Abstract
目的
观察常氧和慢性间歇低氧下大鼠牙周炎模型中白细胞介素-18（IL-18）和低氧诱导因子（HIF）-1α的表达情况，探讨牙周炎和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）发病相关的可能机制。
方法
将32只SD大鼠随机分为4组：常氧对照组、常氧牙周炎组、低氧对照组、低氧牙周炎组。通过结扎双侧上颌第二磨牙和高糖饮食的方法建立牙周炎模型。低氧对照组和低氧牙周炎组大鼠置于模拟中重度OSAHS的慢性间歇低氧环境中。8周后处死大鼠，检测各组大鼠的牙周指标，采用酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠血清及牙龈组织中IL-18和HIF-1α的质量浓度，分析低氧牙周炎组的牙周附着丧失与IL-18和HIF-1α的相关性。
结果
低氧牙周炎组的IL-18、HIF-1α的质量浓度较其余3组明显升高（P<0.05）；其血清中IL-18、HIF-1α的质量浓度与牙周附着丧失呈正相关，相关系数r分别为0.792和0.753（P<0.05）；牙龈组织中IL-18、HIF-1α质量浓度与牙周附着丧失也呈正相关，相关系数r分别为0.817和0.779（P<0.05）。
结论
慢性间歇低氧能加重牙周炎症，与IL-18、HIF-1α的表达有相关性。
Keywords: 慢性间歇低氧, 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征, 牙周炎, 白细胞介素-18, 低氧诱导因子-1α
Abstract
Objective
This study evaluates the expression of interleukin-18 (IL-18) and hypoxia-inducible factor (HIF)-1α in rat periodontitis model exposed to normoxia and chronic intermittent hypoxia (CIH) environments. The possible correlation between periodontitis and obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) was also investigated.
Methods
Thirty-two Sprague–Dawley (SD) rats were randomly assigned into four groups: normoxia control, normoxia periodontitis, hypoxia control, and hypoxia periodontitis groups. The periodontitis models were established by ligating the bilateral maxillary second molars and employing high-carbohydrate diets. Rats in hypoxia control and hypoxia periodontitis groups were exposed to CIH treatment mimicking a moderately severe OSAHS condition. All animals were sacrificed after eight weeks, and the clinical periodontal indexes were detected. The levels of IL-18 and HIF-1α in serum and gingival tissues were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The correlation between attachment loss (AL) and the levels of IL-18 and HIF-1α in hypoxia periodontitis group was evaluated.
Results
The levels of IL-18 and HIF-1α in hypoxia periodontitis group were significantly higher than that in normoxia periodontitis and hypoxia control groups (P<0.05). Furthermore, the levels of IL-18 and HIF-1α in serum (r=0.792, r=0.753, P<0.05) and gingival tissues (r=0.817, r=0.779, P<0.05) were positively correlated with AL.
Conclusion
CIH could aggravate the destruction of periodontal tissues, which is correlated with IL-18 and HIF-1α levels.
Keywords: chronic intermittent hypoxia, obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, periodontitis, interleukin-18, hypoxia-inducible factor-1α
