肿瘤坏死因子-α对牙周膜干细胞骨向分化及Notch信号通路的影响

Abstract

Objective

To evaluate the effects of tumor necrosis factor-α (TNF-α) on osteogenic differentiation and Notch signaling pathway of periodontal ligament stem cells (PDLSCs) and to investigate the regulatory role of Notch signaling pathway on the osteogenic differentiation of PDLSCs under the influence of TNF-α.

Methods

PDLSCs were obtained through enzyme digestion and tissue block method. The expression levels of stem cell surface markers CD105, CD90, CD146, CD45, and CD31 were detected by fluorescence activated cell sorter (FACS). PDLSCs were divided into experimental (10 ng·mL⁻¹ TNF-α) and control groups (0 ng·mL⁻¹ TNF-α). The proliferation ability of PDLSCs was detected using cell counting kit-8 (CCK-8). The effect of TNF-α on the osteogenic ability of PDLSCs were tested by measuring alkaline phosphatase (ALP) activity and conducting alizarin red staining and quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). We tested Notch signal pathway receptors Notch1, Notch2, ligand JAG1, JGA2, and downstream gene Hes-1. Changes in DLL1 expression were detected by quantitative real-time PCR.

Results

FACS profiling showed that PDLSCs were strongly positive for CD105, CD90, and CD146 but negative for CD45 and CD31. CCK-8 results showed that TNF-α could promote the proliferation of PDLSCs (P<0.05). ALP activity in the experimental group was lower than that in the control group (P<0.05). Alizarin red staining showed that the experimental group had decreased mineralized nodules as compared with the control group. Quantitative real-time PCR results showed that the mRNA expression of osteogenic marker genes cementum attachment protein (CAP), osteopontin (OPN), and Runt-related transcription factor 2 (Runx2) significantly decreased in the experimental group as compared with those in the control group (P<0.05). The expression levels of Notch1, Notch2, JAG1, JGA2 and Hes-1 were significantly decreased (P<0.05), whereas those of Notch3 and DLL1 were increased in Notch signaling pathway-related molecules (P<0.05).

Conclusion

TNF-α can promote PDLSCs proliferation and inhibit bone differentiation and Notch signaling pathway expression, indicating that the Notch signaling pathway regulates PDLSCs osteogenic differentiation.

牙周病是口腔最常见的炎症性疾病之一，其牙周组织丧失的不可逆性成为临床治疗的难点。牙周病的治疗核心是修复牙周缺损的骨质，在骨质缺损的修复中需要干细胞的增殖与分化，尤其是牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）在这一过程中扮演着重要角色[1]–[2]，这一过程不仅受到多种炎性因子影响[3]，同时还受到干细胞内部错综复杂信号通路的调控[4]，其中Notch信号通路几乎参与所有细胞的增殖、分化活动，通过相邻细胞间的相互作用来调控与细胞增殖以及分化相关的基因表达，从而精确调控各谱系细胞的增殖与分化[5]，在骨的形成和改建过程中发挥了重要作用[6]–[7]。炎症因子会影响Notch信号通路在成骨分化过程中的表达，进而影响骨组织的再生，但其具体分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）对PDLSCs成骨能力以及骨向分化过程中Notch信号通路表达变化的影响。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

胎牛血清、α-MEM、PBS、青霉素链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、谷氨酰胺（HyClone公司，美国），Ⅰ型胶原酶（Worthington公司，美国），维生素C、β-甘油磷酸钠、地塞米松、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、茜素红粉剂（Sigma公司，美国），CCK-8试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），流式抗体CD105、CD90、CD146、CD45（eBioscience公司，美国），TNF-α（Peprotech公司，美国），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）测试盒（南京建成生物工程研究所），逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Thermo公司，美国），荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司，美国），正置显微镜、倒置显微镜（莱卡公司，德国），电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）。

1.2. 细胞的分离和培养

样本来自于新疆医科大学第二附属医院口腔科门诊，取样前均取得患者的知情同意，将12~25岁患者因正畸拔除的前磨牙拔除后立即放入含3倍双抗的细胞培养液中，转移至超净工作台后由冠向根刮取根中1/3牙周膜，将组织块修剪为1 mm³大小。1 000 r·min⁻¹离心5 min，Ⅰ型胶原酶（3 mg·mL⁻¹）消化15 min后，加入等量培养液（含10%胎牛血清，2 mmol·L⁻¹谷氨酰胺，100 U·mL⁻¹青霉素/链霉素的α-MEM）终止消化，离心，弃上清液加入适量培养液，接种于培养皿中，于37 °C、5%CO₂、饱和湿度条件下培养3~8 d，直至有细胞从组织块爬出并汇合80%~90%时用胰酶消化传代，标记为第一代，按照1︰2比例常规传代，取第3~5代细胞用于实验。

