氢气对脂多糖致人牙周膜细胞氧化应激损伤的保护作用

Abstract

目的

研究培养基中加入氢气能否对人牙周膜细胞（hPDLCs）在脂多糖（LPS）刺激下起到保护作用，降低氧化应激损伤，减少细胞凋亡。

方法

用1 µg·mL⁻¹ LPS刺激hPDLCs，分别用普通和富氢培养基培养，检测2组细胞的增殖，凋亡和细胞上清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）水平。

结果

在LPS刺激下，富氢培养基组细胞增殖活性显著高于普通培养基组，凋亡率降低（P<0.05）。2组间LDH释放量差异无统计学意义。6 h和12 h富氢培养基组细胞上清中CAT活性较普通培养基组显著升高（分别为P<0.05，P<0.01）；而2组的SOD水平在各个时间点均无统计学差异。6 h富氢培养基组细胞上清中MDA水平较普通培养基组显著降低（P<0.05）。

结论

氢气可有效改善LPS导致的hPDLCs增殖活性降低及凋亡，并可显著降低氧化应激损伤。

目前，牙周炎治疗主要是去除菌斑微生物等局部刺激，而宿主的免疫反应在阻止微生物入侵的同时损害局部牙周组织。中性多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）在控制牙周微生物入侵中发挥着非常重要的作用，是抗牙周致病菌的第一道防线。成熟的PMN受细菌及其产物脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）等的刺激，通过黏附贴壁和趋化等系列活动穿越血管内皮，到达炎症部位，吞噬细菌，然后通过“呼吸爆发”活动杀灭细菌，与此同时也产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），最主要的是超氧阴离子自由基（•O2）和羟自由基（OH•）[1]，其中羟自由基活性最强，破坏性最大[2]。ROS一方面可以直接杀灭微生物或者为相关酶类提供适宜杀菌的微环境，对于维持宿主健康有着重要的作用，但是同时促使脂质过氧化，破坏细胞膜结构，造成DNA损伤[3]。

ROS在牙周炎发病过程中起着非常重要的作用。牙周炎患者的ROS代谢物水平显著高于对照组，呈现较高的氧化应激状态[4]。已有多个研究[5]–[7]尝试使用抗氧化物食物，如大量的蔬菜水果、葡萄籽、可可、大蒜等减轻牙周炎导致的氧化应激反应，抑制牙周炎症的进展，并达到了一定的效果。同时存在的问题是：自由基反应是级联反应，抗氧化物质在消除一种自由基的同时可能会生成新的自由基，这些产物仍需机体继续代谢清除，还原性过强的抗氧化物可能影响有益的自由基发挥生理作用，同时抗氧化食物应用于牙周炎治疗的研究多局限于体外实验，对临床牙周指标的效果研究较少，因此仍然没有在临床上得以推广应用[8]。Ohsawa等[9]研究发现给大鼠吸入2%~4%的氢气（H₂）能显著改善缺血再灌注引起的氧化损伤，并且H₂能选择性清除羟自由基和亚硝酸阴离子，这两种自由基在活性氧中最具细胞毒性。氢的生物抗氧化作用有非常鲜明的优点。首先，氢的还原性比较弱，只与活性强和毒性强的活性氧反应，不与具有重要信号作用的ROS反应，这是氢选择性抗氧化的基础；其次，氢本身结构简单，与自由基反应的产物也简单，如与羟基自由基反应生成水，多余的氢可通过呼吸排出体外，不会有任何残留；最后，氢制备容易，价格低廉[10]。该研究迅速引起广泛关注，从此开启了氢气医学的热潮，成为了当今世界的前沿科学。

牙周炎是由G⁻菌引起的慢性感染性疾病，LPS是G⁻菌细胞外膜的主要成分，是牙周炎发病过程中重要的毒力因子。鉴于各种G⁻菌的LPS结构和生物学活性基本一致，本实验采用具有代表性的大肠埃希菌LPS作为刺激源诱导体外培养的人牙周膜细胞损伤[11]，探讨富氢培养基是否具有抗炎抗氧化作用以及相关机制，为其临床应用提供理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 试剂和仪器

