mL⁻¹的培养液，继续培养24 h。实验组与对照组中的空白组培养液用DMEM代替。每个浓度设3个重复样本。

1.4.2. RT-qPCR反应

按Trizol（Invitrogen公司，美国）法的操作步骤提取细胞总RNA，按试剂盒（Fermentas公司，加拿大）说明书进行逆转录反应，得到20 µL cDNA。

20 µL PCR反应体系：2×Fermentas Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 9 µL，cDNA2 µL，上下游引物（10 pmol·µL⁻¹）各1 µL，ddH₂O 7 µL。反应条件：预变性95 °C 10 min，变性95 °C 15 s，退火60 °C 30 s，延伸72 °C 30 s，循环40次。每份cDNA样品均设3个平行样品，PCR扩增中阴性对照组以ddH₂O替代模板cDNA。计算出Ct值，按照2^−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.4.3. 琼脂糖凝胶电泳

将TGF-β₁、bFGF扩增产物在2.5%琼脂糖凝胶中进行电泳验证。

1.5. 免疫细胞化学法（immunocytochemistry，ICC）检测不同浓度水蛭素作用下TGF-β₁、bFGF蛋白的表达

1.5.1. ICC

细胞在六孔板中培养，药物作用同1.4.1。ABC法制取玻片，DAB显色。其中用兔抗人bFGF、TGF-β₁多克隆抗体作为一抗工作液（TGF-β₁抗体滴度为1∶100，bFGF抗体滴度为1∶200）。

1.5.2. 观察方法和结果判定

由2位不了解实验目的的高年资病理医师在普通光学显微镜下评价结果。bFGF、TGF-β₁蛋白阳性产物定位于细胞质。采用DMR+Q550型病理图像分析仪（德国莱卡公司）测定灰度值。灰度值越高，蛋白表达量越少。

1.6. 统计学处理

使用SPSS 18.0软件，采用成组设计方差分析进行各组间的比较，检验水准双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. HGFs细胞系的建立

培养7~12 d后，组织块边缘有成纤维细胞游出，以组织块为中心呈放射状排列生长。细胞呈典型的梭形和不规则三角形，胞体狭长、透亮，细胞质丰富，细胞膜清晰。细胞抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证明细胞为中胚层来源，且无上皮源性细胞混杂。

2.2. 不同浓度的水蛭素作用下bFGF mRNA和蛋白的表达

含水蛭素培养液作用24 h后，随着水蛭素浓度的升高，bFGF mRNA和蛋白的相对表达量逐渐升高（表1、图1），各浓度组之间的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。除未加入水蛭素时，实验组相对于对照组bFGF表达受抑制外，其余各实验组与对照组相比bFGF表达明显升高，其差异有统计学意义（P<0.05）。

表 1. 水蛭素作用下bFGF mRNA和蛋白的相对表达量.

Tab 1 The relative expression of bFGF mRNA and protein of normal and hyperplasia HGFs cultured in different hirudin concentrations

水蛭素浓度/U·mL−1	mRNA		蛋白/灰度值
	实验组	对照组	实验组	对照组
0	0.900 7±0.007 1	1	194.753 3±3.057 5	185.456 7±2.657 7
1	1.214 0±0.003 0	1.123 3±0.003 1	143.353 3±3.174 1	162.120 0±2.243 3
2	1.617 0±0.006 0	1.441 7±0.005 1	105.986 7±1.272 1	131.153 3±2.563 9
4	1.972 6±0.005 1	1.835 0±0.002 6	58.826 7±1.486 6	91.490 0±0.452 9

注：水蛭素各浓度之间比较P<0.05，实验组与对照组相应浓度之间比较P<0.05。

x±s

图 1. 水蛭素对HGFs bFGF蛋白表达的影响 DAB × 100.

