Abstract
目的
探讨长链非编码RNA（lncRNA）H19对口腔癌细胞侵袭、迁移的影响以及作用机制。
方法
荧光定量聚合酶链反应检测永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞以及口腔癌细胞系CAL27中H19、miR-107、细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）的表达。siRNA H19、miR-107 mimics、pcDNA H19、anti-miR-107转染CAL27细胞，Transwell法检测H19和miR-107对细胞侵袭、迁移的影响，TargetScan数据库预测H19、miR-107、CDK6的靶向关系，双荧光素酶报告基因检测H19、miR-107、CDK6的相互作用，蛋白质印迹法（Western blot）检测H19和miR-107对靶基因CDK6蛋白水平的影响。
结果
H19在CAL27细胞中的表达高于HIOEC细胞（P<0.05）。siRNA H19转染后，H19的表达降低，抑制CAL27细胞的侵袭、迁移能力（P<0.05）。H19与miR-107的3′-UTR特异性结合，调控miR-107的表达活性。miR-107在CAL细胞中的表达低于HIOEC细胞（P<0.05），siRNA H19转染后，miR-107的表达升高，anti-miR-107共转染可促进siRNA H19对CAL27细胞的侵袭、迁移能力（P<0.05）。CDK6在CAL27细胞中的表达高于HIOEC细胞（P<0.05），CDK6的表达可被H19和miR-107共同调控。
结论
lncRNA H19通过靶向调控miR-107/CDK6信号轴影响口腔癌细胞的侵袭、迁移能力，在口腔癌的发生发展过程中起着重要作用。
Keywords: 口腔癌, 长链非编码RNA H19, 侵袭, 迁移
Abstract
Objective
To investigate the effect of the long chain non-coding RNA H19 (lncRNA H19) on the invasion and migration of oral cancer cells and its related molecular mechanism.
Methods
The expression levels of lncRNA H19, miR-107, and cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) in the immortalized oral epithelial cell line HIOEC and the oral cancer cell line CAL27 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction. CAL27 cells were transfected with siRNA H19, miR-107 mimics, pcDNA H19, or anti-miR-107, and the effects of H19 and miR-107 on the invasion and migration of cells were examined via Transwell assay. The TargetScan database predicted the targeting of H19, miR-107, and CDK6. Double luciferase reporter gene assay was performed to detect interactions among H19, miR-107, and CDK6. Western blot analysis was conducted to examine the effects of H19 and miR-107 on the protein level of the target gene CDK6.
Results
Compared with that in HIOEC cells, the expression of H19 was significantly increased in CAL27 cells (P<0.05). After transfection with siRNA H19, the expression of H19 decreased, and the invasion and migration ability of CAL27 cells were inhibited (P<0.05). H19 could bind specifically to the 3′-UTR of miR-107 to modulate the expression of miR-107. Compared with that in HIOEC cells, the expression of miR-107 significantly decreased in CAL27 cells (P<0.05). The expression of miR-107 increased after transfection with siRNA H19, and anti-mir-107 co-transfection could promote the invasion and migration ability of siRNA H19 in CAL27 cells (P<0.05). Compared with that in HIOEC cells, CDK6 expression significantly increased in CAL27 cells (P<0.05), and the expression level of the gene was co-regulated by H19 and miR-107 (P<0.05).
Conclusion
lncRNA H19 plays an important role in the development of oral cancer. It can regulate the invasion and migration of oral cancer cells by targeting the miR-107/CDK6 signaling axis.