LPS、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松（Sigma公司，美国）；0.25%胰蛋白酶（含0.01%乙二胺四乙酸）、胎牛血清、青霉素/链霉素（Gibco公司，美国）；DMEM培养基（康宁公司，美国）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）（日本同仁公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（微板法）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）测定试剂盒（TBA法）、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒（可见光法）（南京建成生物工程研究所）；酶标仪、微孔板式化学发光检测仪（Biotek公司，美国）；MoFlo XDP型超高速流式细胞分选仪（Beckman-Coulter公司，美国）；CO₂恒温培养箱（ASTEC公司，日本）；细胞计数仪（Bio-rad公司，美国）；Annexin V检测试剂盒（BD Pharmingen公司，美国）。

1.2. 人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的分离培养

经同济大学伦理委员会同意，并取得供者及其家属对标本采集的知情同意。选择同济大学附属口腔医院12~13岁患者正畸需拔除的前磨牙，牙齿拔除后生理盐水冲洗，然后置于1%双抗的DMEM培养基中，在超净工作台用含双抗的PBS缓冲液冲洗3次，将根中2/3的牙周膜刮下，剪碎，间隔均匀地接种在25 mL培养瓶中（培养瓶中提前加入少量的培养液润湿瓶底），翻转培养瓶，置于5%CO₂培养箱中培养2 h，待组织块贴壁后再加入4 mL培养基继续培养，每48 h换液。待细胞长满约80%时按1︰3进行传代，取第4~5代细胞进行实验。

1.3. 富氢培养基的配制

将含10%胎牛血清的DMEM培养基置于高纯氢气（纯度>99.999 9%）环境中，在0.4 MPa压力下加压暴露4 h，至氢气溶解于培养基达到饱和状态，放于4 °C贮存、备用[12]。

1.4. LPS刺激hPDLCs

取4~5代hPDLCs汇合到60%，参照文献[13]采用1 µg·mL⁻¹ LPS刺激两组细胞。一组是普通培养基（DMEM+10%胎牛血清）+LPS，即普通培养基组；另一组是富氢培养基+LPS，即富氢培养基组。

1.5. 方法

1.5.1. 检测细胞增殖

LPS刺激3 d，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，做细胞增殖曲线图。具体方法如下：1）向96孔板中加入100 µL细胞培养液培养细胞；2）在37 °C下孵育培养板；3）向各孔中加入5 µL的CCK-8溶液；4）37 °C下孵育2 h；5）测定450 nm处的光密度（optical density，OD）值。

1.5.2. LDH活性的检测

24 h后采用化学比色法检测细胞上清液中LDH的活性。

1.5.3. 上清液中氧化还原水平的检测

MDA作为氧化应激的指标，反映了氧自由基的水平及脂质过氧化损伤的程度。此外，为探讨富氢培养基对LPS所致牙周膜细胞损伤的保护作用是否是通过提高内源性抗氧化系统活性，所以6、12、24 h时参照说明书检测细胞上清液中MDA水平及SOD和CAT的活性。

1.5.4. 细胞凋亡的检测

24 h后用流式细胞仪检测细胞凋亡。细胞凋亡测定的具体方法是：1）用胰酶消化，收集培养于6孔板中的细胞，由于上清液中也含有凋亡细胞，故一同收集；2）1 000 r·min⁻¹离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清；3）用2~3 mL预冷的PBS洗涤细胞1~2次，离心后将细胞重悬于200~500 µL 1×Binding Buffer中；4）加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）各2~5 µL，室温避光放置15 min；5）用流式细胞仪分析检测前，以50 µm孔径的尼龙网膜过滤细胞，避免较大的细胞团阻塞机器。

2. 结果

2.1. 富氢培养基对细胞增殖活性的影响

LPS刺激下，富氢培养基组hPDLCs细胞活性显著高于普通培养基组（48 h时两组比较，P<0.05；72 h时两组比较，P<0.01），表明培养基中含有的氢可显著抑制LPS所致的细胞活性降低（图1）。

图 1. 富氢培养基对LPS刺激hPDLCs增殖活性的影响.

Fig 1 The influence of hydrogen-rich medium on cell viability under LPS stimulation

2.2. 富氢培养基对LDH释放的影响

LPS刺激下，富氢培养基可略降低hPDLCs的LDH释放，但差异无统计学意义（图2）。

图 2. 富氢培养基对LPS刺激hPDLCs后上清液中LDH的影响.

Fig 2 The influence of hydrogen-rich medium on LDH level under LPS stimulation

2.3. 富氢培养基对细胞上清液中MDA水平的影响

LPS刺激后，6 h时富氢培养基组细胞上清中MDA水平较普通培养基组显著升高（P<0.05），12 h和24 h时两组的MDA水平无显著差异（图3左）。

图 3. 富氢培养基对LPS刺激hPDLCs后上清液中MDA、CAT和SOD水平的影响.

