Abstract
目的
了解复发性阿弗他溃疡（RAU）患者血清中可溶性程序性死亡受体-1（sPD-1）、可溶性程序性死亡配体-1（sPD-L1）蛋白表达与患者免疫功能状态的相关性，探讨sPD-1/sPD-L1在RAU免疫发病机制中的作用及意义。
方法
研究对象为30例RAU患者（轻型18例，重型5例，疱疹型7例）及18例健康人（对照组）。采用流式细胞术检测RAU患者外周血细胞免疫指标（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+），散射比浊法检测RAU患者体液免疫指标（IgG、IgA、IgM、C3、C4），酶联免疫吸附测定RAU患者及健康人血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表达，并对sPD-1、sPD-L1表达水平与RAU患者免疫功能状况及临床特征的相关性进行分析。
结果
与正常值相比，RAU患者CD4+水平降低，IgM水平增高，差异有统计学意义（P<0.05）。RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）；进一步分析表明，轻型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05），而疱疹型RAU患者与对照组无统计学差异（P>0.05）。RAU患者sPD-1表达量与CD19+、C4存在正相关关系（r1=0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）。
结论
RAU患者以细胞免疫功能低下为主，同时伴有体液免疫功能的紊乱；RAU患者sPD-1、sPD-L1蛋白高表达在一定程度上通过影响PD-1/PD-L1信号通路参与RAU免疫机制的调节，可能在RAU的免疫发病机制中起着一定作用。
Keywords: 复发性阿弗他溃疡, 可溶性程序性死亡受体1, 可溶性程序性死亡配体1, 免疫
Abstract
Objective
This study aims to investigate the possible role and significance of soluble programmed death-1 (sPD-1) /soluble programmed death ligand 1 (sPD-L1) in the immune pathogeneses of recurrent aphthous ulcer (RAU).
Methods
A total of 30 RAU cases (18 cases of minor RAU, 5 cases of major RAU, and 7 cases of herpetiform ulcers) were enrolled in this study. A total of 18 healthy people served as controls. Lymphocyte subsets (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, and CD16++56+) were investigated by flow cytometric analysis. Humoral immunity (IgG, IgA, IgM, C3, and C4) was explored by nephelometry immunoassay. The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the sera of RAU patients were investigated by enzyme-linked immunosorbent assay. The correlations of the sPD-1 and sPD-L1 protein levels with the immune status and clinical characteristics of the RAU patients were analyzed by SPSS 19.0.
Results
The number of CD4+ T cells decreased and the levels of IgM antibodies increased in the RAU patients relative to those in the normal controls (P<0.05). The sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the RAU patients were significantly higher than those in the control group (P<0.05). Meanwhile, the sPD-1 and sPD-L1 protein levels in the patients with minor and major RAU were significantly higher than those in the control group (P<0.05). By contrast, no significant difference was found in the patients with herpetiform RAU (P>0.05). Positive correlations were noted between the sPD-1 protein level and the CD19+ cell frequency or C4 level (r1=0.389, P1=0.034; r2=0.382, P2=0.037).
Conclusion
Cellular immune hypofunction and humoral immunity disorders were found in the RAU patients. The PD-1/PD-L1 signaling pathway, which might be influenced by the involvement of sPD-1 and sPD-L1 proteins to a certain extent, may play some roles in the immune pathogenesis of RAU.
