柚皮苷协同骨形态发生蛋白-2促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的研究

Abstract

目的

研究柚皮苷（NAR）联合骨形态发生蛋白（BMP）-2对体外培养的成骨前体细胞MC3T3-E1增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因ALP、骨钙素（OCN）、成骨特异性转录因子（Runx2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）表达的影响。

方法

以成骨细胞株MC3T3-E1为体外药效的试验模型，通过Alamar blue法检测第1、4和7天3种不同浓度NAR（10、100和1 000 µmol·L⁻¹）单独作用以及分别与50 ng·mL⁻¹ BMP-2联合诱导对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响。同时在第4天和7天测定成骨细胞内ALP活性，采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ的表达。

结果

单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激能够促进细胞增殖，在NAR浓度为100 µmol·L⁻¹时达到高峰（P<0.05），且该浓度NAR与BMP-2联合作用时增殖效果大于两者单独作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ALP活性，100 µmol·L⁻¹ NAR与BMP-2联合作用时ALP活性最强（P<0.05）。100~1 000 µmol·L⁻¹的NAR单独及联合作用在不同程度上能促进ALP、OCN、Runx2、ColⅠ成骨相关基因表达。

结论

NAR能有效促进成骨细胞株MC3T3-E1增殖、分化，且适宜浓度的NAR和BMP-2有协同和促进作用。

足量骨组织是获得颌面部美学和肌肉骨骼功能的前提条件，腭裂及牙槽嵴裂等是口腔颌面高发疾病，现今临床上的修复方式主要是自体骨移植，但其有一定的局限性，往往会引起植骨供区并发症[1]。修复骨缺损在口腔种植、颌面外科等领域仍然是个巨大的挑战，且随着口腔种植学的快速发展，牙槽骨再生和改建已成为国内外研究的热点。生长因子是促进组织再生的条件之一，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一种多功能生长因子，BMP-2是诱导成骨细胞成骨最重要的细胞外信号分子之一[2]，参与骨形成和重建[3]，主要通过调控成骨特异性转录因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨钙素（osteocalin，OCN）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原酶（collagen Ⅰ，ColⅠ）等成骨相关基因的表达，参与成骨细胞分化，促进骨形成和抑制骨吸收[4]–[6]。且大量研究[7]表明，用重组人骨形态发生蛋白（recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP）-2进行骨缺损移植与自体骨无明显差异。然而BMP-2的临床有效使用剂量非常高[8]–[9]，这不仅加大了患者的治疗成本，同时也带来高剂量副作用的可能性，因此其临床应用也较为局限。中药是我国传统医学的精髓，且在治疗骨缺损方面具有悠久的历史考证。柚皮苷（naringin，NAR）是骨碎补中含量最为丰富的黄酮类物质，具有补肾强骨、治疗骨质疏松、促进骨折愈合等功效[10]。目前研究显示NAR对成骨细胞的增殖有一定的促进作用[11]，也可通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）、苏氨酸激酶（threonine kinases，Akt）、c-Fos/c-Jun和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）旁路诱导BMP-2的表达，促进成骨细胞的增殖、分化和成熟[12]。且其来源广泛，药效作用和化学结构基本明确，符合现代中药的发展趋势，有较好的临床运用前景。

本实验采用成骨前体细胞MC3T3-E1进行培养，观察不同浓度NAR及与BMP-2联合作用时对成骨细胞增殖、ALP活性以及成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、ColⅠ表达的影响，为NAR和BMP-2在临床牙槽骨缺损的应用提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1. 试剂和仪器

成骨前体细胞系MC3T3-E1（上海中科院细胞库）；中药NAR单体（南京泽朗医药科技有限公司）；细胞培养基α-MEM和胎牛血清（Gibco™ Invitrogen公司，美国）；rhBMPs（R&D Systems Inc，美国）；细胞裂解液（Sigma-Aldrich公司，美国）；ALP检测试剂盒（Wako Pure Chemicals公司，日本）；BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；总RNA抽提试剂盒（Giagen GmbH公司，德国）；逆转录反应和实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（TaKaRa公司，日本）。

