糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化过程中的Wnt经典信号通路研究

Abstract

目的

探讨Wnt经典通路相关因子Dickkopf蛋白1（DKK-1）、β-链蛋白（β-catenin）在糖基化终末产物（AGEs）介导的人牙周膜干细胞（hPDLSCs）骨分化过程中的变化。

方法

通过体外组织块法和有限稀释法克隆化培养获取hPDLSCs，实验分两组：正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。对2组细胞成骨矿化诱导后行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色；实时聚合酶链反应（real time PCR）检测成骨基因，以及Wnt经典通路中相关因子DKK-1、β-catenin；Western blot检测相关成骨蛋白、细胞核蛋白β-catenin。

结果

成骨诱导后，A-hPDLSCs组ALP染色明显浅于N-hPDLSCs组；茜素红染色A-hPDLSCs组钙化结节少于N-hPDLSCs组；real time PCR与Western blot的结果显示A-hPDLSCs组BSP、ALP、Runx-2的表达都较低，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt经典信号通路中相关因子：A-hPDLSCs组β-catenin表达高于N-hPDLSCs组，A-hPDLSCs组DKK-1表达明显低于N-hPDLSCs组，并且Weston blot显示A-hPDLSCs组核蛋白β-catenin的表达高于N-hPDLSCs组。

结论

AGEs可以使hPDLSCs骨向分化过程中Wnt经典通路的抑制因子DKK-1下调，细胞核中的β-catenin表达升高，激活了Wnt经典通路，并且抑制了骨分化。

糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）与糖尿病多种并发症的发生密切相关[1]。近年来，有研究[2]表明糖尿病患者晚期AGEs的大量积聚可促进糖尿病的发展，并且可诱导牙周病的发生和发展。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有自我更新和多向分化潜能，在维持牙周结构稳态方面起着重要的作用，其功能数量的变化会导致牙周膜的破坏[3]。研究[4]表明AGEs能使hPDLSCs增殖过程中的Wnt经典通路受到抑制，最终导致该细胞增殖能力有所减弱，AGEs又可以抑制该细胞的成骨分化能力，并在一定范围内呈浓度依赖性[5]。但AGEs是否影响了hPDLSCs骨向分化过程中的Wnt经典信号通路，目前尚无定论，故本实验旨在研究AGEs介导下的hPDLSCs骨向分化过程中的Wnt经典通路，并与正常细胞进行比较，从而探讨糖尿病牙周炎的发病机制。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂和仪器

α-MEM培养基、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），胶原酶、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），AGEs-BSA（Bio Vision公司，美国），细胞总RNA提取试剂盒、一步法逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（Takara公司，日本），茜素红（上海化学试剂采购供应站），β-链蛋白（β-catenin）兔抗人单克隆抗体（Abcam公司，美国），体式显微镜、倒置相差显微镜以及照相系统（Olympus公司，日本），流式细胞仪（Beckmen Coulter公司，美国），实时聚合酶链反应（real time polymerase chain reaction，real time PCR）仪器（Applied biosystems公司，美国）。

1.2. 取材和细胞培养

收集12~18岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋坏的年轻前磨牙，PBS冲洗后刮取根中1/3牙周膜组织，移入无菌培养皿内，加入少许α-MEN培养液，将牙周膜组织锐性分离，离心后弃上清，加入胶原酶至37 °C、CO₂孵箱中消化15 min，加入正常培养液终止其消化作用，离心后取上清，将分离的组织块均匀平铺于6孔板中，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液，置37 °C、5%CO₂孵箱中培养，待组织块周围有细胞爬出时去除盖玻片，每3 d换液，待细胞生长达80%时进行传代。

1.3. 有限稀释法克隆化培养纯化hPDLSCs

参照以往文献报道采用有限稀释法对hPDLSCs进行克隆分离。首先获取第一代牙周膜细胞，将第一代牙周膜细胞悬液有限稀释至密度为每毫升10个，用加样器向96孔培养板每孔内加0.15 mL，使每孔细胞悬液中约1个细胞，经过37 °C、5%CO₂培养箱中培养，细胞贴壁后在倒置显微镜下检查，挑选含单细胞孔，做标记并补加0.1 mL培养基，待孔中细胞增至占孔底面积l/3~l/2时，常规培养传代。

