滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞增殖抑制及其机制的研究

Abstract

Objective

To investigate the inhibitory effect and underlying mechanism of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis on the proliferation of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-83 cells.

Methods

In vitro cell culture was performed. The proliferation of ACC-83 cells treated with different concentrations (5, 10, 20, 40, 60, 80, 100 µg·mL^–1) of total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis was observed using CCK-8 assay. Meanwhile, the apoptosis of ACC-83 cells treated with different concentrations (25, 50, 100 µg·mL^–1) of the total saponins was observed using flow cytometry. The expression levels of macrophage migration inhibitory factor (MIF) and CD74 were measured using Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction.

Results

The total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis induced apoptosis and expressed dose-effect relationship. ACC-83 cells expressed MIF and CD74, and the total saponins suppressed MIF and CD74 expression in ACC-83 cells.

Conclusion

The total saponins from Paris polyphylla var. yunnanensis can significantly inhibit the proliferation, suppress MIF and CD74 expression, and promote apoptosis in ACC-83 cells. This study provides a theoretical basis for the treatment of salivary adenoid cystic carcinoma using Paris polyphylla var. yunnanensis.

涎腺腺样囊性癌是涎腺肿瘤中较为常见的恶性肿瘤，具有侵袭性强、远处转移率高、嗜神经等特性，临床疗效不佳。研究[1]发现，术后辅助化疗可以有效提高肿瘤的局部控制率，因此寻找低毒高效的抗癌药物具有重要意义。近年来，重楼皂苷因具有抗肿瘤和抗菌消炎等作用而备受关注[2]。大量研究[3]–[5]发现，滇重楼总皂苷对乳腺癌、肺癌、结肠癌等均有明显抑制作用且有增效减毒的作用，但是重楼皂苷对ACC的研究还较为少见。本研究以涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-83为研究对象，探讨滇重楼总皂苷对ACC-83细胞的增殖抑制作用及相关机制，为临床应用重楼治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。

1. 材料和方法

1.1. 材料

ACC-83细胞株由北京大学口腔医院分子生物实验室李盛林课题组馈赠；重楼皂苷由中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室提供。RPMI-1640购自美国Thermo公司，胎牛血清购自美国Sciencecell公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，Anti-巨噬细胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、Anti-CD74、兔抗人β-actin抗体购自美国Abcam公司，Eastep总RNA提取试剂盒购自上海普洛麦格生物产品有限公司，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自美国Promega公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2. 方法

1.2.1. CCK-8法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期的ACC-83细胞，接种于96孔板中培养，设置5个平行复孔，培养24 h后，将质量浓度梯度分别为5、10、20、40、60、80、100 µg·mL⁻¹的药物按照实验设计给各实验组加药，分别设置阴性对照组（仅为完全培养基和ACC-83细胞）、调零组（仅为完全培养基），24 h后终止药物作用，加入10 µL CCK-8，继续培养3 h后上酶标仪检测，波长450 nm下测定并记录光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）= [（阴性对照组OD值−实验组OD值）/（阴性对照组OD值-调零组OD值）]×100%。

1.2.2. 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的ACC-83细胞，接种于6孔板中培养，参考IC₅₀值设置药物质量浓度梯度为低、中、高（分别为25、50、100 µg·mL⁻¹）3组，设置阴性对照组（仅完全培养基和ACC-83细胞），24 h后终止药物作用，收集细胞，离心3~5 min，去上清，加入约1 mL预冷的PBS，重悬细胞后离心沉淀，细胞共洗涤2次，去上清，250 µL Binding Buffer悬浮细胞，调节细胞密度为每毫升1×10⁶个，取100 µL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5 µL异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和10 µL碘化丙啶（propidium iodide，PI，质量浓度为20 µg·mL⁻¹）溶液，室温避光孵育15 min；上流式细胞仪分析检测细胞凋亡率。

1.2.3. Western blot检测MIF、CD74蛋白的表达

组织裂解液提取各实验组药物质量浓度梯度为低、中、高（分别为25、50、100 µg·mL⁻¹）3组以及阴性对照组细胞中的总蛋白，运用超微量紫外分光光度计测定各组蛋白浓度，计算上样量。制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）凝胶，上样、电泳、切胶及转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，漂洗3次，按1∶1 000和1∶500的比例分别配置MIF和CD-74的一抗，4 °C孵育并过夜；漂洗3次，按1∶6 000的比例配置二抗，室温孵育1 h，漂洗3次。以β-actin为内参。将A、B两种发光底物试剂按照1∶1配置，凝胶成像仪显影；Image J图像分析系统分析目标条带的灰度值。