1.3. PDLSCs的鉴定

取第4代的PDLSCs，PBS冲洗2~3次，胰酶消化，离心，用含2%胎牛血清的PBS重悬，调整细胞密度为每毫升2×10⁶个，分别加入鼠抗人PE标记CD105、CD146，FITC标记CD90，APC标记CD45、CD31的单抗，空白对照组不加，4 °C避光孵育20 min，流式细胞仪检测干细胞表面标记物。

1.4. CCK-8法测定细胞生长曲线

取第4代PDLSCs，调整细胞密度为每毫升5×10³个，接种于96孔板，每组设3个复孔，待细胞贴壁后，更换培养液，实验组为含10 ng·mL⁻¹ TNF-α培养液，对照组为不含TNF-α培养液。置于细胞培养孵箱培养24 h，加入CCK-8液，孵箱培养3 h，于酶标仪在波长490 nm检测光密度（optical density，OD）值，每天在同一时间点进行检测，连续7 d，重复3次。

1.5. PDLSCs骨向分化能力的测定

1.5.1. 茜素红染色观察矿化结节的形成

将第4代PDLSCs，以每毫升5×10⁴个的密度接种于6孔板中，用细胞培养液培养24 h后，换矿化诱导液（含10 nmol·L⁻¹地塞米松，100 mmol·L⁻¹β-甘油磷酸钠，5 mg·mL⁻¹维生素C，10%胎牛血清的α-MEM），实验组为含10 ng·mL⁻¹ TNF-α矿化诱导液，对照组为不含TNF-α矿化诱导液。显微镜下观察细胞复层生长并出现结节，14 d终止培养，多聚甲醛固定，冲洗，加入1%茜素红溶液1 mL染色15 min，冲洗，干燥，在倒置显微镜下观察矿化结节形成的情况。

1.5.2. ALP活性检测

将第4代PDLSCs接种于96孔板，实验组与对照组分别于1、3、5、7 d终止矿化，弃矿化液，加细胞裂解液于4 °C过夜，按ALP测试盒说明书规范操作，酶标仪在波长520 nm测定各孔OD值。

1.5.3. 实时定量PCR检测PDLSCs成骨标志基因的表达

收集成骨诱导14 d的实验组与对照组PDLSCs，用Trizol裂解并提取细胞总RNA，核酸定量仪测定浓度及纯度后，用逆转录试剂盒将所提取的RNA逆转录为cDNA，以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参照，采用Maxima SYBR Green荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR，分别检测牙骨质附着蛋白（cementum attachment protein，CAP）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）mRNA的表达。反应体系为25 µL，各引物序列见表1。反应条件为：95 °C预变性10 min，1个循环；95 °C（变性）15 s、60 °C（退火）30 s及72 °C（延伸）30 s ，40个循环。

表 1. 实时定量PCR目的基因的引物序列.

Tab 1 Primer sequences of PCR target genes in real time

基因	引物序列（5′—3′）
CAP	Forward：5CTGGCTCACCTTCTACGACA
	Reverse：TACCTCAAGCAAGGCAAATG
OPN	Forward：CATACAAGGCCATCCCCGTT
	Reverse：GGGTTTCAGCACTCTGGTCA
Runx-2	Forward：ATCTCCGCAGGTCACTACCA
	Reverse：TGTGCTGAAGAGGCTGTTTG
Notch1	Forward：ACCAATACAACCCTCTGCGG
	Reverse：GGCCCTGGTAGCTCATCATC
Notch2	Forward：GGGACCCTGTCATACCCTCT
	Reverse：GAGCCATGCTTACGCTTTCG
Notch3	Forward：CAACCTGGCAGGGAGTTTCA
	Reverse：TCAGGCACTCATCCACATCG
JAG1	Forward：TCACGGGAAGTGCAAGAGTC
	Reverse：GTTTCACAGTAGGCCCCCTC
JGA2	Forward：GCATCAACATCGACGAGTGC
	Reverse：GATCTCCCGAACCCGATCAC
DLL1	Forward：GCAGCTCTTCACCCTGTTCT
	Reverse：GGTGCAGGAGAAGTCGTTCA
Hes-1	Forward：ATGACAGTGAAGCACCTCCG
	Reverse：CGTTCATGCACTCGCTGAAG
GAPDH	Forward：TCAAGGCTGAGAACGGGAAG
	Reverse：TGGACTCCACGACGTACTCA