1.4. hPDLSCs初步鉴定

取克隆纯化的hPDLSCs，弃培养液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化3 min，α-MEM培养基终止，800 r·min⁻¹离心5 min，弃上清；再以含3%胎牛血清的PBS重悬细胞，使细胞密度达到每升3.0×10⁹个，分装到Eppendof管中，每管200 µL的细胞悬液，室温下每个管加入2 µL的STRO-1、CD14、CD105、CD29小鼠抗人单克隆抗体，避光4 °C冰箱孵育1 h；再用含3%胎牛血清的PBS清洗3次，1 000 r·min⁻¹离心5 min，最后再以含3%胎牛血清的PBS重悬。使用同型对照单克隆抗体确定背景标记，用流式细胞仪分析荧光细胞，专用的配套软件计算细胞表面抗原阳性表达率，单位用百分比表示。

1.5. 分组成骨诱导后碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和茜素红染色

实验分为正常hPDLSCs组（N-hPDLSCs组）和AGEs刺激的正常hPDLSCs组（A-hPDLSCs组）。N-hPDLSCs组用含10%血清的正常α-MEM培养基培养；A-hPDLSCs组加入含10 µg·mL⁻¹AGEs，10%血清的α-MEM培养基培养。分别取第3代克隆形成细胞以每毫升5×10⁴个的密度接种于6孔板中，待细胞增殖到70%时，按以上分组加成骨诱导液（10 mmol·L⁻¹ β-甘油磷酸钠、10⁻⁸ mol·L⁻¹地塞米松、50 µg·mL⁻¹维生素C）分别诱导7 d和21 d，每3 d换液一次；对照组细胞不加诱导液，常规培养，7 d后行ALP染色，21 d后行茜素红染色。

1.6. real time PCR检测

分别取第3代克隆形成细胞以每毫升5×10⁴个的密度接种于小瓶中，待细胞增殖到70%时，分4组：N-hPDLSCs组（用含10%血清的正常α-MEM培养基培养）；Os N-hPDLSCs组（用含有成骨诱导液的10%血清的α-MEM培养基培养）；A-hPDLSCs组（用含10 µg·mL⁻¹AGEs，10%血清的α-MEM培养基培养）；Os A-hPDLSCs组（用含10 µg·mL⁻¹AGEs，且含成骨诱导液的10%血清的α-MEM培养基培养）。每3 d换液一次，7 d后分别提取RNA，RT-PCR检测成骨相关基因骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、ALP、runt相关转录因子2（runt related transcription factor 2，Runx-2）及Dickkopf-1蛋白（DKK-1）、β-catenin表达。用细胞总RNA提取试剂盒一步法提取培养细胞总RNA，β-actin为内参照。参照GenBank数据库，采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物，由Takara公司（日本）合成，反应条件参考产品说明书，引物序列如下。β-actin上游引物序列：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；Runx-2上游引物序列：5′-CACTGGCGCTGCAACAAGA-3′，下游引物序列：5′-CATTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3′；ALP上游引物序列：5′-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3′，下游引物序列：5′-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3′；BSP上游引物序列：5′-CTGGCACAGGGTATACAGGGTTAG-3′，下游引物序列：5′-ACTGGTGCCGTTTATGCCTTG-3′；β-catenin上游引物序列：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，下游引物序列：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′；DKK-1上游引物序列：5′-CACTGCATTTGGATAGCTGGTT-3′，下游引物序列：5′-GAAGGTCTGTCTTGCCGGATAC-3′。

1.7. Western blot检测

采用Western blot检测各组总蛋白中成骨蛋白BSP、Runx-2的表达及核蛋白中β-catenin的表达，采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒进行核蛋白提取，蛋白含量测定采用Bradeford蛋白浓度测定试剂盒。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳，转膜，封闭，免疫反应，最后进行化学发光反应，对2组间相关蛋白表达进行分析。

1.8. 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两独立样本均数比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. hPDLSCs的分离与培养

本实验采用酶解组织块法培养原代细胞，一般3~10 d组织块周围有细胞爬出（图1），再通过有限稀释法得到正常的hPDLSCs，该细胞形态呈长梭形，胞核聚集在中心，胞体丰满，2周左右可达80%汇合。

图 1. 原代细胞（左）和第一代牙周膜细胞（右）的形态观察 倒置显微镜 × 20.

