靶向舌癌多功能纳米粒的制备和体外实验

Abstract

目的

制备一种基质细胞衍生因子-1（SDF-1）修饰的载多西紫杉醇（DOC）包裹吲哚菁绿（ICG）和液态氟碳全氟己烷（PFH）靶向多功能纳米粒（DOC-SINPs），检测其性质。

方法

双乳化法制备纳米粒，硫醚键连接SDF-1，得到靶向纳米粒。Malvern粒径仪检测其粒径及表面电位，激光扫描共聚焦显微镜观察SDF-1在纳米粒表面的连接情况，高效液相色谱法（HPLC）测定其DOC包封率（ELC）和载药量（DLC）及体外释放规律，热成像仪记录其体外光热特性，光声仪及超声诊断仪观察其体外显像，流式细胞仪评估其体外靶向能力，CCK-8法检查其对舌癌SCC-15细胞活力的影响。

结果

靶向多功能纳米粒形态规则，呈球状。平均粒径（502.88±17.92） nm，平均电位（−11.5±3.15） mV。平均ELC为54.12%±1.74%，平均DLC为1.08 mg·mL⁻¹。体外药物释放规律呈初期爆发性释放，接着是持续缓慢释放。其光热特性呈浓度相关，浓度越高温度越高。纳米粒可检测到明显光声信号和超声信号。体外靶向连接率89.99%。细胞活性实验结果表明，SINPs组在各个浓度下细胞活性无明显差异（P>0.05）。在浓度为150、200 µg·mL⁻¹时，DOC-SINPs无论有无激光辐照均较SINPs有明显的细胞活性抑制（P<0.05）。

结论

成功制备了集诊断与治疗一体的多功能纳米粒，具有超声/光声双模成像，同时具备化疗和光热治疗的抗肿瘤作用。

口腔癌在世界常见癌症中排第11位，其中舌鳞状细胞癌占一半以上，位居口腔癌首位[1]–[2]。早期淋巴结转移是舌鳞状细胞癌的特点，使舌癌患者5年生存率低于50%[3]–[4]。及时治疗舌癌淋巴结转移成为提高生存率的迫切需求。

近年来，随着精准医疗理念的提出，结合诊断和治疗的多功能纳米复合材料越来越受到关注。其中包裹液态氟碳的多功能纳米粒，具有超声显像的功能，同时可载药或者基因等进行相关疾病治疗[5]–[8]。液态氟碳全氟己烷（perfluorohexane，PFH）是一种含氟脂肪族化合物，其具有较好的生物相容性，能弥散溶解于血脂，不参与体内生物化学降解，通过呼吸排出体外[9]。吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）是一种被广泛应用的近红外光荧光染料，美国食品和药品监督管理局批准用于临床显像和诊断[10]。光热治疗（photothermal therapy，PTT）是一种新的非侵入性癌症由无机纳米粒介导的治疗技术，其响应近红外光并将光能转化为热能[11]。ICG具有强烈的近红外吸光度和高光敏性、热转换效率等优势，同样被应用于PTT的研究中。聚乳酸-羟基乙酸共聚物 [poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]具备优异的生物相容性、可控生物降解性、良好的成球或成膜性能以及增加药物投递的功效优势[12]。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-deried factor 1，SDF-1）又名CXCL12，能与之结合并激活的受体为CXCR4，高表达于出现转移淋巴结（metastatic lymph node，MLN）的舌鳞状细胞癌细胞膜上[13]。多西紫杉醇（docetaxel，DOC）是一种紫杉烷类抗癌药物，目前已成为治疗几种最常见实体肿瘤的标准药物，同时在胃癌和头颈部肿瘤等的治疗上正显示巨大潜力[14]。

本研究主要目的是制备一种SDF-1修饰的载DOC包裹ICG和PFH靶向多功能纳米粒，检测其性质，为舌癌原发灶及其颈部淋巴道转移组织的无创早期诊断和非手术治疗提供一种潜在思路和手段。

1. 材料和方法

1.1. 材料

马来酰亚胺修饰的聚乙二醇（maleimide-modified polyethylene glycol，MAL-PEG）3500-OH（北京键凯科技有限公司）；PEG-PLGA12000（济南岱罡生物工程有限公司）；PFH、ICG、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）（Sigma公司，美国），DOC（江苏奥赛康药业股份有限公司），SDF-1（南京拓达生物科技有限公司），人舌鳞癌细胞株SCC-15（口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室保种）。