Fig 1 The bFGF protein expression of HGFs cultured in different hirudin concentrations DAB × 100

左：1 U·mL⁻¹；中：2 U·mL⁻¹；右：4 U·mL⁻¹。

2.3. 不同浓度的水蛭素作用下TGF-β₁ mRNA和蛋白的表达

含水蛭素培养液作用24 h后，随着药物浓度的升高，实验组和对照组TGF-β₁的相对表达量逐渐降低，提示水蛭素抑制TGF-β₁表达的作用增强（表2、图2）。各实验组之间的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。除未加入水蛭素时，实验组相对于对照组TGF-β₁表达升高外，其余各实验组与对照组相比TGF-β₁表达抑制作用明显，表达差异有统计学意义（P<0.05）。

表 2. 水蛭素作用下TGF-β₁ mRNA和蛋白的相对表达量.

Tab 2 The relative expression of TGF-β₁ mRNA and protein of normal and hyperplasia HGFs cultured in different hirudin concentrations

水蛭素浓度/U·mL−1	mRNA		蛋白/灰度值
	实验组	对照组	实验组	对照组
0	1.173 3±0.035 1	1	31.680 0±2.174 4	45.460 0±1.695 6
1	0.797 6±0.008 9	0.869 0±0.004 6	93.136 7±3.382 5	54.980 0±2.138 6
2	0.384 7±0.004 0	0.536 0±0.013 2	152.020 0±1.526 9	92.630 0±3.465 6
4	0.122 6±0.004 1	0.321 3±0.011 0	209.103 3±1.818 8	146.300 0±2.707 5

注：水蛭素各浓度之间比较P<0.05，实验组与对照组相应浓度之间比较P<0.05。

x±s

图 2. 水蛭素对HGFs TGF-β₁蛋白表达的影响 DAB × 100.

Fig 2 The TGF-β₁ protein expression of HGFs cultured in different hirudin concentrations DAB × 100

左：1 U·mL⁻¹；中：2 U·mL⁻¹；右：4 U·mL⁻¹。

2.4. RT-qPCR产物鉴定

RT-qPCR的3种产物经琼脂糖凝胶电泳进行验证，其结果见图3：β-actin为564 bp，bFGF为182 bp，TGF-β₁为150 bp。

图 3. RT-qPCR产物电泳结果.

Fig 3 The electrophoretogram of RT-qPCR products

M：Marker；1：β-actin；2：bFGF；3：TGF-β₁。

3. 讨论

3.1. bFGF、TGF-β₁对HGFs功能活动的影响

正常的牙龈组织依赖于正向与负向两类细胞因子调控细胞的增生与代谢活动，从而维持胶原等细胞外基质形成与降解之间的动态平衡。在已知的细胞因子中，TGF-β₁是最重要的致纤维化细胞因子，能调节起源于间充质细胞，特别是FB和成骨细胞的增殖功能，是组织损伤修复的主要调节因子[4]。TGF-β₁刺激由牙周膜成纤维细胞产生的胶原及其他基质成分的沉积，抑制基质金属蛋白酶的分泌，并刺激基质金属蛋白酶抑制剂的表达，从而抑制胶原分解[5]–[6]。Younai等[7]观察到，在瘢痕中加入TGF-β₁抗体可显著抑制瘢痕成纤维细胞对TGF-β₁的反应，使其合成胶原的数量减少，从而抑制瘢痕形成。

bFGF分布于体内多种组织，能以多种方式在多个环节上影响胶原生成过程，包括刺激FB增殖和迁移，诱导或促进胶原的形成，还可通过调节胶原纤维的合成与分解作用使胶原含量在新生结缔组织中达到相对平衡[8]。李卫华等[9]的实验研究证明，bFGF可以使FB的生物学特性发生明显改变，使增生性瘢痕中FB的生物学特性趋于正常。对胶原合成的抑制作用主要是通过与FB上的受体结合，下调增生瘢痕组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达，提高胶原酶mRNA水平，刺激胶原酶合成，抑制纤维素合成，防止过量的细胞外基质沉积。本实验观察了bFGF、TGF-β₁在正常和增生牙龈HGFs中的表达变化的规律，以期解释正畸牙移动过程中HGFs的胶原代谢活动的变化。

