CD44和CD133在口腔潜在恶性病变和口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

Abstract

目的

探究肿瘤干细胞标记物CD44和CD133在口腔正常黏膜、口腔潜在恶性病变（OPMD）及口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达情况及相互关系，评估其作为OPMD恶性转化早期诊断指标的临床价值。

方法

回顾性分析60例OPMD患者、60例OSCC患者及10例口腔黏膜正常者的临床资料，采用免疫组织化学双重染色技术检测各组病理组织中CD44与CD133的表达，分析CD44和CD133表达之间的关系及其与各临床因素之间的关系。

结果

口腔正常黏膜、OPMD、OSCC三组中，CD44的阳性表达率分别为100.00%、96.67%、71.67%（P<0.05），CD133的阳性表达率分别为0.00%、35.00%、63.33%（P<0.05）。CD44与CD133二者间的表达具有相关性（P<0.05），且其表达又都与OSCC的临床分期和淋巴结转移相关（P<0.05）。

结论

CD44和CD133作为评估OPMD恶性转化潜能的指标具有重要临床价值。

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC，以下鳞状细胞癌简称鳞癌）是人头颈部恶性肿瘤中最常见的病理类型之一，其死亡率约占世界癌症死亡率的第六位[1]。目前，综合序列治疗仍是治疗OSCC的首选，但并不能完全消灭癌细胞，治疗后仍易复发和转移，导致OSCC预后并不乐观。研究[2]表明发生淋巴结转移的OSCC患者5年生存率仅为30%左右。OSCC常由口腔潜在恶性病变（oral potentially malignant disorder，OPMD）发展而来。OPMD由WHO于2005年提出，指病变的某些组织学异常增加了其癌变的可能性，并建议取消以前癌前病变及癌前状态的区别，统称为OPMD。常见的OPMD有口腔红斑、口腔白斑、口腔扁平苔藓等[3]。

近年来OSCC相关分子生物学研究表明口腔黏膜上皮癌变是一个多阶段、多步骤、多因素改变的复杂病理过程[4]，目前临床尚无有效的预防和阻断方法。倘若能早期检测OPMD的发生和恶性转化，将对降低OPMD癌变率和OSCC发病率具有重要意义。近年发展起来的肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）理论为解释肿瘤难以治愈的复发和转移提供了新途径。肿瘤干细胞最早在白血病中被发现[5]，迄今为止，已在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、头颈部鳞癌等肿瘤中被发现和证实，且越来越多学者主张肿瘤干细胞标记物联合应用于肿瘤发病机制研究[6]。

本课题组前期研究从舌鳞癌细胞系中分离出的CD44⁺/CD133⁺的细胞亚群具有明显的裸鼠致瘤能力、克隆形成能力以及侵袭和迁移能力，在舌鳞癌的复发、转移中起到了重要作用[7]。本研究欲采用回顾性分析研究方法从组织学层面上探究正常的口腔黏膜、OPMD、OSCC组织中肿瘤干细胞标记物CD44和CD133的表达情况，统计分析其相互关系及与各临床因素之间的关系，评估CD44和CD133在口腔黏膜组织癌变过程中的表达规律及其临床意义；进一步评估其是否可以作为OPMD癌变潜能的检测指标，为OPMD和OSCC的预防与早期治疗提供理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 研究对象

本研究回顾性分析2010年5月—2015年5月在青岛大学医学院附属医院经病理确诊的60例OPMD患者、60例OSCC患者及10例口腔黏膜正常患者的临床资料，主要包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、病变部位、鳞癌的临床分期、有无淋巴结转移等。所有患者之前均未接受过任何的治疗措施。其中60例OPMD患者包括口腔扁平苔藓30例、口腔白斑30例；60例OSCC患者中包括高、中、低分化鳞癌各20例。

1.2. 主要试剂

CD133鼠抗人单克隆抗体（Miltenyi Biotechnology公司，德国），CD44兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美国），Polymer双染试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3. 方法