Keywords: recurrent aphthous ulcer, soluble programmed death-1, soluble programmed death ligand 1, immune
复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulcer，RAU）是最常见的口腔黏膜疾病，临床表现为口腔黏膜上周期性复发性的溃疡性损害。RAU的发病与遗传、免疫、环境、感染等多种因素有关，其中免疫因素被认为与该病的发生尤为密切[1]，但具体发病机制目前仍不清楚。程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）为免疫抑制分子，属于CD28家族成员的Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于外周CD4+、CD8+ T细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、巨噬细胞、B细胞及其树突状细胞表面，PD-1在无功能的T细胞上也呈高表达[2]。PD-1可抑制B细胞受体的刺激性信号，从而降低B细胞活化[3]。程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）是PD-1的配体，属于B7超家族成员，广泛表达于活化的T细胞、B细胞，以及树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和培养的骨髓来源的肥大细胞[4]。PD-L1的生物学作用为通过与PD-1分子结合，并活化其胞内段ITIM基序，传递正向信号，负性调节T细胞的活化和功能。PD-1/PD-L1是目前免疫学分子领域研究的热点，其可以协助激活T细胞，又可以通过负性协同刺激信号下调免疫反应。近期研究表明，PD-1、PD-L1除了膜结合型外，还存在可溶性形式，即：可溶性PD-1（soluble programmed death-1，sPD-1）和可溶性PD-L1（soluble programmed death ligand 1，sPD-L1）。研究发现，sPD-1能高亲和力结合PD-L1，阻断PD-L1/PD-1的相互作用，从而增强T细胞的免疫效应[5]；sPD-L1则可与T细胞表面PD-1受体相结合负性调控T淋巴细胞免疫应答，抑制T细胞增殖[6]。它们在多种免疫性疾病发生、发展中发挥重要的调节作用。目前已有新药CT-011和MDX-1106通过阻断PD-1而实现了对PD-L1/PD-1相互作用的抑制，从而增强T细胞的免疫效应来达到抗肿瘤的效果[7]。
本研究通过了解RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白表达情况，并分析其与RAU患者免疫功能状态的相关性，探讨sPD-1/sPD-L1在RAU免疫发病机制中的作用及意义。
1. 材料和方法
1.1. 研究对象
病例选自2012年9月—2013年9月间就诊于贵州医科大学附属医院口腔内科黏膜病专科门诊初诊为RAU的患者30例（RAU组）。其中，男性14例，女性16例；年龄16~72岁，平均年龄（44.03±1.58）岁。按RAU的临床分型标准[1]，其中轻型18例，重型5例，疱疹型7例。纳入标准：1）符合RAU临床诊断（参考卫生部规划教材《口腔黏膜病学》 第 4 版）；2）溃疡频繁发作病史半年以上（溃疡复发频率每月至少 1 次）；3）本次溃疡发作不超过 72 h，并未进行过局部及全身治疗。排除标准：1）患者1 个月内使用过抗生素，3个月内使用过免疫制剂；2）伴有全身系统性疾病（糖尿病、心血管疾病、肝炎、精神病等）或免疫性疾病者；3）有牙龈炎、牙周炎或其他口腔黏膜疾病者；4）月经期、妊娠期妇女。
对照组18例，均为来自于贵州医科大学附属医院体检中心的年龄、性别与RAU组匹配的健康人。
所有的研究对象均被告知研究内容并签署知情同意书。
1.2. 主要设备及试剂
流式细胞仪、6色TBNK检测试剂盒（BD公司，美国），特定蛋白分析系统（Beckman Coulter公司，美国），酶标仪（BIO-RAD公司，美国 ），免疫球蛋白G/A/M检测试剂盒、补体C3/C4 检测试剂盒（贝克曼库尔特实验系统苏州有限公司），人sPD-1、sPD-L1酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海创祥生物科技有限公司）。
1.3. 实验方法
1.3.1. 免疫检测
采集RAU组患者空腹状态下清晨9点前外周静脉血两管，一管抗凝血（3 mL）送至贵州医科大学附属医院中心实验室，采用流式细胞术检测患者外周血细胞免疫指标（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++56+）；另一管非抗凝血（5 mL）送至贵州医科大学附属医院微生物免疫实验室，采用散射比浊法检测患者体液免疫指标（IgG、IgA、IgM、C3、C4），收集上清夜−80 °C冻存备用，都由相应实验室完成。以实验室标准值为正常对照。
1.3.2. sPD-1、sPD-L1蛋白表达
采用ELISA检测RAU组患者及对照组健康人血清中sPD-1和sPD-L1水平，按照说明书进行操作。sPD-1、sPD-L1标准品的浓度依次为0、15、30、60、120、240 pg·mL−1。以空白孔调零，利用酶标仪读取450 nm吸光度（A）值，根据绘制的标准曲线计算待测血清中sPD-1和sPD-L1的浓度。
1.4. 统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，资料统计描述用均数±标准差或中位数（四分位间距）表示，两组之间差异比较采用独立样本t检验或秩和检验，sPD-1、sPD-L1表达水平与RAU患者免疫功能状况及临床特征的相关性分析采用Pearson或Spearman相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 免疫检测结果
流式细胞术检测结果表明，RAU组患者CD4+水平低于正常值，差异具有统计学意义（P<0.05）（表1）；散射比浊法检测结果表明，RAU患者IgM水平高于正常值，差异具有统计学意义（P<0.05）（表2）。
表 1. RAU患者细胞免疫检测结果.
Tab 1 Cellular immune test results in patients with RAU
| 指标 | RAU组 | 正常值 | t值 | P值 |
| CD3+ | 67.41±10.75 | 70.85±6.23 | −1.753 | 0.09 |
| CD4+ | 32.40±6.92 | 38.46±5.77 | −4.797 | 0.000* |
| CD8+ | 28.61±10.26 | 30.4±5.59 | −0.958 | 0.346 |
| CD19+ | 10.24±4.34 | 9.42±3.04 | 1.034 | 0.310 |
| CD16++56+ | 20.23±10.75 | 22.37±7.90 | −1.088 | 0.285 |
注：*RAU组与正常值相比，P<0.05。
表 2. RAU患者体液免疫检测结果.