Keywords: oral cancer, long chain non-coding RNA H19, invasion, migration
口腔癌是一种发病率较高的恶性肿瘤，治疗手段以手术为主，放疗和化疗综合使用。随着基础研究和临床治疗技术的不断发展，明显降低了患者的5年死亡率，但是其死亡率仍位于恶性肿瘤前列，是导致癌症患者死亡的主要疾病之一[1]–[3]。探究新的生物标志物和治疗靶点，对口腔癌的临床诊断和治疗具有重要意义。
研究[4]–[6]表明，长链非编码RNA（long chain noncoding RNA，lncRNA）在恶性肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。H19是一种在多种组织广泛表达的lncRNA，位于人类11p15.5染色体，作为一种印记基因，在多种肿瘤组织中表达[7]–[8]。H19在部分肿瘤中发挥致癌作用，在部分肿瘤中发挥抑癌作用。关于H19在口腔癌中的生物信息学功能研究尤其是与下游相关miRNA的靶向作用机制的报道不多。本研究通过检测H19在口腔癌细胞系中的表达量，选择口腔癌细胞系CAL27细胞验证H19和miR-107及下游靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin dependent kinase 6，CDK6）的相互关系，通过抑制H19表达观察CAL27细胞迁移、侵袭的变化，旨在探讨H19在口腔癌中的作用以及可能机制。
1. 材料和方法
1.1. 实验主要材料
永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞、口腔癌细胞系CAL27细胞（ATCC公司，美国），Defined Keratinocyte-SFM培养基、DMEM培养基、青霉素、链霉素（Gibco公司，美国），胎牛血清（Hyclone公司，美国），Trizol试剂（Takara公司，日本），siRNA H19、miR-107 mimics、pcDNA H19、anti-miR-107、双荧光素酶报告载体（上海吉玛生物有限公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美国），Matrigel胶（Sigma公司，美国），Transwell（BD公司，美国），RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）实验试剂盒（Millipore公司，美国），CDK6抗体、β肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物酶标记二抗（北京博奥森生物技术有限公司），荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）仪（ABI公司，美国），双荧光素酶测定系统（Promega公司，美国）。
1.2. 细胞培养
HIOEC细胞培养于Defined Keratinocyte-SFM培养基，CAL27细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，并加入100 U·mL−1青霉素和100 µg·mL−1链霉素，放入37 °C、5%CO2的细胞培养箱中培养。
1.3. qPCR检测
通过qPCR检测CAL27、HIOEC细胞中H19、miR-107、CDK6水平。收集细胞，使用Trizol提取细胞中总RNA。以GAPDH为对照，引物序列H19上游为5′-TGATGACGGGTGGAGGGGCTA-3′，下游为5′-TGATGTCGCCCTGTCTGCACG-3′；miR-107上游为5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3′，下游为5′-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-3′；CDK6上游为5′-TCAGGTTGTTTGA TGTGTGC-3′，下游为5′-TCCTTTATGGTTTCAGTGGG-3′。反应条件为95 °C 10 min，95 °C 15 s，60 °C 32 s，40个循环。实验重复3次，采用2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
1.4. 细胞转染
CAL27细胞稳定传代后进行转染。转染前24 h，选取对数期CAL27细胞，加入胰酶将细胞以5×105个加入6孔板中培养，待细胞密度达到80%~90%，根据Lipofectamine 2000说明书分别将siRNA H19、miR-107 mimics、pcDNA H19、anti-miR-107转染细胞。qPCR检测转染效果。
1.5. Transwell法检测细胞的侵袭、迁移能力
收集CAL27细胞，加入0.25%胰酶消化，调整为单细胞悬液，接种至6孔板中。根据1.4所示进行转染，同时设立阴性对照。细胞经不同转染培养24 h，加入无血清培养基，以每孔5×105个细胞加入上室上孔，下室加入500 µL含10%胎牛血清的培养基，37 °C培养24 h；湿棉签擦去未穿出细胞，多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色15 min，光学显微镜下拍照，随机取5个视野计数，取平均值。将Matrigel胶与无血清培养基按1︰3的比例混匀，包被于Transwell上室，37 °C干燥2 h，其余与迁移实验相同。
1.6. 双荧光素酶报告基因
通过TargetScan数据库（http://www.targetscan.org/vert_71/）预测H19与miR-107以及miR-107与CDK6的3′-端非编码区域（3′-UTR）碱基存在互补现象。为了证实H19与miR-107以及miR-107与CDK6是否存在靶向关系，将H19 3′-UTR或CDK 63′-UTR区域构建入野生型和突变型双荧光素酶报告载体，并共转染miR-107 mimics，37 °C、5%CO2培养48 h，收集细胞，根据双荧光素酶测定系统分析双荧光素酶的活性，检测H19、miR-107、CDK6的相互作用。
1.7. 蛋白质印迹法（Western blot）
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离各组细胞总蛋白，并转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中，加入5%的脱脂奶粉溶液充分封膜；并与CDK6（1︰1 000）抗体和β-肌动蛋白（β-actin）（1︰1 000）抗体4 °C培养过夜后，TBST缓冲液清洗，与辣根过氧化物酶标记二抗37 °C孵育2 h，TBST缓冲液清洗，加入电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）液显色，测定蛋白质的相对表达量，分析H19和miR-107对CDK6蛋白水平的影响。
1.8. 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计处理，结果以均数±标准差表示，两组间数据的比较采用t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1. H19在口腔癌细胞中的表达及对口腔癌细胞迁移和侵袭的影响
qPCR检测结果显示，1）H19在CAL27、HIOEC细胞中的表达分别为3.124±0.328、1.002±0.086，CAL27细胞中的表达高于HIOEC细胞（P<0.05）；2）siRNA H19转染后，H19在CAL27细胞中的表达由0.986±0.102降低为0.269±0.035，差异具有统计学意义（P<0.05）；3）与阴性对照相比，siRNA H19转染可明显抑制CAL27细胞的侵袭、迁移能力（图1），差异具有统计学意义（P<0.05）。
图 1. H19对CAL27细胞迁移和侵袭的影响.