收集患者病理组织标本，采用免疫组织化学双重染色技术分别检测各病理组织中CD44与CD133的表达情况。

组织切片的制作和检测：所有蜡块标本均切片4张，厚度3 µm，贴于防脱片，60 °C烘烤2 h备用。采用免疫组织化学双重染色Elivison法，对标本进行检测。CD44采用试剂公司提供的OSCC阳性组织作为阳性对照，CD133采用试剂公司提供的大肠鳞癌阳性组织作为阳性对照。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作为阴性对照，对照组与实验组切片在同一条件下同时进行久红/二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）双重显色，苏木素复染细胞核。

用光学显微镜（×400）观察组织标本并计数阳性细胞，CD44阳性表达久红着色呈红色；CD133阳性表达DAB着色呈棕黄色。以细胞膜呈红色，细胞浆呈棕黄色为CD44与CD133联合表达的双阳性细胞。免疫组织化学双重染色的结果由2名不了解患者临床资料的高年资病理科医师独立进行判读，结果差异时由两位医师讨论后获得一致性，采用双评分半定量积分法进行评分。在高倍镜（×400）下随机选择5个高倍视野，每个视野平均观察100个细胞， 根据阳性细胞比例的平均值分为4级：阴性记为0分，阳性细胞≤10%记为1分，11%~50%记为2分，51%~75%记为3分，阳性细胞≥76%记为4分。CD44染色强度无色记为0分，淡粉色记为1分，粉色记为2分，红色记为3分，橘红色记为4分；同理，CD133染色强度无色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，红棕色记为3分，棕褐色记为4分（染色深浅需与背景着色相对比）。两分数乘积0~3分记为（−），4~5分记为（+），6~7分记为（++），8分以上记为（+++），即阴性（−）、阳性（+）、（++）、（+++）。

1.4. 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。组织标本中CD44、CD133的表达强度比较采用秩和检验；CD44与CD133表达关系采用Spearman等级相关；临床资料中CD133、CD44表达强度比较采用卡方检验（CD133、CD44在不同病变部位的表达强度比较采用秩和检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

组织标本中CD44阳性表达主要定位于细胞膜，久红着色呈红色；CD133阳性表达主要定位于细胞浆，DAB着色呈棕黄色；细胞膜呈红色、细胞浆呈棕黄色为CD44与CD133联合表达的双阳性细胞。各组CD44与CD133的表达见图1。

图 1. 各组病理组织中CD44、CD133的表达.

Fig 1 Expression of CD133 and CD44 in pathological tissue of every group

上：HE × 100；下：IHC × 400。从左到右依次为正常口腔黏膜、口腔扁平苔藓、口腔白斑、高分化OSCC、中分化OSCC、低分化OSCC。

口腔正常黏膜、OPMD、OSCC三组中，CD44的阳性表达率分别为100.00%（10/10）、96.67%（58/60）、71.67%（43/60），差异具有统计学意义（P<0.05，表1）；CD133的阳性表达率分别为00.00%（0/10）、35.00%（21/60）、63.33%（38/60），差异具有统计学意义（P<0.05，表1）。

表 1. 各组CD44、CD133表达强度的比较.

Tab 1 Expression of CD44 and CD133 in every group

组别		n	CD44				CD133
			(−)	(+)	(++)	(+++)	(−)	(+)	(++)	(+++)
正常口腔黏膜组		10	0	0	1	9	10	0	0	0
OPMD组	口腔扁平苔藓	30	1	7	6	16	21	7	2	0
	口腔白斑	30	1	11	5	13	18	5	7	0
OSCC组	高分化鳞癌	20	9	6	3	2	13	6	1	0
	中分化鳞癌	20	4	5	4	7	6	8	5	1
	低分化鳞癌	20	4	2	4	10	3	3	9	5

注：CD44：正常口腔黏膜组与OPMD组，Z=−2.502，P=0.012；OPMD组与OSCC组，Z=−2.725，P=0.006。CD133：正常口腔黏膜组与OPMD组，Z=−2.186，P=0.029；OPMD组与OSCC组，Z=−3.346，P=0.001。

CD44与CD133表达关联性分析结果显示，CD44与CD133表达具有关联性，差异具有统计学意义（P<0.05，表2）。

表 2. CD44与CD133表达之间的关系.