Fig 1 Morphology of primary cells (left) and the first generation of periodontal ligament cells (right) inverted microscope × 20

2.2. 流式细胞仪对干细胞初步鉴定

采用流式细胞仪对表型分子进行鉴定，表面抗原STRO-1、CD14、CD105、CD29阳性率分别为10.4%、0.6%、96.0%、98.4%。

2.3. 分组成骨诱导后ALP和茜素红染色比较

诱导7 d后，进行ALP染色，A-hPDLSCs组明显浅于N-hPDLSCs组（图2）。诱导21 d后，比较2组成骨诱导形成的钙化结节：发现在相同视野下，A-hPDLSCs组形成的钙化结节明显少于N-hPDLSCs组（图3）。

图 2. ALP染色结果.

Fig 2 ALP staining

左：N-hPDLSCs组；右：A-hPDLSCs组。

图 3. 成骨诱导21 d后，钙化结节形成 茜素红染色 × 10.

Fig 3 After 21 days, the formation of calcified nodules alizarin red staining × 10

左：N-hPDLSCs组；右：A-hPDLSCs组。

定量分析得到，A-hPDLSCs组和N-hPDLSCs组OD值分别为0.145 75±0.036 29、0.538 50±0.033 04，二者间差异有统计学意义（P<0.05）。

2.4. RT-PCR检测成骨相关基因及Wnt经典通路相关基因表达

通过RT-PCR检测诱导7 d后的成骨基因，发现A-hPDLSCs组ALP、BSP、Runx-2基因表达均低于N-hPDLSCs组（P<0.05），差异有统计学意义（图4）。诱导7 d后Wnt经典通路相关基因：N-hPDLSCs组DKK-1明显上调，β-catenin表达下调，而A-hPDLSCs组DKK-1表达低于N-hPDLSCs组，β-catenin表达高于N-PDLSCs组（P<0.05），差异具有统计学意义（图4）。

图 4. 成骨诱导前后N-hPDLSCs组和A-hPDLSCs组ALP、BSP、Runx-2、DKK-1、β-catenin基因的比较.

Fig 4 The expression levels of ALP, BSP, Runx-2, β-catenin and DKK-1 between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

从左至右依次ALP、BSP、Runx-2、DKK-1、β-catenin基因。A、B、C、D分别为N-hPDLSCs组、A-hPDLSCs组、Os N-hPDLSCs组、Os A-hPDLSCs组。

2.5. Western blot比较成骨相关蛋白以及细胞核中β-catenin蛋白表达

成骨诱导前后N-hPDLSCs组和A-hPDLSCs组BSP、Runx-2和β-catenin的表达见图5。

图 5. 成骨诱导前后N-hPDLSCs组和A-hPDLSCs组BSP、Runx-2 和β-catenin的表达.

Fig 5 Expression of BSP, Runx-2, β-catenin between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

上：Runx-2、BSP蛋白表达；下：β-catenin的表达。A、B、C、D分别为N-hPDLSCs组、A-hPDLSCs组、Os N-hPDLSCs组、Os A-hPDLSCs组。

图5结果显示，A-hPDLSCs组骨相关蛋白表达都弱于N-hPDLSCs组，N-hPDLSCs组在成骨诱导后细胞核中的β-catenin表达明显地减弱，成骨诱导后A-hPDLSCs组β-catenin的表达明显高于N-hPDLSCs组。

3. 讨论

hPDLSCs是具有自我更新和多向分化潜能，在维持牙周结构稳态方面起着重要的作用，牙周组织再生中最直接、最可靠、最不可缺少的干细胞，具备向其他类型组织细胞分化的潜能，当牙周组织受到损伤后，牙槽骨缺失，hPDLSCs会迁移并且分化为成骨细胞修复牙槽骨的缺损[6]。研究[7]–[9]显示，在体外成骨诱导培养的条件下，hPDLSCs能分化为成骨样细胞，形成钙化结节，表达一些成骨相关蛋白：骨钙素、骨桥素、胶原等。