3.2. 增生牙龈组织来源的HGFs的bFGF、TGF-β₁蛋白和mRNA表达的变化

本实验发现：与正常牙龈的HGFs比较，受长期机械外力作用后，增生牙龈组织来源的HGFs发生改变，促进HGFs增殖胶原合成的TGF-β₁表达升高，而抑制胶原合成的bFGF表达降低。与本研究的结果一致，Jeon等[10]的研究也认为，机械力能上调HGFs中Ⅰ型胶原的表达，而组织胶原酶的基因表达则显著下降。Redlich等[11]通过离心力加载体外培养的HGFs，结果发现，牙龈胶原纤维和弹性纤维的基因表达上调，胶原酶基因的表达下降，这是HGFs代谢的分子生物学基础。这些变化提示，压力作用干扰了胶原合成与降解之间的平衡。Krishnan等[12]对机械-生物效应的进一步研究表明，HGFs受到机械应力后细胞内张力改变，释放三磷酸腺苷，引起P2x4嘌呤受体合成增加，Ca²⁺向细胞内涌入传递胞外信号，导致细胞内级联信号转导的发生，继而启动胞内基因的转录。应力作用干扰了HGFs胶原合成与降解之间的平衡，通过外源性的措施干预正畸牙移动过程中HGFs的胶原代谢活动，即促进胶原降解，抑制胶原合成，可能有利于牙龈的改建。

3.3. 水蛭素对增生牙龈组织来源的HGFs的bFGF、TGF-β₁蛋白和mRNA表达的影响

人类应用水蛭治疗疾病已有3 000余年的历史。1955年，前东德科学家Markwardt从吸血水蛭（蚂蝗）头部唾液腺的分泌物分离出高纯度水蛭素[13]。水蛭素具有多方面的用途：抗凝抗血栓抗炎，消除淤血，即时提高血流量，改善缺血等[14]；还具有抑制细胞增生的作用。研究[3],[15]发现，水蛭素可抑制体外培养的增生瘢痕FB的生长，抑制动物实验性瘢痕的增生。水蛭素对增生性瘢痕的抑制作用，一方面可能是抑制FB的增殖，另一方面可能是抑制胶原的合成和促进胶原的降解所致。

Silverio-Ruiz等[16]发现，TGF-β₁可以促进HGFs的Ⅰ、Ⅲ型胶原以及胶原酶抑制剂的合成，而bFGF则发挥抑制HGFsⅠ型胶原表达的作用，并且具有浓度依赖性。梁妍[17]也发现，bFGF在实验质量浓度范围内（0.1~100 ng·mL⁻¹）对HGFs的胶原合成呈现抑制作用，而TGF-β₁在实验质量浓度范围内（0.1~100 ng·mL⁻¹）可促进HGFs细胞外胶原合成。农晓琳等[3]研究发现，水蛭素通过下调增生瘢痕FB分泌TGF-β₁同时上调bFGF的分泌而抑制增生性瘢痕的形成。本实验结果也显示：当不同浓度的水蛭素（1、2、4 U·mL⁻¹）作用24 h后，可以上调bFGF mRNA表达而下调TGF-β₁ mRNA的表达；ICC同样验证了这一结果，即水蛭素可以上调bFGF蛋白表达而下调TGF-β₁蛋白的表达，二者均呈浓度依赖性。正畸牙龈组织的变化与增生瘢痕有着相似的临床表现和病理过程，水蛭素抑制HGFs的作用类似其对增生瘢痕FB的作用，一方面可能是抑制FB的增殖，另一方面可能是抑制胶原的合成和促进胶原的降解。

本实验结果提示：水蛭素可能调节受长期机械外力作用后增生牙龈组织来源的HGFs胶原合成与降解的过程，维持HGFs的代谢平衡。

Funding Statement

[基金项目] 高等学校博士学科点专项科研基金新教师类基金资助项目（03301213012）