Tab 2 Relationship between the expression of CD44 and CD133

CD133	CD44
	（−）	（+）	（++）	（+++）
(−)	1	7	18	45
(+)	3	11	3	12
(++)	11	12	1	0
(+++)	4	1	1	0

注：CD44与CD133表达关联性，r=−0.652，P<0.05。

CD44、CD133表达与临床因素的相关性分析见表3。表3结果表明，CD44、CD133在患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史及病变部位的差异均无统计学意义（P>0.05），在鳞癌临床分期、淋巴结转移的差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明，CD44、CD133的表达与OSCC的临床分期和淋巴结转移相关。

表 3. CD44、CD133表达与临床因素的关系.

Tab 3 Correlation of CD44 and CD133 expression with clinical factors

临床因素		n	CD44			CD133
			阴性	阳性	P值	阴性	阳性	P值
年龄/岁	≥60	73	10	63	0.738	39	34	0.758
	<60	57	9	48		32	25
性别	男	89	14	75	0.596	49	40	0.882
	女	41	5	36		22	19
吸烟史	无	56	7	49	0.553	33	23	0.390
	有	74	12	62		38	36
饮酒史	无	49	9	40	0.346	25	24	0.522
	有	81	10	71		46	35
病变部位	舌	37	4	33	0.203	21	16	0.158
	颊	28	7	21		13	15
	腭	5	1	4		2	3
	唇	13	1	12		6	7
	牙龈	21	5	16		9	12
	口底	26	1	25		20	6
临床分期	Ⅰ~Ⅱ期	37	14	23	0.038	18	19	0.015
	Ⅲ~Ⅳ 期	23	3	20		4	19
淋巴结转移	无	42	16	26	0.010	20	22	0.007
	有	18	1	17		2	16

3. 讨论

OSCC是人头颈部恶性肿瘤中最常见的类型之一，且预后较差[8]，早发现、早诊断、早治疗成为提高OSCC患者生存率的关键。上皮异常增生被认为是OPMD发展为OSCC的高危因素，但某些OPMD，例如口腔扁平苔藓，其组织学检查常不伴有上皮异常增生，仍具有恶变潜能，其癌变率为1%~5.3%[9]。相较于传统的组织病理学检查，分子生物学检查为早期检测OPMD恶变潜能提供了新途径。近年发展起来的肿瘤干细胞理论为解释肿瘤难以治愈的复发和转移提供了新研究思路。大量研究[10]–[13]报道，CD44和CD133可作为肿瘤干细胞标记物用于肺癌、大肠癌、头颈部鳞癌等多种肿瘤生物学研究。本课题组前期研究[7]证明，人舌鳞癌细胞系中CD44⁺/CD133⁺细胞亚群在OSCC的复发及转移中起到重要作用。本研究通过检测CD44和CD133在正常口腔黏膜、OPMD和OSCC组织中的表达情况，统计分析二者之间的关系及其与各临床因素间的相互关系，探究CD44和CD133在口腔黏膜组织癌变过程的表达规律和临床意义，进一步评估二者作为检测OPMD恶变潜能和早期诊断指标的价值。

本研究结果显示，CD44在正常口腔黏膜中均深染，同时还观察到其在基底层和棘层深部着色最强，随着向表层的移行，其着色逐渐变淡，角质层无明显着色。这说明CD44可能为上皮细胞的分化和向表层移动提供定向信号[14]。在OPMD和OSCC组织中，CD44表达强度逐渐降低（P<0.05），这说明在正常口腔黏膜癌变过程中，可能由于CD44表达降低，对上皮细胞分化和向表层移动的指导作用降低，使得上皮细胞出现异常分化和异常增殖，从而可能导致恶变率提高。同时研究[15]表明，口腔癌的发生与局部刺激因子造成基因损伤有关，故CD44扮演的角色还可能为：CD44介导上皮细胞间黏附，从而维持上皮结构完整性，其表达降低，细胞间黏附作用降低，细胞间隙增大，组织更易受外界刺激损伤，恶变率随之提高。