Fig 1 Effects of H19 on migration and invasion of CAL27 cells
上：细胞迁移；下：细胞侵袭。si-NC：阴性对照；si-H19：siRNA H19转染。*P<0.05。
2.2. H19靶向调控miR-107的表达
数据库预测结果显示，H19与miR-107的3′-UTR部分碱基可互补配对，表明H19可能对miR-107有一定的调控作用。双荧光素酶报告基因检测结果显示， miR-107 mimics共转染后，野生型H19的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性由1.010±0.092降低为0.324±0.041，差异有统计学意义（P<0.05），表明miR-107 mimics共转染可抑制野生型H19的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性；而突变型H19的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性不受miR-107 mimics共转染的影响（共转染前后分别为1.001±0.087、0.936±0.095，P>0.05）。这表明，H19与miR-107的3′-UTR特异性结合，调控miR-107的表达活性。
2.3. miR-107在癌细胞中的表达以及anti-miR-107对siRNA H19的影响
qPCR检测结果显示，1）miR-107在CAL27、HIOEC细胞中的表达分别为0.465±0.033、1.001±0.083，CAL细胞中的表达低于HIOEC细胞（P<0.05）；2）pcDNA H19转染后，miR-107在CAL27细胞中的表达由1.005±0.088降低为0.360±0.042，差异具有统计学意义（P<0.05）； siRNA H19转染后，miR-107的表达由1.003±0.090升高为2.682±0.311，差异有统计学意义（P<0.05）；3）与阴性对照相比，siRNA H19和anti-miR-107共转染可促进siRNA H19对CAL27细胞的侵袭、迁移能力，差异有统计学意义（P<0.05）（图2），表明下调miR-107的表达可逆转siRNA H19抑制CAL27细胞侵袭、迁移的作用。
图 2. siRNA H19和anti-miR-107共转染对CAL27细胞迁移和侵袭的影响.
Fig 2 Effects of siRNA H19 and anti-miR-107 co-transfection on migration and invasion of CAL27 cells
A：siRNA H19阴性对照；B：siRNA H19转染；C：siRNA H19+anti-miR-107阴性对照；D：siRNA H19+anti-miR-107转染。*P<0.05。
2.4. CDK6在口腔癌细胞中的表达及miR-107靶向调控CDK6的表达
qPCR检测结果显示，CDK6在CAL27、HIOEC细胞中的表达分别为3.156±0.353、1.012±0.075，CAL细胞中的表达高于HIOEC细胞，差异具有统计学意义（P<0.05）。
数据库预测结果显示，miR-107与CDK6的3′-UTR部分碱基可互补配对，表明miR-107可能对CDK6有一定的调控作用。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-107 mimics共转染后，野生型CDK6的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性由0.989±0.096降低为0.387±0.041，差异有统计学意义（P<0.05），表明miR-107 mimics共转染可以抑制野生型CDK6的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性；而突变型CDK6的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性不受miR-107 mimics共转染的影响（共转染前后分别为1.003±0.083、0.945±0.096，P>0.05）。
Western blot检测结果显示，转染miR-107 mimics或anti-miR-107对CDK6蛋白的表达量具有明显的调控作用（图3）。
图 3. miR-107靶向调控CDK6的表达.
Fig 3 Targeted regulation of CDK6 expression by miR-107
Western blot检测，A为miR-107阴性对照，B为miR-107转染，C为anti-miR-107阴性对照，D为anti-miR-107转染。与其阴性对照相比，*P<0.05。
2.5. H19和miR-107共同调控CDK6的表达
双荧光素酶报告基因结果显示，共转染miR-107 mimics和pcDNA H19可逆转野生型CDK6的3′-UTR报告基因的荧光素酶相对活性的降低，差异具有统计学意义（P<0.05）（图4）。
图 4. siRNA H19和miR-107共同调控CDK6的表达.