牙周炎是影响口腔健康的重要疾病，其致病机制除了细菌的直接侵入，细菌毒素及代谢产物也可破坏牙周组织，引起炎症反应和免疫反应，产生一系列炎症介质。阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是表现为睡眠时严重打鼾，呼吸暂停或憋气并会引起各重要器官、系统功能改变的一种疾病。目前已经发现，牙周炎和OSAHS有密切关系[1]–[2]。牙周炎患者中白细胞介素（interleukin，IL）-18和低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α的表达明显升高[3]–[4]；而OSAHS患者血清中IL-18水平也明显高于正常人群，且随着疾病严重程度的增加而增加[5]。有实验[6]发现，慢性间歇低氧诱发了HIF-1α表达升高，而慢性间歇低氧是OSAHS的一个显著特征，由此推断，IL-18、HIF-1α与牙周炎和OSAHS可能存在某种联系。目前关于牙周炎和OSAHS的研究还较少，本研究通过建立模拟OSAHS的间歇低氧条件下的大鼠牙周炎模型，观察IL-18和HIF-1α在血清和牙龈组织中的表达，探讨牙周炎和OSAHS发病相关的可能机制。
1. 材料和方法
1.1. 材料
1.1.1. 主要实验材料和仪器
水合氯醛，大鼠IL-18酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、大鼠HIF-1α ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。动物间歇低氧仓（山西医科大学第一医院），测氧仪（浙江电化分析仪器厂）；医用氧气（太原市欣易得气体厂）和高纯度氮气（北方气体有限公司）。
1.1.2. 实验动物
5周龄健康雄性SD大鼠32只，质量（200±20） g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2. 实验方法
1.2.1. 动物分组及建模
将32只大鼠适应性喂养1周，节律性光照，用随机数字表法将其分为４组：常氧对照组（Ａ组）、常氧牙周炎组（Ｂ组）、低氧对照组（Ｃ组）、低氧牙周炎组（Ｄ组），每组８只，分笼饲养。A组：普通饲料喂养。B组和D组：10%的水合氯醛腹腔麻醉后，用0.2 mm的结扎丝结扎于大鼠双侧上颌第二磨牙牙颈部，尽量置于龈沟内，每周检查一次结扎丝，如有脱落应再行结扎；1周内逐渐增加高糖食物比例直至完全代替普通饲料，每日用高糖粉质饲料喂养。C组和D组：参考杜晓燕等[7]的方法，将大鼠放入间歇低氧舱内，每天缺氧时间为8 h。在实验期间，氮气和氧气在电磁阀的控制下循环输入低氧舱，每个循环为90 s，通过测氧仪监测低氧舱内的氧体积分数，最低为9%，最高为21%。低氧舱的低氧程度相当于临床上OSAHS患者中、重度水平。实验共历时8周。
1.2.2. 牙周临床指数检查
8周后，所有大鼠禁食12 h以上，麻醉后先拆除其结扎丝，用牙周探针测量各组大鼠双侧上颌第二磨牙的出血指数（bleeding index，BI）及牙周附着丧失（attachment loss，AL）并作记录。BI的测定采用Mazza（1981）计分标准，AL为釉牙骨质界至牙周袋底的距离。先用牙周探针测量牙周袋深度，当探针退出时测得釉牙骨质界到龈缘的距离，两者相减为AL。每颗牙测量颊侧近中、颊侧中央、颊侧远中3个位点，两侧牙共测量6个位点，取均值。上述所有操作均由同一医师进行。
1.2.3. 影像学检查和组织切片制作
实验结束后，用断头法处死实验动物，解剖取出上颌骨磨牙段。将上颌骨在多聚甲醛溶液中固定48 h，运用牙科X线机对取出的上颌骨进行影像学检查，观察牙槽骨吸收情况；然后用脱钙液脱钙2周，经脱水、包埋后制作切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.2.4. 牙龈组织及血清中IL-18、HIF-1α的检测
大鼠空腹下，腹主动脉取血，3 000 r·min−1 4 °C下离心15 min，取上清液，装入EP管中，标号，−70 °C保存。牙龈组织样本取自第二磨牙周围牙龈组织，用冰生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，制备组织匀浆（牙龈组织与盐水体积比为1∶9）3 000 r·min−1 4 °C下离心15 min，取上清液，标号，−70 °C保存。血清复温至室温，牙龈组织上清液用生理盐水稀释为1%的匀浆样本（体积比1∶9），分别使用IL-18、HIF-1α ELISA试剂盒对其进行检测。以OD值为横坐标，IL-18、HIF-1α的标准品浓度为纵坐标，得到曲线方程：IL-18为Y=27.066x2+331.50x−10.997（R2=0.999 5），HIF-1α为Y=16.596x2+96.513x−2.257 7（R2=0.999 7）；通过曲线获得各样本的质量浓度。
1.2.5. 数据分析方法
应用SPSS 19.0统计软件进行分析。各组BI总体比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Nemenyi检验，定量资料AL及ELISA结果组间比较采用方差分析，D组血清及牙龈组织中IL-18、HIF-1α质量浓度与AL的相关性采用Spearman相关分析，检验水准为双侧α=0.05。
2. 结果
2.1. 牙周临床指数检查
各组大鼠的BI检测结果见表1：A组与B组之间，C组与D组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）；而B组与D组之间，A组与C组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。D组AL与其余3组之间的差异有统计学意义，B、C组AL值与A组之间的差异亦有统计学意义（P<0.05）。
表 1. 4组大鼠的BI和AL测量结果.