1.2. 主要仪器

FA1004N型电子分析天平（上海精科仪器有限公司），声震仪（Sonic公司，美国），低温高速离心机（Eppendorf公司，德国），倒置相差显微镜（Nikon公司，日本），光声仪（VisualSonics公司，加拿大），IU22型超声诊断仪（荷兰飞利浦公司）。

1.3. 方法

1.3.1. 联接SDF-1包裹PFH和ICG载DOC靶向高分子纳米粒制备

采用双乳化法制备SDF-1包裹PFH和ICG载DOC靶向高分子纳米粒。称取50 mg MAL-PEG-PLGA和10 mg DOC溶解于2 mL二氯甲烷中；称取3 mg ICG溶解于300 µL双蒸水中，加入100 µL PFH混合后进行声震1 min；将ICG和PFH声震后的乳液加入PLGA已经充分溶解的溶液中，声震4 min（On：5 s，Off：5 s）；取50 g·L⁻¹ PVA 10 mL加入上述溶液中，在高速均质机中均质1 min；再加入20 mL·L⁻¹异丙醇10 mL；放入磁珠，在冰浴环境下磁力搅拌2.5 h；2.5 h后用双蒸水进行离心、洗涤3次；得到沉淀物加入5 mL双蒸水稀释即得包裹PFH和ICG载DOC高分子纳米粒（DOC-INPs）。

SDF-1末端巯基化修饰，并标记异硫氰酸荧光素。马来酰亚胺基团修饰PEG-PLGA末端。依据文献[15]–[16]，SDF-1加入INPs中（SDF-1︰PEG-PLGA=1︰1）。120 r·min⁻¹ 低温摇动9~12 h。9 000 r·min⁻¹ 离心5 min，洗涤3次，制得DOC-SINPs。取少量样品，充分分散后分别进行光学显微镜观察和Malvern粒径检测，激光扫描共聚焦显微镜观察SDF-1连接形态。

1.3.2. 载药量（drug loading capacity，DLC）和包封率（encapsulation efficiency，ELC）测定

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）进行检测，流动相乙腈-水溶液（50︰50），检查波长为232 nm。分别将标准样品稀释为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g·L⁻¹，每次进样10 µL，流速为1 mL·min⁻¹，柱温25 °C，以峰面积值（X）对质量浓度（Y）进行线性回归，得出DOC的线性回归方程。DOC-SINPs样品加入2.5 mL乙腈溶解破坏后，加入双蒸水稀释至5 mL，充分超声促释后过0.45 µm过滤膜，得到待测溶液。取10 µL待测溶液进样，记录峰面积并计算浓度，计算所测DOC-SINPs样品药物的DLC和ELC。计算公式如下：DLC（mg·mL⁻¹）=DOC-SINPs中总DOC的质量/DOC-SINPs总体积×100%；ELC=DOC-SINPs中总DOC的质量/总DOC投放量×100%。

1.3.3. 药物释放

取2份DOC-SINPs样品分别加入10 mL水溶液中，充分分散后装入透析袋中。选其一行808 nm激光仪辐照6 min（1.5 w·cm⁻²），为辐照组；另一组不予处理，为非辐照组。之后分别放入含有200 mL水溶液容量瓶中，避光，60 r·min⁻¹恒温摇动，分别在预定的时间收集样品液，每次取出介质中1 mL溶液，同时补充1 mL的释放介质。收集的样品经0.45 µm过滤膜后进HPLC，测定释放药物含量。DOC释放比例计算公式如下：DOC释放比例=[C_iV+V_o(C_i-1+C_i-2+...+C₁)]/W×100%，C_i代表第i次取出样品的浓度，V代表总的释放介质体积，V_o代表样品的体积，W代表透析袋中DOC的总质量。

1.3.4. 体外光热实验

准备不同DOC浓度的DOC-SINPs样品（0、50、100、150、200 µg·mL⁻¹），分别取100 µL放入96孔板内，808 nm激光仪辐照5 min（1.5 w·cm⁻²），使用Fortic热成像仪记录并分析。