对于糖尿病患者，其AGEs是不断积累的，在前期的研究结果中表明AGEs能够在一定浓度上抑制hPDLSCs的成骨分化，并且100 µg·mL⁻¹ AGEs刺激该细胞能使该细胞增殖过程中的Wnt经典信号通路受到抑制，为了研究骨分化过程中的信号通路不受到细胞增殖方面的干扰，本实验选择10 µg·mL⁻¹ AGEs浓度刺激该细胞，首先确认10 µg·mL⁻¹ AGEs对该细胞成骨能力的影响，实验结果显示体外成骨诱导1周后的ALP染色，A-hPDLSCs组的染色明显浅于N-hPDLSCs组，并且在诱导3周后，对细胞进行矿化结节染色，镜下观察可见，矿化结节在同一个视野下，N-hPDLSCs组矿化结节形成较多且很明显，而A-hPDLSCs组形成的结节偏少。最后进行定量分析，得到的结果也是A-hPDLSCs组形成的矿化结节少于N-hPDLSCs组细胞；其次，本实验在成骨诱导7 d后检测成骨基因ALP、Runx-2、BSP结果显示，2组细胞在加了成骨诱导液后，成骨基因表达都有所上升，但A-hPDLSCs组成骨基因表达上调不明显，与N-hPDLSCs组相比较明显偏低，差异有统计学意义。这种趋势与成骨能力表象的比较相一致。故在10 µg·mL⁻¹ AGEs刺激下，hPDLSCs成骨的能力下调。

各信号通路之间的相互作用决定着干细胞的命运和组织再生，其中的Wnt经典信号通路研究较成熟，该通路由分泌型的Wnt蛋白与卷轴受体结合而起始，最终导致β-catenin在胞浆中稳定积累并大量进入细胞核内激活淋巴增强因子（lymphoidenchancer factor，LEF）/ T细胞因子（T-cell factor，TCF）转录因子，激活了该通路，启动靶基因转录[10]。故本实验主要检查该通路里细胞核中的β-catenin以确定该信号通路的状态。

Wnt信号通路在不同类型、不同分化阶段中的干细胞作用是不相同的，该信号通路中相关因子的相互作用调控着该条通路的开启和关闭，最终以达到调节干细胞中相关的基因，从而调控细胞的形态及决定其分化的能力。有研究发现Wnt经典信号通路的激活可以促进成骨：LRP5（是Wnt经典通路通路中主要相关因子）的功能丧失性突变，造成Wnt经典信号通路的抑制，最终导致骨质密度降低，而功能获得性突变使得Wnt经典信号通路激活则会导致骨质密度增高症[11]；sFRP1基因缺陷的小鼠表现为Wnt信号通路的激活和骨量增多，在其骨骼中，TCF1、Runx-2和骨钙素表达明显增多[12]。相反也有研究[13]表明Wnt经典通路的激活也可以抑制成骨：通过在含有Wnt3a无血清条件培养基中培养或表达Wnt1的慢病毒载体转染，激活了通路，最终人骨髓间充质细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）的骨向分化受到抑制、细胞增殖能力增强；Derfoul等[14]通过基因转染使鼠胚胎间充质系C3HIOTl/2表达Wnt3a，结果发现Wnt3a能显著抑制其他成骨的标志基因如BSP、骨桥蛋白基因的表达。本实验主要检测该通路中的主要抑制因子DKK-1基因表达和β-catenin（其中包括β-catenin基因表达及单独提取细胞核中的β-catenin蛋白的表达），通过比较该2个因子在正常hPDLSCs成骨诱导前后的变化以及诱导后N-hPDLSCs组与A-hPDLSCs组的区别，来探讨AGEs刺激下，hPDLSCs骨分化过程中的Wnt经典通路是否受到影响。本实验研究结果显示对于正常hPDLSCs而言，成骨诱导后DKK-1基因表达明显上调，β-catenin基因表达下调，并且核蛋白里的β-catenin蛋白表达下调，可以确定Wnt通路处于抑制状态，故可以推断正常牙周膜干细胞在向成骨分化的过程中Wnt经典通路是受到了一定程度的抑制。通过对诱导后的正常组与AGEs刺激组比较，由于AGEs的刺激，抑制因子DKK-1基因表达降低，β-catenin基因表达明显升高，并且细胞核中的β-catenin蛋白表达升高，得到AGEs激活了的Wnt经典通路，这与正常的hPDLSCs骨分化过程中Wnt经典通路的抑制状态相反。

综上所述，AGEs能改变正常hPDLSCs骨分化过程中的Wnt经典通路，使该通路处于激活状态；AGEs抑制了hPDLSCs成骨分化。而AGEs是否通过激活Wnt经典通路影响hPDLSCs的骨分化能力，还需要大量的实验研究。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81360168）