3D打印多孔钽种植体对骨整合影响的实验研究

Abstract

目的

研究多孔钽及多孔钛种植体对骨整合的影响。

方法

通过计算机辅助设计方法建模，采用3D打印技术制备两种微孔参数相同的多孔材料种植体：多孔钽及多孔钛。在24只新西兰大白兔双侧股骨外踝处建立骨缺损模型，每只动物左右侧缺损随机分组，分别用多孔钽（实验组）和多孔钛（对照组）种植体进行修复。种植体植入后2、4、8周取材，进行大体观察和亚甲基蓝-酸性品红染色，观测种植体和骨界面的骨整合情况，采用推出实验测试种植体-骨界面结合强度。

结果

术后2、4、8周，两组材料界面的新生骨组织逐渐增加，出现新生骨小梁并向材料孔隙内生长；两组的成骨情况及种植体-骨组织界面结合强度的差异无统计学意义（P>0.05）。

结论

3D打印的多孔钽能与骨组织形成早期的生物结合，具有与多孔钛相当的骨整合能力。

目前广泛使用的致密型种植体的弹性模量明显高于人体骨组织，植入后可产生应力屏蔽和应力集中，引发种植体周围骨组织的退化和吸收，甚至导致种植体松动。为了促进骨整合，降低弹性模量，消除应力屏蔽，骨内植入物通常采用多孔型表层，使其具备良好的骨传导性，从而诱使骨长入以达到生物固定，保证植入物的长期稳定[1]–[3]。

目前骨内植入物的多孔表层常采用两种多孔金属材料：多孔钛和多孔钽，其中多孔钛一般采用喷珠、粉末等工艺加工，而多孔钽则采用气相沉积法或粉末冶金工艺加工[3]–[5]。体外研究发现，与多孔钛比较，骨髓间充质干细胞在多孔钽上生长的细胞黏附及增殖能力更强，且成骨相关指标，如碱性磷酸酶和成骨相关转录因子2表达水平更高[6]。由于多孔钛和多孔钽的加工工艺不同，很难保证两种多孔材料在具备相同的微孔结构参数（孔隙率、孔径、丝径、孔型、空间排列）的条件下，对二者的骨长入及骨整合性能进行对比研究。近年来，随着3D打印技术的日益成熟，可以对多孔钛和多孔钽的微孔构型进行精确控制，达到在相同的设计构型基础上制备多孔材料，实现在微孔结构参数基本相同的情况下对二者进行对比。

本研究的目的是基于3D打印技术制备出多孔钽及多孔钛植入试样，通过植入兔股骨外踝骨缺损模型，探讨在相同微孔结构参数下多孔钛和多孔钽的骨长入及骨整合能力，为新型多孔植入物的研究应用提供理论基础。

1. 材料和方法

1.1. 实验动物

选用6月龄健康成年新西兰大耳白兔作为实验动物，雌雄不限，体质量2.5~3.5 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供，饲养在重庆医科大学附属口腔医院重点实验室动物房。实验方案得到重庆医科大学动物伦理委员会批准，所有动物均按照国家动物实验室的指导和使用准则进行管理。

1.2. 主要仪器和试剂

S-3000N型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；日本日立公司），C-SAILOR牙科种植机（COXO公司，中国广东佛山宇森医疗器械有限公司），E300CP/400CS硬组织切磨系统（EXAKT Vertriebs GmH公司，德国），TCS.SP8激光扫描共聚焦显微镜（Leica公司，德国），C43.104电子万能试验机（MTS型，中国深圳美特斯公司）。戊巴比妥钠、亚甲基蓝、酸性品红（Sigma公司，美国）。

1.3. 多孔种植体的设计和制作

采用计算机辅助设计（computer aided design，CAD）建模设计出直径4.8 mm、长8 mm、孔径400 µm、孔隙率为70%的圆柱体，通过3D打印技术制备出多孔钛及多孔钽种植体（株洲普林特增材制造有限公司制作，图1），分别在蒸馏水、丙酮溶液及70%乙醇溶液中超声清洗30 min，经蒸馏水清洗、高压蒸汽灭菌后备用。

图 1. 多孔钛（左）与多孔钽（右）的大体观察.