1.2.4. 逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测MIF、CD74 mRNA的表达

参照RNA提取试剂盒的说明书提取各实验组药物质量浓度梯度为低、中、高（分别为25、50、100 µg·mL⁻¹）3组以及阴性对照组细胞中的总RNA，紫外分光光度计测定RNA溶液的浓度和纯度，配置RT-Mix，反应体系为10 µL，设置逆转录程序，反应条件为：95 °C 30 s，60 °C 45 s，72 °C 30 s。MIF上游引物：5′-GTGGTGTCCGAGAAGTCAGG-3′，下游引物：5′-TTGCTGTAGGAGCGGTTCTG-3′；CD74上游引物：5′-GGCTACTGCTGGTGTGTCTT-3′，下游引物：5′-TCCAAGGGTGACGAAAGAGC-3′；内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物：5′-ACCACAGTCCA- TGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTG- TTGCTGTA-3′。程序完成后，得到cDNA。根据样品和目的基因的数目，编排上样表中的顺序，配置PCR反应体系，所用为10 µm体系，PCR反应体系为：95 °C 5 min；95 °C 30 s，60 °C 45 s，72 °C 30 s，共25个循环。采用RT-PCR仪进行检测，数据根据表达量=2^−ΔΔCt分析。

1.3. 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，先对数据进行正态性及方差齐性检验，方差齐者采用One-way ANOVA分析，组内两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布或方差不齐者采用Kruskal-Wallis检验。检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. CCK-8法检测细胞增殖抑制率

CCK-8法检测结果显示，不同药物质量浓度的滇重楼总皂苷对ACC-83细胞均有不同程度的生长抑制作用，并呈剂量-效应关系（具体数值见表1）。各组抑制率组间比较的差异有统计学意义（F=258.395，P<0.05），进一步行两两比较，各组的差异均有统计学意义（P<0.05），可见在一定质量浓度范围内细胞抑制率呈剂量-效应关系。经统计软件计算，其IC₅₀值为37.956 µg·mL⁻¹。

表 1. CCK-8检测各组的细胞增殖抑制率.

Tab 1 CCK-8 detection of cell proliferation inhibition rate

药物质量浓度/（µg·mL−1）	OD值	抑制率/%
阴性对照	1.646 33±0.011 2	-
5	1.546 11±0.026 6	6.721±2.351
10	1.438 67±0.047 7	14.264±2.267
20	1.174 73±0.004 4	30.807±6.279
40	0.979 28±0.043 1	43.792±3.343
60	0.697 69±0.021 6	62.295±2.801
80	0.535 33±0.021 2	73.429±0.402
100	0.318 42±0.003 6	87.407±2.333

n=5

2.2. 流式细胞仪检测细胞凋亡

流式细胞仪检测结果见图1，可见各实验组细胞均发生不同程度的凋亡。药物低、中、高质量浓度组的凋亡率分别为3.29%±1.18%、60.23%±4.26%和81.51%± 5.11%，阴性对照组为2.60%±0.57%。经统计学检验，阴性对照组与低质量浓度组相比差异无统计学意义（P>0.05），而与中、高质量浓度组相比差异有统计学意义（P<0.05），提示中高质量浓度组具有明显的促凋亡作用。

图 1. 流式细胞仪检测各实验组ACC-83细胞的凋亡.

Fig 1 The apoptosis of ACC-83 cell in each experimental group was detected by flow cytometry

A：阴性对照组；B：低质量浓度组；C：中质量浓度组；D：高质量浓度组。

2.3. Western blot检测MIF、CD74蛋白的表达

MIF和CD74蛋白表达的Western blot结果见图2。药物低、中、高质量浓度组MIF蛋白灰度值分别为39 530.17±415.93、26 512.56±5 617.44和20 706.47±1 358.78，阴性对照组的灰度值为39 065.78±2 747.97（图3A）。经Kruskal-Wallis检验，与阴性对照组相比，高质量浓度组的MIF灰度值明显降低，差异有统计学意义（P=0.025），其余两组与阴性对照组的差异无统计学意义（P>0.05）。各实验组CD74蛋白的灰度值分别为34 078.22±943.24、30 021.12±754.27和11 154.92±385.02，阴性对照组为34 912.08±1 367.42（图3B）。经统计学检验，阴性对照组与低质量浓度组比较差异无统计学意义（P>0.05），与其余两组的差异均有统计学意义（P<0.05）。该结果提示，ACC-83细胞中有MIF、CD74蛋白的表达，中高质量浓度的滇重楼总皂苷可明显抑制MIF、CD74蛋白的表达。

图 2. Western blot检测各组MIF和CD74蛋白表达.

Fig 2 The expression of MIF and CD74 protein in each group detected by Western blot

A：阴性对照组：B、C、D分别为低、中、高质量浓度组。

图 3. MIF和CD74蛋白和mRNA的相对表达量.