1.2. 方法

1.2.1. 实验设计分组

实验共分8组：1）对照组（A组）；2）50 ng·mL⁻¹ BMP-2（B组）；3）10 µmol·L⁻¹ NAR（C组）；4）10 µmol·L⁻¹ NAR+50 ng·mL⁻¹ BMP-2（D组）；5）100 µmol·L⁻¹ NAR（E组）；6）100 µmol·L⁻¹ NAR+50 ng·mL⁻¹ BMP-2（F组）；7）1 000 µmol·L⁻¹ NAR（G组）；8）1 000 µmol·L⁻¹ NAR+50 ng·mL⁻¹ BMP-2（H组），每组均设6个复孔。

1.2.2. 细胞培养

成骨前体细胞MC3T3-E1培养于含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的α-MEM培养基中，每3 d更换培养基。处于指数生长期的细胞接种24 h后予以1%FBS-α-MEM饥饿培养24 h，使细胞状态基本一致，然后分别在各培养孔中加入不同浓度的NAR单体和rhBMPs进行诱导刺激，每3 d更新培养基以及细胞因子，用于细胞增殖、ALP活性及成骨相关基因检测。

1.2.3. 细胞增殖检测

采用Alamar blue方法检测不同浓度NAR单体和rhBMP-2对MC3T3-E1细胞增殖的影响，细胞以每孔1×10⁴个接种于24孔板，收取各组经刺激培养1、4和7 d后的细胞裂解液，根据Quant-iT™ PicoGreen dsDNA Reagent and kits试剂盒使用说明配制反应体系，Ex480 nm/Em520 nm读取荧光密度，测得各组细胞DNA含量，用来反映细胞增殖数量。

1.2.4. ALP活性检测

细胞以每孔2×10⁵个接种于6孔板，收取各组经刺激培养4 d和7 d后的细胞裂解液，采用LabAssay™ ALP检测试剂盒检测细胞裂解液中的ALP活性，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测细胞总蛋白浓度。各组细胞裂解液的ALP活性值均用相应的细胞总蛋白浓度予以校准，求得各组相对ALP活性值。

1.2.5. qRT-PCR检测成骨相关基因的表达

细胞以每孔2×10⁵个接种于6孔板，各组经刺激培养4 d和7 d后弃去培养基，PBS清洗3遍，采用RNeasy Mini Kit和RNase-Free DNase Set试剂盒抽提细胞总RNA，检测基因浓度及完整性，经逆转录反应合成相应cDNA，以β-actin为管家基因。配制real-time PCR 20 µL反应体系，进行qRT-PCR检测（反应参数均根据试剂盒使用说明），反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析。基因表达量以检测基因的初始模板量表示（2^-ΔΔCt）。全部引物序列由上海皓嘉科技发展有限公司合成，引物序列见表1。

表 1. 引物序列.

Tab 1 Primer sequences

基因	编号	引物序列
ALP	NM_007431	F：5′-tgcctacttgtgtggcgtgaa-3′
		R：5′-tcacccgagtggtagtcacaatg-3′
OCN	NM_007541	F：5′-agcagcttggcccagaccta-3′
		R：5′-tagcgccggagtctgttcactac-3′
ColⅠ	NM_007742	F：5′-atgccgcgacctcaagatg-3′
		R：5′-tgaggcacagacggctgagta-3′
Runx2	NM_009820	F：5′-cactggcggtgcaacaaga-3′
		R：5′-tttcataacagcggaggcatttc-3′
β-actin	NM_007393	F：5′-aggagcaatgatcttgatctt-3′
		R：5′-tgccaacacagtgctgtct-3′

1.3. 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行分析，行单因素方差分析，以LSD法进行两两比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. 细胞增殖效应

Alamar blue法结果表明：单纯NAR刺激1 d和4 d时均能促进细胞增殖（P<0.05），表现为先上升后下降的趋势，NAR浓度为100 µmol·L⁻¹时达到高峰。然而在培养7 d后，10~100 µmol·L⁻¹的NAR均能够促进细胞增殖（P<0.05），而1 000 µmol·L⁻¹的NAR对细胞增殖有抑制作用，且有统计学意义（P<0.05）。不同浓度NAR与BMP-2联合作用时较NAR单独作用更能促进细胞增殖，100 µmol·L⁻¹的NAR与BMP-2联合作用时增殖效果最明显（P<0.05）（图1）。

图 1. NAR单独及联合BMP-2刺激成骨前体细胞MC3T3-E1后细胞DNA含量.