Fig 4 Expression of CDK6 regulated by siRNA H19 and miR-107
左：双荧光素酶报告基因检测，横坐标中，A为野生型CDK6，B为野生型CDK6+miR-107，C为野生型CDK6+miR-107+pcDNA H19，D为野生型CDK6+miR-107+siRNA H19。中：Western blot检测，横坐标中，A为pcDNA H19，B为siRNA H19，C为siRNA H19+miR-107阴性对照，D为siRNA H19+miR-107。右：Western blot检测，A为siRNA H19阴性对照，B为siRNA H19，C为siRNA H19+ anti-miR-107阴性对照，D为siRNA H19+anti-miR-107。*P<0.05。
Western blot检测结果表明，pcDNA H19转染可升高CDK6的表达， miR-107 mimics共转染可逆转此作用，差异具有统计学意义（P<0.05）；siRNA H19可以降低CDK6的表达，anti-miR-107共转染可逆转此作用，差异具有统计学意义（P<0.05）（图4）。这表明，CDK6的表达可被H19和miR-107共同调控。
3. 讨论
lncRNA在多种肿瘤细胞中发挥重要作用，参与肿瘤细胞的生长、分化、侵袭、迁移过程[9]–[11]。探究lncRNA的生物学功能可为肿瘤的治疗提供新的研究方向。H19是一种在多种组织广泛表达的lncRNA，通过选择性剪切或者干扰基因表达从而发挥调控作用。H19在多种实体瘤组织中呈现异常状态，如胆囊癌[12]、结肠癌[13]、肺癌[14]等，并在肿瘤的形成过程中发挥重要作用。H19在食管癌组织中表达量显著增加，并与食管壁的转移、浸润程度显著相关[15]。检测肺癌组织和细胞系中H19的表达量，发现H19靶向调控miR-107进而影响Notch信号通路，在肺癌细胞的侵袭和迁移过程中起重要作用[16]。miRNA介导机体蛋白部分功能，通过激活不同的下游靶基因，对口腔癌细胞的生物学行为起调控作用[17]。H19的表达水平与细胞的侵袭、迁移能力密切相关[18]–[19]。考虑到H19可能参与肿瘤细胞侵袭、迁移等生物学过程，因此本实验对H19在口腔癌细胞中的具体作用进行研究。本研究发现，H19在口腔癌细胞系CAL27中显著高表达，下调H19的表达可显著抑制口腔癌CAL27细胞的侵袭、迁移能力；H19与miR-107之间具有相互作用，miR-107通过逆向调控H19的表达，对口腔癌细胞的侵袭、迁移进行靶向调控；上调H19的表达可降低miR-107的表达，抑制CAL27细胞的侵袭、迁移，抑制miR-107的表达量可逆转H19对CAL27细胞的侵袭、迁移的作用。
细胞周期蛋白依赖性激酶（recombinant cyclin dependent kinases，CDKs）是细胞周期调控的关键因子，表达异常可促进癌症的发生发展[20]–[22]。CDK6是CDKs家族的重要成员之一，在多种肿瘤组织中表达异常，与肿瘤的发生发展密切相关[23]–[25]。本研究结果发现，miR-107与CDK6的3′-UTR存在部分碱基互补配对序列，推测miR-107可能对CDK6有一定的调控作用，双荧光素酶报告基因结果进一步证实miR-107可靶向作用于CDK6；qPCR检测发现CDK6在口腔癌细胞系CAL27中显著高表达；上调或下调miR-107的表达量可以显著影响CDK6水平。共转染pcDNA H19和miR-107 mimics质粒可逆转过表达miR-107对双荧光素酶活性的抑制作用以及过表达H19对CAL27细胞中CDK6蛋白表达量的促进作用；共转染siRNA H19和anti-miR-107可显著逆转siRNA H19下调CDK6蛋白表达量的作用。以上结果均表明H19和miR-107可共同调控CDK6的表达，从而调控口腔癌发生发展过程。
综上，本实验阐明了H19在口腔癌发生发展中的作用，其通过miR-107/CDK6信号轴调控细胞的侵袭、迁移过程，从而调节口腔癌的形成。这可为口腔癌的早期诊断和临床靶向治疗提供一定的参考意见，但本实验只在细胞系中进行了相关探究，今后尚需在动物模型以及人体肿瘤中深入研究。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金（81402231）；河南省自然科学基金（182300410319）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81402231); The National Natural Science Foundation of Henan Province (182300410319).
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