1.6. 实时定量PCR检测

实时定量PCR检测Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3；配体JAG1、JGA2、DLL1；细胞内效应分子Hes-1的表达。除引物及引物序列外，总RNA提取及检测、cDNA合成、实时定量PCR步骤同1.5.3，各引物序列见表1。

1.7. 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，两两比较采用独立样本t检验；设P<0.05有统计学意义。

2. 结果

2.1. 细胞原代分离培养

牙周膜组织块培养至第3天可见有细胞从组织边缘爬出（图1左），继续培养至第8天组织周围细胞汇合至80%~90%时，即可传代，细胞传至第3代时细胞轮廓清晰，形态单一，均呈长梭型，生长状态良好（图1右）。

图 1. PDLSCs原代（左）和第3代（右）细胞形态的观察结果 倒置显微镜 × 100.

Fig 1 Observation of original generation (left) and the third generation of PDLSCs (right) inverted microscope × 100

2.2. 流式细胞鉴定

流式细胞鉴定结果显示CD105和CD90阳性率为90%和95.6%，CD146阳性率为17%，CD31和CD45阳性率为0.6%和0.7%（图2）。

图 2. 流式细胞仪细胞表型鉴定.

Fig 2 Cell phenotype identification by fluorescence activated cell sorter

从左至右依次为CD31、CD105、CD45、CD90、CD146、BLANK流式细胞结果。

2.3. 实验组和对照组细胞增殖能力比较

连续7 d的CCK-8实验结果见图3。细胞经历了潜伏期（1~2 d）、快速生长期（3~5 d，细胞数量呈对数增长）、缓慢生长期（6~7 d细胞增长缓慢，至第8天停止增殖）。实验组PDLSCs增殖速度在第3~6天明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。

图 3. 对照组与实验组PDLSCs的生长曲线比较.

Fig 3 Comparison of the growth curves of PDLSCs in the control group and the experimental group

2.4. 实验组与对照组骨向分化能力比较

2.4.1. PDLSCs成骨诱导后茜素红染色结果

成骨诱导液连续培养21 d后，茜素红染色显示实验组与对照组均有矿化结节生成，与实验组相比，对照组矿化结节染色较深、数量多且形成的范围较广泛，而实验组结节染色浅、数量少且范围较小（图4）。

图 4. 对照组（左）和实验组（右）PDLSCs茜素红染色结果 茜素红染色 × 100.

Fig 4 Alizarin red staining results of PDLSCs in the control group (left) and the experimental group (right) alizarin red staining × 100

2.4.2. ALP活性检测结果

实验组和对照组分别于1、3、5、7 d终止矿化，分别检测ALP活性，结果见图5。由图5可见，实验组和对照组ALP活性均逐渐增加，且实验组ALP表达明显低于对照组（P<0.05）。

图 5. 对照组和实验组PDLSCs的ALP活性比较.

Fig 5 Comparison of ALP activity of PDLSCs in the control group and the experimental group

2.4.3. 成骨基因表达情况

成骨诱导液连续培养14 d后，实时定量PCR检测实验组和对照组PDLSCs成骨基因CAP、OPN、Runx2的表达，结果见图6。由图6可见，与对照组相比，实验组CAP、OPN、Runx2表达量明显降低（P<0.05）。

图 6. 对照组和实验组PDLSCs成骨基因的表达.

Fig 6 Expression of osteogenic gene in the control group and the experimental group

2.5. Notch信号通路相关基因实时定量PCR结果

实时定量PCR检测成骨诱导液连续培养14 d，Notch信号通路受体Notch1、Notch2、Notch3；配体JAG1、JGA2、DLL1；细胞内效应分子Hes-1的表达水平，结果见图7。由图7可见，与对照组相比，实验组Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平明显降低，而Notch3、DLL1的表达水平增高，且差异有统计学意义（P<0.05）。

图 7. 实验组和对照组Notch信号通路相关基因表达.