Fig 1 DNA content of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

左：1 d；中：4 d；右：7 d。

2.2. 细胞ALP活性检测结果

ALP活性是评价细胞成骨分化的早期指标。ALP活性检测中，NAR单独及联合BMP-2作用时，ALP活性的表达随着NAR浓度呈先上升后下降趋势，在NAR浓度为100 µmol·L⁻¹时达到了峰值(P<0.05)。100 µmol·L⁻¹的NAR与BMP-2联合作用时ALP活性上调最明显，显著高于其他组（图2）。

图 2. NAR单独及联合BMP-2刺激成骨前体细胞MC3T3-E1后细胞ALP活性情况.

Fig 2 The ALP activity of pre-osteoblasts (MC3T3-E1 cells) after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

左：4 d；右：7 d。

2.3. 成骨相关基因的表达结果

根据上述ALP活性检测结果，NAR单体在一定浓度范围内呈浓度依赖效应曲线，故后期用于基因表达水平比较研究的NAR浓度范围为10~1 000 µmol·L⁻¹。从荧光定量PCR显示的结果可见：NAR在100~1 000 µmol·L⁻¹时能促进Runx2表达，100 µmol·L⁻¹浓度的NAR与BMP-2有协同促进作用，尤其是4 d时联合使用的效果远大于两者单独使用（P<0.05）。在10~1 000 µmol·L⁻¹的浓度范围内，NAR上调细胞ALP基因表达的浓度效应关系呈现直线型，4 d时1 000 µmol·L⁻¹对ALP基因的表达效果最明显（P<0.05）。单纯NAR刺激及NAR联合BMP-2刺激4 d和7 d时均能促进细胞ColⅠ mRNA的表达。4 d时10 µmol·L⁻¹的NAR联合BMP-2能明显促进ColⅠ mRNA的表达（P<0.05），7 d时100 µmol·L⁻¹的NAR单独使用及与BMP-2联合均有显著促进作用（P<0.05）。单纯NAR刺激及NAR联合BMP-2刺激4 d和7 d均能够明显促进细胞OCN mRNA的表达，呈浓度依赖型。随着浓度的增大，优势更明显，尤其在第7天时，100~1 000 µmol·L⁻¹的NAR单独刺激与联合BMP-2均有显著作用（P<0.05）（图3）。

图 3. NAR单独及联合BMP-2刺激成骨前体细胞MC3T3-E1后成骨相关基因表达情况.

Fig 3 The relative expression of osteogenic genes after NAR alone and combined with BMP-2 stimulation

第一行：左：Runx2；右：Col Ⅰ。第二行：左：ALP；右：OCN。

3. 讨论

随着口腔种植修复技术的快速发展，种植也成为了更多临床医生及患者修复牙列缺损及缺失的选择，然而骨缺损、骨质疏松等严重影响种植体的骨结合及初期稳定性，甚至导致修复失败。临床上采用了不同的骨增量方法和植骨材料，促进种植体周围缺损区的骨形成。骨碎补是治疗骨相关性疾病常用的中药，NAR是其主要活性成分，普遍存在于柑橘类水果和许多中药中。Wong等[13]通过向兔颅骨缺损区域移植不同材料，发现NAR联合胶原基质能有效地促进新骨组织生成，且成骨作用优于自体骨移植，从而说明NAR可被作为骨移植材料使用。NAR可以明显地提高骨钙素、骨桥蛋白和BMP-2的分泌量，促进与成骨相关因子：碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、Runx2、成骨细胞特异基因（Osterix）和雌激素受体（estrogen receptor，ER）α及ERβ mRNA的表达，同时也可以增强ERα、ERβ和ColⅠ的分泌，通过雌激素信号通路来发挥其成骨作用[14]。另一方面NAR可以通过抑制核因子κB受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）诱导的核转录因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）的活性来阻止破骨细胞的形成以减少骨吸收的发生[15]。NAR可以通过调节成骨细胞及破骨细胞之间的平衡来调节骨代谢，促进骨形成，从而修复骨缺损。