本实验研究并未在正常口腔黏膜上皮中发现有CD133表达。据已有研究[16]报道，包括口腔黏膜上皮在内的多种正常组织均发现CD133表达。分析其原因可能为CD133在正常口腔黏膜上皮表达过少，而切片层面恰好无表达，或者本研究正常黏膜例数较少。在OPMD和OSCC中CD133表达逐渐增高。正常口腔黏膜上皮组织主要由三种细胞成分组成，分别为口腔黏膜干细胞、短暂扩增细胞以及终末分化细胞。细胞的恶性转化可能常常需要细胞内多个基因突变的积累，鉴于终末分化细胞生命期较短，理论上无法完成恶性转化所需要的基因突变积累，而口腔黏膜干细胞则恰与之相反，同时口腔黏膜干细胞CD133、sox2等表达较高[17]。虽然本研究结果并未在正常口腔黏膜上皮中发现CD133表达，但正常口腔黏膜上皮中可能仍存在少数CD133⁺细胞，该CD133⁺细胞可能为口腔黏膜干细胞，具有较强的更新、分化及增殖能力，且有足够时间及寿命来接受细胞恶性转化所需的遗传信息改变，故CD133⁺细胞越多，其接受遗传信息改变机率越大，恶变机率可能越大。

CD44与CD133表达关联性分析结果显示，两者存在一定关系。分析其关联性：肿瘤干细胞与Wnt、MAPK、Notch等信号通路存在一定联系[18]，其中Wnt信号通路在生物体发育过程中高度保守，通过参与细胞增殖、分化及凋亡等过程，对生物体的发育具有重要调控作用。CD133⁺细胞可以活化Wnt信号通路[19]，也有研究表明Wnt信号通路的活化可以促进细胞中CD133的表达。异常活化的Wnt信号通路能够激发LEF/TCF/β-catenin级联反应使得其下游基因表达紊乱，其中就包括CD44[20]。这可能为CD44与CD133关联性提供了合理的解释，但二者在口腔黏膜癌变过程中的相互关系仍需进一步研究。

此外，本研究OSCC组织分组结果显示CD44和CD133在OSCC中的表达与OSCC的病理分级相关，分化程度越低，CD44和CD133表达越强（P<0.05）。恶性肿瘤的分化程度越低，往往恶性程度越高，患者的预后越差。这就提示CD44和CD133在评估OSCC的恶性程度和预后中具有重要意义。

在CD44、CD133与临床各因素相关性分析中，其表达与患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史及病变部位均无相关性（P>0.05），与鳞癌患者的临床分期、淋巴结转移有相关性（P<0.05）。这说明可能口腔黏膜癌变形成肿瘤后，在进入血液和淋巴循环的肿瘤细胞中，CD44⁺肿瘤细胞相对于CD44⁻肿瘤细胞更易同质黏附形成肿瘤微栓，也更易与血管和淋巴管内皮细胞及基膜发生异质黏附，使得肿瘤微栓更易定植[21]，而在这些定植的肿瘤微栓中CD133⁺肿瘤细胞具有更强的克隆形成能力，故CD44⁺/CD133⁺的肿瘤细胞具有更强的形成瘤体及肿瘤转移灶的能力。

综上，CD44、CD133在口腔正常黏膜向OPMD及OSCC的发展过程中均具有重要的意义，而CD133的表达率、表达范围及数量上较CD44阳性细胞少，表达更显肿瘤趋化性，在瘤体中的表达更加中心化，有更高的特异性，在口腔黏膜癌变发生发展过程中可能具有更重要的意义。二者的具体作用机制仍不清楚，亟待进一步研究。CD44和CD133作为早期检测OPMD的指标具有可行性。CD133作为口腔正常黏膜向OPMD及OSCC的发展过程中的一个关键分子，进一步深入研究其作用机制将为OPMD癌变的早期检测、治疗选择、预后判断提供具有重要价值的参考依据。

Funding Statement

[基金项目] 山东省研究生教育创新计划（SDYY11184）

Supported by: Shandong Graduate Education Innovation Program (SDYY11184).