Fig 1 Sketch map of the appearance of the porous titanium (left) and porous tantalum (right)

1.4. 实验分组及方法

于实验动物左右侧股骨外踝处制备骨缺损，每只动物的左右侧随机分为两组，分别植入多孔钽（实验组）和多孔钛（对照组）各1枚，共植入48枚种植体，即实验组24枚，对照组24枚。将24只新西兰兔按时间节点分为3组，分别为 2 周、4 周和 8 周组，2周组和4周组各包括6只动物，8周组包括12只动物，其中 6只用于推出试验，6只用于组织学检测。

骨缺损及种植手术的具体方法如下。采用3%戊巴比妥钠按1 mL·kg⁻¹的剂量行耳缘静脉全身麻醉，麻醉显效后双下肢股骨外踝周围备皮，按照无菌手术操作规范，术区1%聚维酮碘消毒，常规铺巾。取股骨外髁处做纵行切口，长约2 cm，切开皮肤，逐层分离皮下组织、肌肉至骨膜，剥离骨膜，暴露两侧股骨外髁。用牙科钻在股骨髁中心距远端关节面 4 mm处钻出深度为8 mm、直径4.8 mm的圆柱体骨缺损空腔（图2）。按照实验分组，在兔双侧股骨外踝缺损处分别植入直径4.8 mm、长8 mm的多孔钽和多孔钛。再次冲洗后，逐层缝合伤口，术后给予青霉素80万U肌肉注射，每日1次，连续5 d，以预防术区感染。常规条件下饲养观察，密切观察术后有无伤口感染。术后10 d，拆除创口缝线。每组实验动物分别于术后2、4、8周采用耳缘静脉空气栓塞法处死，取双侧股骨标本进行检测。

图 2. 制备兔股骨外踝缺损模型.

Fig 2 Rabbit femoral lateral malleolus bone defect model

1.5. 观测指标

1.5.1. 种植体表面形貌观察

种植体植入前，采用SEM观察种植体表面形貌，比较两种材料表面形貌的差异。

1.5.2. 种植体力学性能测试

采用电子万能试验机测定多孔钛和多孔钽的抗压强度，并根据测得的结果计算出相应的弹性模量，用于力学测试的样本数均为3个平行样本。

1.5.3. 大体观察

肉眼观察术后各时间点两组材料与宿主的骨结合情况。

1.5.4. 组织形态学观察

术后各时间点处死动物6只，将取得的股骨标本，经固定、脱水、渗透、包埋、切片，将材料完整暴露的平面行亚甲基蓝-酸性品红染色，在光学显微镜下观察新生骨组织形成和植入材料周围成骨情况。骨长入面积率定义为：骨长入的实际面积与多孔材料中能提供给组织长入的孔的总面积之比。每张切片随机选定2个视野，该视野内骨组织长入最深处到种植体界面的垂直距离，即骨长入深度。本实验利用Image-Pro Plus 6.0软件计算染色切片的骨长入面积率及骨长入深度。

1.5.5. 种植体-骨界面结合强度

采用推出法测试种植体与骨组织之间的结合强度。术后8周每组处死动物6只，用金刚砂片将含有样品的骨截断，在电子万能试验机上进行推出实验，加载速率为0.5 mm·min⁻¹，以最大推出力表示样品与周围组织之间的结合强度。

1.6. 统计学分析

采用 SPSS 17.0 统计软件，计量结果以算术平均数±标准差表示，采用t检验进行统计学检验，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. 材料外观结构及形态特征

多孔钛、多孔钽表面及断面可见分布均匀的呈立体连通的蜂窝状微孔结构，且微孔的孔隙间相互连通，多孔钛表面较多孔钽光滑（图3）。

图 3. 多孔钛（左）和多孔钽（右）的表面形貌 SEM.

Fig 3 Surface topography of the porous titanium (left) and porous tantalum (right) SEM

上：× 30；下：× 150。

2.2. 力学性能测试结果

力学性能测试结果显示：多孔钛与多孔钽抗压强度分别为（395.60±0.80） 、（138.10±6.88） MPa；弹性模量分别为（5.454±0.060）、（3.104±0.107）GPa，均小于皮质骨的数值，且多孔钽较多孔钛更小，其弹性模量较多孔钛更接近松质骨。

2.3. 大体观察

所有动物的手术顺利完成，于术后2 h内自然苏醒，术区伤口未见红肿、渗出等感染征象。术后6 d，实验动物基本恢复正常活动。在术后各观察时间点（2、4、8周），两组材料与周围骨组织结合良好，未见脱落、移位等现象（图4）。

图 4. 术后8周股骨标本大体观察.

Fig 4 Gross sample of bone defect repair in rabbit femur at postoperative 8 weeks

2.4. 组织学观察

亚甲基蓝-酸性品红染色（图5）显示，术后8周时两组材料与成熟骨组织紧密结合，骨组织相互连续。8周时多孔钛与多孔钽骨长入面积率分别为19.35%±2.35%和17.98%±1.81%，骨长入深度分别为51.59±1.68和49.25±0.85（单位为像素值）。经统计学分析，两组材料的骨长入面积率和骨长入深度无明显差异（P>0.05）。

图 5. 两组材料植入后8周的硬组织切片染色观察 亚甲基蓝-酸性品红染色 ×4.