Tab 2 Humoral immune test results in patients with RAU
| 指标 | RAU组 | 正常值 | t值 | P值 |
| IgG | 14.85±5.38 | 12.87±1.35 | 2.016 | 0.053 |
| IgA | 2.41±0.77 | 2.35±0.34 | 0.430 | 0.670 |
| IgM | 1.81±1.06 | 1.08±0.24 | 3.752 | 0.001* |
| C3 | 1.05±0.31 | 1.14±0.27 | −1.653 | 0.109 |
| C4 | 0.29±0.22 | 0.27±0.03 | 0.614 | 0.544 |
注：*RAU组与正常值相比，P<0.05。
2.2. sPD-1、sPD-L1蛋白的表达情况
ELISA检测结果（图1）表明，对照组sPD-1、sPD-L1分布较为集中，未见极端值，整体呈正态性分布趋势；RAU组sPD-1、sPD-L1整体呈非正态性分布，其中30例中有3例（2例轻型、1例疱疹型）升高趋势较为明显，RAU患者外周血血清中sPD-1、sPD-L1表达水平较对照组总体上表现为升高趋势，但个体之间存在着差异。秩和检验分析表明，RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义（Z1=−2.794，P1=0.005；Z2=−2.834，P2=0.005）。
图 1. RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1蛋白的表达.
Fig 1 Expression of sPD-1, sPD-L1 protein in patients with RAU
进一步分析RAU不同临床类型间的sPD-1及sPD-L1的表达，结果显示轻型、重型RAU患者的sPD-1及sPD-L1蛋白表达水平高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），而疱疹型RAU患者与对照组无统计学差异（P>0.05）（表3）。
表 3. 不同临床类型RAU患者血清中sPD-1及sPD-L1蛋白的表达水平.
Tab 3 Expression level of sPD-1, sPD-L1 protein in RAU patients with different clinical features
| 组别 | n | sPD-1 | sPD-L1 |
| 对照组 | 18 | 17.65（0.00~26.10） | 22.79（1.19~28.29） |
| 轻型RAU | 18 | 32.25（22.74~41.52）* | 33.49（24.08~38.49）* |
| 重型RAU | 5 | 35.89（32.63~39.93）* | 32.31（30.64~38.29）* |
| 疱疹型RAU | 7 | 28.02（24.66~38.87） | 31.34（16.13~35.02） |
注：括号前为中位数，括号内为四分位间距。*与对照组相比，P<0.05。
pg·mL−1
2.3. RAU患者sPD-1、sPD-L1表达量与免疫指标的相关性分析
Spearman相关分析表明，RAU患者sPD-1表达量与CD19+、C4存在正相关关系（r1=0.389，P1=0.034；r2=0.382，P2=0.037）；但sPD-L1表达量与细胞免疫和体液免疫指标均无相关关系（表4）。
表 4. RAU患者sPD-1、sPD-L1与免疫指标的相关性分析.
Tab 4 The correlate analysis between the expression of sPD-1, sPD-L1 and the immune system of RAU patients
| 指标 | sPD-1 |
sPD-L1 |
||
| r值 | P值 | r值 | P值 | |
| CD3+ | 0.099 | 0.602 | 0.085 | 0.657 |
| CD4+ | 0.141 | 0.458 | 0.018 | 0.924 |
| CD8+ | 0.001 | 0.994 | −0.028 | 0.883 |
| CD19+ | 0.389 | 0.034 | 0.051 | 0.789 |
| CD16++56+ | −0.234 | 0.214 | −0.067 | 0.726 |
| lgG | −0.034 | 0.859 | 0.017 | 0.927 |
| lgA | −0.136 | 0.473 | 0.096 | 0.613 |
| lgM | −0.043 | 0.822 | −0.224 | 0.234 |
| C3 | 0.168 | 0.375 | −0.262 | 0.161 |
| C4 | 0.382 | 0.037 | 0.150 | 0.429 |
3. 讨论