1.3.5. 体外成像实验

将DOC-SINPs纳米粒以双蒸水稀释后置入凝胶孔洞模型，通过光声成像仪，采用680~900 nm波长脉冲激光辐照10 s，选择最适波长。然后将DOC-SINPs按浓度（5、10、25、50 mg·mL⁻¹）分4组，在最适波长下通过光声仪采集光声及超声信号。使用超声诊断仪，记录DOC-SINPs在808 nm激光仪辐照30 s前后超声影像及增强影像。

1.3.6. 体外靶向实验

取舌癌SCC-15细胞接种于6孔板中，DEME/F12培养基，细胞孵箱内培养。预设两组：靶向组和空白对照组。待6孔板中细胞铺满80%后，更换孔内培养基，靶向组加入预先配置200 µg·mL⁻¹ SINPs纳米粒2 mL；空白对照组加入正常培养基2 mL。常规孵育1~2 h后，PBS冲洗3次，激光扫描共聚焦显微镜观察靶向情况。经0.25%胰酶消化5 min，1 000 r·min⁻¹离心3 min，得到沉淀加入1 mL PBS重悬，进行流式细胞仪检测。

1.3.7. 体外细胞活力检测

用CCK-8法检测评估SINPs纳米粒对舌癌SCC-15细胞的活力。取舌癌SCC-15细胞接种于96孔板中，每孔200 µL（每毫升1×10⁵细胞），常规孵育24 h。预设4组：DOC-SINPs+辐照组，DOC-SINPs+非辐照组，SINPs+辐照组，SINPs+非辐照组。将DOC-SINPs用培养介质稀释至DOC浓度为0、50、100、150、200 µg·mL⁻¹，SINPs组根据DOC-SINPs稀释方法稀释。去除培养基，加入预先稀释好的DOC-SINPs和SINPs 200 µL，其中辐照组在808 nm激光仪辐照6 min（1.5 w·cm⁻²），37 °C下孵育24 h。再去除培养基，每孔加入预先配置的培养基200 µL（CCK-8︰DEME/F12=1︰10），继续孵育4 h后，使用酶标仪在450 nm测各孔光密度（optical density，OD）值。相对细胞活力（%）计算公式如下：细胞活力（%）= OD_试样/OD_对照×100%。

1.4. 统计学方法

采用graphpad软件处理结果，多组比较采用两因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 高分子纳米粒DOC-SINPs的制备和基本特性

制备的联接SDF-1包裹PFH和ICG载DOC靶向高分子纳米粒DOC-SINPs形态规则，呈球状，大小均一。激光扫描共聚焦显微镜观察可见，SDF-1成功联接在PLGA壳上，纳米粒形态同光镜（图1）。Malvern粒径仪测得DOC-SINPs的平均粒径为（502.88±17.92） nm，平均电位为（−11.5±3.15） mV（图1）。

图 1. DOC-SINPs的基本特性.

Fig 1 Basic characteristics of DOC-SINPs

a1：光镜 × 400；a2：激光扫描共聚焦显微镜 × 400；b1：DOC-SINPs粒径分布图；b2：DOC-SINPs电位分布图。

2.2. DLC和ELC的测定

经计算，DOC-SINPs的ELC为54.12%±1.74%，DLC为1.08 mg·mL⁻¹（图2）。

图 2. DOC-SINPs的HPLC检测.

Fig 2 HPLC chromatograms of DOC-SINPs

2.3. DOC-SINPs中DOC的释放

DOC-SINPs辐照组和非辐照组DOC释放见图3。

图 3. DOC-SINPs在激光辐照或非辐照条件下DOC的释放曲线.

Fig 3 Release curves of DOC under laser irradiation or non-irradiation

48 h时，辐照组DOC释放率约80%，明显高于非辐照组。考虑DOC-SINPs在激光照射后纳米粒快速发生相变，而非辐照组在常温下相变缓慢。DOC-SINPs的释放特点是初期爆发性释放，接着持续缓慢释放。

2.4. 体外光热实验

Fortic热成像仪记录结果见图4。DOC-SINPs的温度随着浓度增加而增高。并且在浓度为200 µg·mL⁻¹时温度达到了50 °C以上，这是杀死肿瘤细胞所需要的温度[17]。浓度为50 µg·mL⁻¹的DOC-SINPs温度呈现先增高后降低的趋势，考虑ICG在激光照射时发生光热转换的同时也发生淬灭[10]，当ICG淬灭完全后光热转换也将停止，从而温度开始下降。

图 4. 不同浓度DOC-SINPs的温度曲线图.