Fig 3 The relative expression of MIF protein, CD74 protein, MIF mRNA and CD74 mRNA

A：MIF蛋白；B：CD74蛋白；C：MIF mRNA；D：CD74 mRNA。

2.4. RT-PCR检测MIF、CD74 mRNA的表达

药物低、中、高质量浓度组MIF mRNA相对表达量分别为0.95±0.12、0.86±0.14和0.45±0.09（图3C），与阴性对照组（设为1）相比，高质量浓度组中MIF mRNA相对表达量明显降低（P=0.001）。各实验组CD74 mRNA相对表达量分别为0.90±0.107、0.86±0.068和0.56±0.008（图3D），与阴性对照组相比，高质量浓度组表达量明显减少（P<0.05），其余各组的差异无统计学意义（P>0.05）。该结果提示高质量浓度的滇重楼总皂苷可明显抑制MIF和CD74 mRNA的表达。

3. 讨论

近年来，随着中药重楼对肿瘤的发病机制及治疗方法研究的深入，以中药重楼为主或为辅的抗癌药物已经得以应用。目前以重楼为主的抗癌药物肝复乐已应用于临床，作为原发性肝癌的辅助治疗手段。重楼皂苷的抗肿瘤机制主要有诱导肿瘤细胞凋亡，阻遏癌细胞的发生和转移，调节机体免疫，抑制肿瘤血管生成等，但其分子机制尚不明确。颜璐璐等[6]研究发现，重楼皂苷有广泛的抗肿瘤活性，对10多种肿瘤细胞株均有抑制作用。目前有关重楼皂苷对腺样囊性癌的研究还较少。本研究表明，重楼皂苷可诱导ACC-83细胞发生凋亡，高质量浓度组的细胞凋亡率达81.51%±5.11%，且无明显的细胞毒性作用；中低质量浓度组的促凋亡作用较弱，可能是因为药物为总提取混合物，药物有效活性成分及纯度还有待进一步筛选。总体来看，滇重楼总皂苷对ACC-83细胞增殖具有有效的抑制作用，这为后续重楼活性成分及药效学的综合研究奠定了基础。

MIF是由T细胞产生的多功能致炎细胞因子，可抑制单核/巨噬细胞移动，其来源广泛，除正常组织及免疫细胞中有表达外，本实验发现MIF在ACC-83细胞中也有高表达。异常表达的MIF所涉及的多种细胞信号通路通过多种方式参与免疫、炎症、肿瘤等多种病理过程，已经成为炎症和肿瘤等疾病的研究靶标。长期慢性炎症可导致MIF的异常表达，有助于某些特定肿瘤的生长和侵袭，其主要机制包括以下两点。1）下调p53，上调环氧化酶2和前列腺素E2，诱导血管生成，促进肿瘤的增殖及侵袭[7]–[8]。2）异常表达的MIF可激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族成员和MIF特异性膜受体CD74发生磷酸化[9]–[10]，募集CD44形成CD74-CD44复合体，促进下游细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷脂酰肌醇-3激酶/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/AKT，PI3K/Akt）通路持续活化，促进肿瘤细胞增殖[11]–[12]。MIF通过多条经典信号通路的协调作用诱导炎症因子、癌基因及抑癌基因的恶性转化，间接调节机体免疫反应，促进细胞增殖和迁移，而MIF作为共同枢纽，成为抗炎抗肿瘤治疗的最佳靶点[13]。

Zhang等[14]发现，重楼皂苷可诱导肝癌HepG-2细胞通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）介导的线粒体功能障碍及MAPK通路发生细胞凋亡。He等[15]研究证实，重楼可下调人肺腺癌A549中基质金属蛋白酶（matrix metaloproteinase，MMP）-2、MMP-9，抑制其黏附、迁徙及转移。本实验研究结果发现，MIF、CD74在ACC-83细胞中高表达，药物作用于ACC-83细胞后，MIF、CD74蛋白和mRNA的表达量随着药物质量浓度的增加而降低，高质量浓度组MIF与阴性对照组相比有明显差异，且与CD74的表达量呈正相关。Meyer-Siegler等[16]通过阻滞CD74来阻断MIF的信号传导通路，结果发现可抑制前列腺癌的增殖转移和扩散。由此推测，重楼诱导的ACC-83细胞凋亡与MIF和CD74介导的信号通路相关，这为MIF-CD74作为治疗靶点提供了理论依据[17]。

本研究结果表明，滇重楼总皂苷对涎腺腺样囊性癌ACC-83细胞生长具有明显的抑制作用，可以有效降低MIF及CD74的表达，促进ACC-83细胞凋亡，为滇重楼单体及MIF抑制剂的研究提供了理论依据。

Funding Statement

[基金项目] 口腔疾病研究国家重点实验室开放课题（SKLOD2015OF10）；云南省医疗卫生单位内设研究机构科研项目（2016NS115）

Supported by: State Key Laboratory of Oral Diseases Research Project (SKLOD2015OF10); The Research Project of Research Institute of Yunnan Medical and Health Units (2016NS115).