Fig 7 Expression of Notch signaling pathway related molecules gene in the control group and the experimental group

3. 讨论

当发生牙周炎时，PDLSCs会暴露于炎性环境中，微环境的改变直接影响干细胞的功能，其中包含以TNF-α为主的多种炎性因子。研究[8]表明炎性因子的刺激会改变干细胞的生物学特性，而导致成骨能力的下降，影响骨组织的再生。有研究[7]报道在牙槽骨修复缺损过程中Notch信号也起到重要作用，但其具体作用和分子机制可能与种属、组织特异性有关。本课题组前期研究[9]发现Notch信号相关分子在正常和炎症来源的PDLSCs中的表达具有显著差异，但对于其是否对PDLSCs的成骨分化具有抑制作用，是否参与了牙周病慢性炎症的发生发展过程，以及具体的信号调控机制尚不明确，还有待进一步研究。

本实验通过体外培养人PDLSCs，流式细胞仪结果显示CD105、CD90和CD146表达阳性，证实其为间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）。Paula-Silva等[10]研究表明TNF-α促进牙髓细胞的增殖，且10 ng·mL⁻¹为最适浓度。袁萍等[11]研究也表明TNF-α可促进PDLSCs的增殖，且10 ng·mL⁻¹的促进作用最为明显。本研究通过CCK-8法检测TNF-α对细胞增殖能力的影响，结果与以上研究基本一致，即10 ng·mL⁻¹ TNF-α能促进PDLSCs增殖。另外TNF-α能直接或间接地导致牙槽骨吸收，是牙周病的主要特异性致病因子，与牙周炎的病程发展密切相关[12]–[13]。Kotake等[14]研究证明，TNF-α能抑制成骨细胞分化及矿化结节的形成。黄海云[15]研究发现TNF-α可以使MSCs成骨分化功能受到抑制。本研究结果也显示TNF-α可抑制PDLSCs矿化结节的形成，抑制ALP活性，同时抑制成骨相关基因的表达，说明在炎症因子影响下PDLSCs的生物学特性发生了改变，证实炎症因子TNF-α是导致牙周病骨缺损的重要影响因素。

在牙周组织中，Notch信号通路对其修复及改建起着重要作用，Park等[16]在大鼠牙髓和牙周韧带组织联合损伤模型中，提示Notch信号在牙源性细胞体外矿化和牙髓、牙周韧带组织损伤修复过程中被激活。同时Notch信号通路也是调控干细胞骨分化的重要因素，在体外培养的骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）中，激活Notch通路可以促进人BMSCs成骨分化[17]。Na等[18]用蛋白酶抑制Notch通路，结果发现脐带MSCs成骨能力下降。本研究采用实时定量PCR检测TNF-α对PDLSCs成骨过程中Notch信号通路相关分子表达的影响，结果显示，实验组Notch1、Notch2、JAG1、JGA2、Hes-1的表达水平较对照组显著降低，说明TNF-α能够抑制Notch信号通路相关分子的表达，从而抑制PDLSCs骨向分化。但实验组Notch3、DLL1的表达水平却显著高于对照组，Yang等[19]研究发现Notch3表达升高可能会抑制成骨细胞前体细胞的分化能力。研究[20]发现DLL1无论在体内、体外都能促进骨形态发生蛋白9诱导的MSCs成骨分化，并且激活Notch信号通路后DLL1表达增加最明显。另有研究[21]发现DLL1对大鼠牙髓干细胞中Notch1及Notch2的表达有反馈调节作用。Notch受体在相同的细胞或同一个体在不同的细胞中，表达是不同的，且各自作用也不尽相同。因此针对本实验这一结论是否与干预因子TNF-α或是与种属及组织特异性有关，仍需进一步探讨。

本研究通过体外培养人PDLSCs，研究TNF-α对PDLSCs增殖以及成骨分化能力的影响，结果表明10 ng·mL⁻¹ TNF-α可促进PDLSCs的增殖能力，但同时会抑制其骨向分化能力。同时探讨了炎症因子TNF-α与Notch信号通路的相互作用，为进一步阐明牙槽骨缺损修复的分子机制提供新线索，为临床治疗牙槽骨缺损寻找潜在靶点，并提供理论依据。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81460103）；新疆医科大学研究生创新创业项目（CXCY2017044）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81460103); The Innovative and Entrepreneurial Project of Graduate Students of Xinjiang Medical University (CXCY2017044).