Fig 4 Temperature curves of DOC-SINPs with different concentrations

2.5. 体外成像实验

DOC-SINPs在光声仪下显像见图5。由图5可见，随着DOC-SINPs浓度增加，光声信号及超声信号均增强。DOC-SINPs在激光辐照前二维超声影像及增强影像不明显，激光辐照后均增强。

图 5. 不同浓度DOC-SINPs的光声和超声信号.

Fig 5 Photoacoustic and ultrasonic signals of DOC-SINPs with different concentrations

a：DOC-SINPs不同浓度光声成像图（左为超声信号，右为光声信号）；b1、b2：分别为DOC-SINPs激光辐照前后超声二维成像及增强。

2.6. 体外靶向实验

激光扫描共聚焦显微镜观察可见，靶向组舌癌SCC-15细胞周围分布绿色荧光（图6左）。流式细胞仪半定量结果示：靶向组为89.99%，非靶向组仅为2.06%（图6中、右）。

图 6. 流式细胞术及激光扫描共聚焦显微镜观察结果.

Fig 6 Observations of flow cytometry and laser scanning confocal microscopy image

左：标记FITC的DOC-SINPs聚集在细胞周围 激光扫描共聚焦显微镜 × 200；中：非靶向组流式细胞结果；右：靶向组流式细胞结果。

2.7. 体外细胞活力实验

通过CCK-8法评估了DOC-SINPs在0~200 µg·mL⁻¹对舌癌SCC-15细胞活力的影响（图7）。

图 7. 不同浓度DOC-SINPs和SINPs在激光辐照或非辐照条件下对体外SCC-15细胞活力的影响.

Fig 7 The effects of DOC-SINPs and SINPs of different concentrations on the viability of SCC-15 cells under laser irradiation or non-irradiation in vitro

由图7可见，SINPs组在0~200 µg·mL⁻¹对舌癌SCC-15细胞的细胞活性无明显影响，差异无统计学意义（P>0.05）。在浓度为150、200 µg·mL⁻¹时，SINPs组与DOC-SINPs组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05）；SNPs组与SINPs+激光组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05）；DOC-SINPs组与DOC-SINPs+激光组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05）。这些结果表明DOC-SINPs在激光辐照下具备化学/光热抗肿瘤作用。

3. 讨论

本实验以PLGA纳米粒为载体，PLGA具有丰富的功能基团，其可促进基于PLGA的纳米粒与生物分子的进一步功能化，并且可以改善纳米粒的稳定性和功能性。根据亲水亲脂的性质，将ICG和PFH包裹在PLGA壳内，DOC嵌合在壳表面；体外合成活性SDF-1通过硫醚键连接到PLGA外壳表面，制备了多功能DOC-SINPs纳米粒。其粒径为（502.88±17.92） nm，而肿瘤微血管内皮间隙为300~780 nm，有的可达2 µm[18]，允许DOC-SINPs进入肿瘤微血管环境。与肿瘤组织相反，正常组织血管内皮有紧密的连接，不允许纳米粒外渗。除了血管通透性增强外，肿瘤淋巴液引流不良，从而有利于外渗到肿瘤组织中的纳米粒得以长时间保留[19]。