Fig 3 The influence of hydrogen-rich medium on MDA, CAT and SOD levels under LPS stimulation

左：MDA；中：CAT；右：SOD。

2.4. 富氢培养基对细胞上清液中SOD和CAT活性的影响

6、12和24 h取2组细胞上清液进行测定。结果显示，6 h和12 h时富氢培养基组的CAT活性较普通培养基组显著升高（P<0.05，P<0.01）（图3中）；24 h时，2组CAT活性差异无统计学意义。2组中SOD的活性在各个时间点均无统计学差异（图3右）。

2.5. 富氢培养基对细胞凋亡的影响

LPS处理24 h后，流式细胞术测定2组细胞凋亡情况，Annexin V-FITC的流式散点图显示富氢培养基组比普通培养基组的细胞凋亡率低，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

图 4. 富氢培养基对LPS刺激hPDLCs下细胞凋亡的影响.

Fig 4 The influence of hydrogen rich medium on cell apoptosis under LPS stimulation

左：普通培养基组细胞凋亡的流式散点图；中：富氢培养基组细胞凋亡的流式散点图；右：2组细胞相对凋亡率的比较。

3. 讨论

本研究发现富氢培养基可显著抑制LPS所致的细胞活性降低，LDH的释放和细胞凋亡；而且富氢培养基可显著降低6 h时间点脂质氧化终产物MDA的生成（P<0.05），并且提高细胞上清液中抗氧化物CAT的生成。这些结果表明氢气可以保护牙周膜细胞，减轻LPS所致的氧化应激损伤。

LPS是牙周炎的重要致病因素。LPS可升高牙周膜成纤维细胞的氧化应激状态从而导致牙周炎[14]，还可诱导小鼠小胶质细胞株BV2细胞内活性氧自由基生成[15]，而且LPS可快速诱导巨噬细胞释放ROS[16]。氧化应激不仅可以导致羟自由基的生成，而且可以导致线粒体和内质网膜的通透性增加，释放细胞色素C，进一步激活下游的caspases，从而导致细胞凋亡[17]。而氢气可直接与羟自由基结合从而减少细胞损伤，促进细胞的存活[18]，并且可以减少线粒体的肿胀，保护线粒体上的细胞色素C的含量[19]。本研究结果同样证明：富氢培养基组细胞活性显著高于普通培养基组，增殖更快，凋亡率更低，表明培养基中所含氢气可显著抑制LPS所致的细胞活性降低，提高细胞的存活率。但是24 h检测LDH在上清液中的含量差异无统计学意义，推测可能由于培养基中的氢气容易挥发，随着时间的进展，氢气的效果下降，2组累积的LDH含量差异无统计学意义。

MDA作为脂质过氧化的终产物，被认为是评估氧化应激程度的可靠指标，MDA的水平与自由基造成的损伤密切相关。富氢的生理盐水可以降低大脑的早期损伤、肠道损伤和肺损伤[20]。本研究发现6 h时富氢培养基组MDA水平升高，减轻LPS刺激所造成的氧化应激程度。

SOD和CAT被认为是人体重要的防御氧化应激损伤的抗氧化酶，而氢气可有效增加抗氧化酶SOD和CAT的水平[21]，这和本研究结果相似。本研究发现富氢培养基组细胞上清中CAT活性较普通培养基组显著升高。富氢培养基组和普通培养基组SOD活性无统计学差异，可能是因为SOD既存在于细胞内又能释放到上清中，而笔者只检测了上清中的SOD活性。

浓度在5.6%以下的氢气不会燃烧和爆炸，而且没有任何毒性。已有研究[22]证实氢气水的安全性，已经将氢气水应用于临床治疗。笔者希望下一步可以建立大鼠的实验性牙周炎进行动物实验，并且进一步在临床用于牙周炎患者的辅助治疗。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81271110）；国家科技支撑计划（2014BAI04B07）；中央高校基本科研业务费专项资金（20152957）；上海市卫生计生委青年科研项目（20124y055）；同济大学青年优秀人才培养行动计划（1504219041）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81271110); Chinese National Science Technology Support Program (2014BAI04B07); The Fundamental Research Funds for the Central Universities (20152957); The Shanghai Health Bureau Youth Research Project (20124y055); Program for Young Excellent Talents in Tongji University (1504219041).