RAU是最常见的口腔黏膜疾病，是一种局限口腔黏膜的溃疡性损害，患病率20%左右[1]。RAU具有周期性、复发性、自限性、灼痛明显等特点，给患者带来了很大的痛苦。RAU的病因及发病机制不明，推测其发生可能是机体在受到各种可疑致病因素如细菌、病毒或精神心理因素、激素的改变、生活不规律等的刺激下引发的异常免疫反应，致使口腔黏膜上皮局部发生免疫性的损伤、坏死而形成溃疡。目前认为RAU患者免疫调节失衡是其发生的重要原因。机体免疫中，T淋巴细胞亚群主管细胞免疫，是细胞免疫的主力军[8]，其功能主要取决于T淋巴细胞总值（CD3+）及其亚群（CD4+、CD8+）的相对组成。在本研究中RAU患者以CD4+降低最为明显，提示在RAU的发作期，患者的细胞免疫功能处于低下状态，这与其他学者[9]的研究结果一致。免疫功能低下很可能会导致机体对外来致RAU的抗原或者是超抗原的抵御能力变弱。体液免疫是通过B淋巴细胞产生的特异性免疫球蛋白来实现的，免疫球蛋白（Ig）可分为五类，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中，IgM在免疫球蛋白中相对分子质量最大，是初次体液免疫应答中抗感染的“先锋部队”，通过与补体结合，可起到溶解细菌和溶解血细胞的作用。C3、C4是补体系统中含量最多、最重要的一个组分。在本研究中，与正常值相比，RAU患者IgM升高，提示患者体液免疫功能处于增强状态。以上结果提示RAU发作期机体免疫状态是不正常的，不仅有细胞免疫的低下，而且还有体液免疫功能的增强。
协同刺激分子家族的新成员PD-1/PD-L1是目前免疫学分子领域中研究的热点，PD-1/PD-L1共刺激信号通过抑制下游细胞信号转导通路，导致细胞周期停滞在G0/G1期，抑制T细胞增殖和细胞因子分泌，负性调控免疫应答，在维持免疫耐受中起重要作用[10]–[11]。正常生理调节下适量的PD-1/PD-L1信号通路能抑制T细胞增殖及细胞因子产生，从而调节T、B细胞的相互作用，限制自身反应性T细胞效应功能和靶器官的损害[12]，保护外周组织不受自身免疫对机体的攻击；但如果PD-1/PD-L1通路提供的负信号强度过强，又会过度地抑制T细胞的增殖、活化，从而导致细胞免疫功能缺陷。sPD-1与PD-L1或者sPD-L1与PD-1结合都能够影响PD-1/PD-L1信号通路，发挥免疫抑制作用。本研究结果显示，RAU患者血清中sPD-1、sPD-L1水平均高于正常。推测，一方面可能由于RAU患者体内异常升高的sPD-1过多的与PD-L1结合阻断了T淋巴细胞表面的PD-1与单核细胞、组织细胞等表面的PD-L1的结合，进而活化的CD4+T细胞逃避了PD-1/PD-L1的负性调控信号，导致T细胞持续活化、增殖，对自身抗原产生持续的免疫应答，发生自身组织损伤。另一方面可能由于RAU患者体内sPD-L1的异常增多与PD-1发生结合，使得抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）细胞膜表面的PD-L1与T、B细胞表面的PD-1发生相互作用的频率、概率显著降低，进而活化T细胞不能及时获得足够强度的负性调控信号，导致T细胞过度活化增殖，对自身抗原引起持续的免疫反应，发生自身组织损伤[13]。本研究还进一步分析了RAU不同临床类型间的sPD-1及sPD-L1的表达，结果显示，轻型、重型RAU的sPD-1及sPD-L1蛋白表达水平都高于对照组（P<0.05），而RAU疱疹型与对照组差异无统计学意义，这可能与本研究疱疹型样本量小有关。对RAU患者细胞免疫和体液免疫与sPD-1水平的相关性进行分析，结果显示，sPD-1蛋白的高表达与RAU细胞免疫中CD19+、体液免疫中C4存在正相关关系（P<0.05）。加之上述免疫结果已经表明，RAU细胞免疫中CD4+细胞减少，RAU患者处于细胞免疫功能低下状态。这提示：sPD-1的高表达可能促使RAU患者的体液免疫功能增强。其原因可能是sPD-1能够参与血液循环，它们既能够影响邻近细胞又能够和远端细胞表面的受体相互结合，其发挥作用的广度和深度甚至超过了细胞膜表面的分子。研究[14]–[15]表明sPD-L1促使细胞周期停滞于G1期并促进T淋巴细胞的凋亡，这与本研究中RAU患者的实际免疫结果相符合。因此，sPD-1、sPD-L1分子可能都参与了RAU疾病的发生。
综上所述，本研究中RAU患者以细胞免疫功能低下为主，同时还伴有体液免疫功能的增强，且外周血中sPD-1和sPD-L1蛋白表达水平增高。sPD-1的高表达与CD19+、C4存在正相关关系，说明sPD-1蛋白的表达异常，其可能在一定程度上通过影响PD-1/PD-L1信号通路抑制RAU的细胞免疫，同时诱发RAU的体液免疫增强，在RAU免疫发病机制中起着一定的作用，但其具体的作用机制尚有待进一步的研究证实。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金（81460104）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81460104).
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