BMP-2通路是最主要的成骨信号通路之一，可通过上调Msx2基因刺激Wnt信号通路促进骨祖细胞成骨性分化，还可激活诱导信号转导蛋白Smads调控基因和Osterix基因，并调节ALP、ColⅠ、OCN、骨桥蛋白（osteoprontin，OPN）等多种细胞因子的表达促进成骨[16]。然而BMP-2的临床有效使用剂量非常高，达到毫克级别[8]，这对患者来说是个巨大的经济负担，且大剂量使用BMP会有一定的不良反应，如刺激破骨细胞活性、异位骨生成。因此其临床应用较为局限。

MC3T3-E1细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，是良好的体外培养成骨细胞株，已经成为了研究药物对成骨细胞影响的有价值的体外细胞模型[17]。本研究结果发现在第1天和第4天时，10~1 000 µmol·L⁻¹浓度范围内，NAR单独作用和NAR与BMP-2联合作用均能够显著地促进成骨细胞增殖，且在100 µmol·L⁻¹时达到峰值，可见NAR对细胞增殖的促进作用有一定的浓度依赖性。然而在第7天时，1 000 µmol·L⁻¹的NAR对细胞的增殖有抑制作用，可能提示在第7天时高浓度的NAR以促进细胞分化为主。

ALP的活性是衡量成骨细胞早期分化的指标，本实验中在第4、7天中随着时间的延长ALP活性增强，表现出时间依赖性。ALP、OCN、Runx2、COlⅠ均是成骨细胞分化的指标。Runx2是骨形成最早的标志基因，是成骨细胞开始分化的标志，能够激活骨钙蛋白、骨桥素、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和COlⅠ基因的转录和表达[18]。ColⅠ则由成熟成骨细胞分泌[19]。实验中Runx2与COlⅠ表现出相同的趋势提示Runx2与COlⅠ为2个相关联指标，存在级联反应，这也跟文献研究[20]一致。ALP是成骨细胞早期分化标志。OCN是由分化期成骨细胞分泌的蛋白，可反映成骨细胞的活跃程度[21]，是成骨细胞成熟的标志[22]。实验中发现总体上而言随着药物浓度升高，刺激细胞分化的能力也相应增加。然而NAR和BMP-2在促进ALP、Runx2、ColⅠ、OCN均表现出不同作用，提示适宜浓度的NAR单独及联合BMP-2能够从早期到晚期提高MC3T3-E1细胞分化。并且在实验中，100 µmol·L⁻¹的NAR联合BMP-2联合刺激成骨细胞，增殖活性，ALP活性以及分化能力明显高于单纯100 µmol·L⁻¹的NAR刺激和单纯的BMP-2刺激，提示该浓度的NAR与BMP-2对成骨细胞具有协同作用，可能两者共同促进激活某一信号通路有关，其具体机制有待进一步研究。

本实验初步研究了NAR与BMP-2的联合诱导作用，发现适宜浓度的NAR与BMP-2具有协同作用，可促进成骨细胞的增殖、分化和成熟。中药NAR来源广泛，不良反应小，而BMP-2被认为是活性最强的诱导成骨因子之一。两者的联合诱导作用，不但能有效促进骨形成，而且也大大降低了临床治疗骨缺损的成本，缩短了治疗的时间，扩大治疗骨缺损的适应证，为临床治疗骨缺损提供新的思路和研究方向。

Funding Statement

[基金项目] 浙江省中医药科技计划项目（2014ZB028）

Supported by: Zhejiang Medical Science and Technology Plan Project (2014ZB028).