光敏材料在医学研究中有广泛的应用，Mu等[20]制备了Fe₃O₄纳米粒；Nguyen等[21]制备了聚苯胺纳米粒，其中Fe₃O₄可作为光敏材料，通过纳米粒装载化疗药物成功制备出具有化学-光热治疗作用的多功能纳米粒，应用前景巨大。ICG是光敏材料的一种，在808 nm激光仪辐照下发生光热转换。PFH是一种液态氟碳，常温下以液态形式存在，当温度升高其会由液态变为气态，即液气相变。当用激光辐照时，ICG发生光热转换，使温度上升，从而导致PFH发生液气相变，粒径增加，声阻抗增加，能进行超声成像；又因为其内包裹的ICG属光声材料，同时也可以进行光声成像。由于DOC在水中的溶解度非常小（约10 mg·L⁻¹ ），临床上使用的注射剂泰素帝中含有大量吐温80，其具有溶血性且黏性大，导致大多数患者产生明显的过敏反应[22]。本实验中激光辐照组DOC的释放比未辐照组释放快且多，正是纳米粒激光触发液气相变的特点，加快DOC从PLGA壳上释放，该特性有利于DOC-SINPs定向定点释放达到治疗作用的同时也改变了DOC的使用方式，减少化疗药物对全身的不良反应。

口腔鳞状细胞癌的增殖、侵袭及转移与CXCR4/SDF-1通路有着密切关联，CXCL12及其受体的相互作用随后激发下游信号传导途径以影响肿瘤血管生成，肿瘤细胞增殖和化学抗性，因此代表癌症治疗的潜在目标[23]。Chittasupho等[24]和Mei等[25]将CXCR4作为载体的靶向点，表现出高亲和性。本实验通过硫醚键将SDF-1连接到PLGA壳表面，制备了靶向舌鳞癌细胞的DOC-SINPs。体外靶向实验验证了其较高的靶向能力。更重要的是当靶向纳米粒上的SDF-1与CXCR4结合，可以拮抗生物自身CXCR4/SDF-1作用引起的促肿瘤作用；SDF-1的主动靶向作用有利于纳米粒在肿瘤组织长时间停留，在激光局部定点辐照下药物快速释放，增高局部药物浓度，达到低全身不良反应的化疗效果。但是，SDF-1作为生理和病理过程中的重要因子，包括胚胎发育、造血、血管生成和炎症，在体内也有表达[26]。本研究制备的SDF-1纳米粒能否达到预期的靶向效果需要进一步的动物实验予以说明。

随着医学影像技术的快速发展，超声、CT、X射线、MRI等已经得到普遍应用。影像技术能对病灶器官及组织分子显像和功能显像，得到病理信息，从而达到对疾病的早期诊断。然而目前临床上应用的影像技术均具有局限性，两种及以上的影像技术联合诊断，可以提高诊断的准确性。光声显像是一种新的生物医学显像模式，该技术结合了光学和声学的优点，提高了传统超声的空间分辨率。在DOC-SINPs纳米粒体外成像实验中，ICG表现出了优良的光声成像信号。体现了DOC-SINPs纳米粒具备光声及超声双模成像的特点。

通过CCK-8法检测了DOC-SINPs对舌癌SCC-15细胞活性的影响。SINPs组在各个浓度下细胞活性无明显差异（P>0.05），证实了该纳米粒的低或无细胞毒性。在150、200 µg·mL⁻¹组，SINPs组与DOC-SINPs组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05），表明SINPs与DOC-SINPs在等效浓度下DOC体现出化学治疗的作用；SNPs组与SINPs+激光组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05），DOC-SINPs组与DOC-SINPs+激光组细胞活性差异有统计学意义（P<0.05），表明在150、200 µg·mL⁻¹时，光热治疗作用也存在。

纳米粒制备采用了双乳化法，该制备过程受诸多因素影响，本实验制备的DOC-SINPs，相比于Li等[27]制备的高分子载紫杉醇纳米微球ELC（96.20%±0.14%），ELC和DLC均较低。所以对DOC-SINPs的制备方案有待进一步优化。

综上所述，本实验成功制备了集诊断与治疗一体的多功能纳米粒。通过体外研究初步探讨了其理化性质；通过细胞活性实验证实其具备化疗和光热治疗的抗肿瘤作用，为后续的体内实验奠定基础。

Funding Statement

[基金项目] 重庆市社会民生科技创新专项项目（cstc2016shmszx00010）；2016年重庆高校创新团队建设计划资助项目（CXTDG201602006）；重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室资助项目[渝教科（2014）55号]

Supported by: Chongqing Science and Technology Innovation Projects of Social Livelihood (cstc2016shmszx00010); Program for Innovation Team Building at Institutions of Higher Education in Chongqing in 2016(CXTDG201602006); Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education [(2014)55].