Fig 5 Hard tissue observation of porous titanium-bone and porous tantalum-bone interface at 8 weeks after implantation methylene blue-acid fuchsin staining × 4

左：多孔钛；右：多孔钽。

2.5. 种植体-骨界面结合强度

推出实验结果显示，多孔钛与多孔钽两组样品的最大推出力平均值分别为（411.30±37.03）、（382.70±60.05）N，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3. 讨论

本研究中，多孔钛和多孔钽试样的微观多孔设计参数相同（丝径400 µm、孔径400 µm、孔隙率70%）。已有研究[7]证实，孔隙率、孔径和孔的互相联通是影响多孔种植体的力学性能和生物学性能的关键因素，因此，制造具有合适孔隙结构和力学性能的多孔材料非常重要。通常孔径在100~600 µm 时适合骨组织长入，当孔径大于200 µm时有利于毛细管组织和骨祖细胞迁移，有利于骨组织生成[8]。3D打印技术可以实现对多孔材料孔隙率、孔径等多孔参数的精密控制，使得多孔材料之间的对比保持参数的一致性[9]。

本研究对两组试件的微观多孔形态进行了观察，结果可见，多孔钛表面较多孔钽更为光滑（图3），原因在于钽的熔点过高（约2 996 °C），导致加工过程中存在未熔融的钽金属颗粒。Rønold等[10]发现，喷砂表面的粗糙度有利于骨组织在种植体表面的机械嵌合，提高植入初期的稳定性，有利于表面成骨细胞黏附、增殖和分化，更有利于骨形成。

生物力学研究通常认为“应力遮蔽”会导致骨吸收，对骨结合的远期效果会产生影响，当设计与制造种植体时，生物相容性和力学性能都应予以考虑[3],[11]。本研究力学测试结果显示，多孔钽和多孔钛的弹性模量分别为（3.104±0.107）、（5.454±0.060）GPa，介于松质骨和皮质骨之间，明显低于传统骨科植入材料钛合金（110 GPa），均接近人骨的弹性模量，这与国外学者[7]的实验结果相一致。但是多孔钽和多孔钛的弹性模量之间的差异有统计学意义，多孔钽的弹性模量更小，说明多孔钽较多孔钛可能更好地避免产生“应力遮蔽”，为骨组织提供有效的机械刺激[3],[12]。

鉴于体内实验可准确反映材料骨整合能力的真实状态，本研究通过动物股骨远端植入材料来探讨两组材料对骨整合的影响。硬组织切片经亚甲基蓝-酸性品红染色可以看出，试样的骨结合界面清晰，可见红色的骨组织，在种植体外侧的有可能是植入之前的成熟骨组织，而种植体空隙内部的是新长入的骨组织。多孔钛和多孔钽试样均获得了良好的骨长入组织学评估，分别为19.35%±2.35%和17.98%±1.81%，新生骨组织在两种种植体内部都分布均匀，这可能归因于孔隙之间有良好的互联互通，从而促进了周围骨组织的长入。

本实验利用推出实验对种植体与骨界面的骨结合强度进行评价。推出实验中，破坏均首先发生在种植体与骨之间的结合界面而非种植体本身。多孔钽与多孔钛的最大推出力分别为（382.70±60.05）和（411.30±37.03）N，二者无明显的差异，表明二者骨结合性能相当。在种植体中引入多孔结构后，新生的骨组织均能长入多孔种植体的孔隙内，从而使种植体和骨组织形成生物固定，并且多孔材料可以增加骨与种植体的接触面积，加上骨和多孔孔隙之间的机械嵌合作用，种植体和骨界面的剪切强度也相应地增加[13]–[14]。

多孔钽呈三维连通的立体微孔结构，使其具有弹性模量低、表面摩擦系数高等良好的物理特性。有研究[15]表明，在负载过程中，传统种植体可以吸收负载能量的30%，而多孔钽种植体可吸收50%~75%，因为较高的摩擦系数使其在植入过程中具有良好的初期稳定性，从而提高了种植手术的成功率。尽管多孔结构能有效降低种植体的弹性模量，但同时也降低了种植体的抗疲劳强度，使其较致密种植体更容易断裂，而且制备成型相对困难，如何在其中找到平衡仍需进一步继续研究。

综上所述，在本研究中多孔钛与多孔钽具备同样出色的骨长入和骨整合能力，但多孔钽的弹性模量更接近人骨，具备更好的生物力学适配性。本研究结果证实，至少在短期植入研究中，3D打印多孔钽试样的骨结合性能不弱于多孔钛试样，可为3D打印个性化植入物提供实验依据；但不可否认的是，多孔钽试样的生物力学性质更佳，接近人骨的弹性模量或许有利于其长期植入的稳定性，当然这还有待于更加深入的长期观察及疲劳试验等相关研究。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金青年科学基金（11402042）；重庆市基础与前沿研究计划（CSTC2015jcyjA10027）；重庆市科委社会民生一般项目（CSTC2015shmszx10008）；重庆市卫生计生委面上项目（2017MSXMD73）；2016年重庆高校创新团队建设计划（CXTDG201602006）

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