Tab 1 The results of BI and AL in four groups of rats
| 组别 | BI |
AL/mm | |||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| A（常氧对照） | 6 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.38±0.52 |
| B（常氧牙周炎） | 0 | 2 | 5 | 1 | 0 | 0 | 1.11±0.64 |
| C（低氧对照） | 1 | 5 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1.75±0.71 |
| D（低氧牙周炎） | 0 | 0 | 2 | 3 | 3 | 0 | 2.63±0.92 |
n=8
2.2. 影像学观察
4组大鼠的X线检查结果见图1：A组牙槽骨无明显吸收（图1A）；B组有一定程度的牙槽骨吸收，牙周膜间隙明显增宽（图1B箭头示）；C组牙槽骨有一定的骨质吸收（图1C箭头示）；D组结扎区牙槽骨有较明显的骨质吸收，部分根分叉暴露（图1D箭头示）。
图 1. 4组大鼠牙槽骨的X线片.
Fig 1 X-ray images of alveolar bone in four groups of rats
A：常氧对照组；B：常氧牙周炎组；C：低氧对照组；D：低氧牙周炎组。
2.3. 组织学观察
4组大鼠牙周组织HE染色结果如图2所示：A、C组根分叉区牙槽骨基本正常，B、D组根分叉区可见牙槽骨的骨吸收陷窝增加，牙周纤维紊乱、破坏，牙周组织破坏严重。
图 2. 4组大鼠上颌第二磨牙根分叉区组织学观察 HE × 40.
Fig 2 Histological observation of the furcation of maxillary second molars in four groups of rats HE × 40
A：常氧对照组；B：常氧牙周炎组；C：低氧对照组；D：低氧牙周炎组。
2.4. IL-18、HIF-1α质量浓度的测定
4组大鼠IL-18、HIF-1α的质量浓度见表2：B、C组的IL-18、HIF-1α质量浓度明显高于A组（P<0.05），D组高于其他3组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
表 2. 4组大鼠血清及牙龈组织中IL-18、HIF-1α的表达.
Tab 2 Expression of IL-18 and HIF-1α in serum and gingival tissues in four groups of rats
| 组别 | IL-18 |
HIF-1α |
||
| 血清1） | 牙龈组织2） | 血清3） | 牙龈组织4） | |
| A（常氧对照） | 408.80±4.47 | 185.49±3.94 | 88.55±1.24 | 59.01±1.10 |
| B（常氧牙周炎） | 429.91±6.27 | 221.80±9.60 | 99.39±2.85 | 67.58±1.18 |
| C（低氧对照） | 426.25±6.63 | 215.50±10.76 | 94.40±2.14 | 74.31±1.50 |
| D（低氧牙周炎） | 464.00±8.48 | 251.71±16.30 | 106.39±2.06 | 83.44±2.01 |
注：1）4组间比较，F=99.640，P<0.05；2）4组间比较，F=48.244，P<0.05；3）4组间比较，F=99.174，P<0.05；4）4组间比较，F=384.773，P<0.05。
pg·mL−1, n=8, x±s
2.5. D组血清及牙龈组织中IL-18、HIF-1α质量浓度与AL的相关性
经Spearman相关性检验，D组血清中IL-18、HIF-1α质量浓度与AL呈正相关，相关系数r分别为0.792和0.753（P<0.05），D组牙龈组织中IL-18、HIF-1α质量浓度与AL也呈正相关，相关系数r分别为0.817和0.779（P<0.05）。
3. 讨论
牙周炎是一种涉及到免疫炎症反应的疾病，而OSAHS也是与炎症相关的疾病。Ahmad等[8]发现：中重度牙周炎和OSAHS的发生有密切关系。间歇性低氧是OSAHS的一个显著特征。Ryan等[9]认为，OSAHS的间歇低氧/复氧可能是引起炎症反应的主要因素，引起炎症的主要有两条通路：1）依赖核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）产生炎症介质，从而形成炎症反应通路；2）依赖HIF-1产生的适应性通路。Burioka等[10]也认为：间歇性低氧能通过激活NF-κB信号通路，产生炎症细胞因子。基于此，本实验通过测定炎症因子IL-18和HIF-1α来研究牙周炎和OSAHS发病相关的可能机制。
IL-18是重要的促炎细胞因子，与多种疾病关系密切。牙周炎患者的龈沟液及血清中IL-18水平均要明显高于正常组[3],[11]。有学者[12]对IL-18与牙周炎发生进行Meta分析，发现二者存在相关性，可作为预测牙周炎发展过程的一个生物学指标。但是，目前仍然无充足的证据来解释IL-18在牙周炎发生发展中所起的作用。Yoshinaka等[13]认为，IL-18是通过CD4+ T细胞产生核转录因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL）引起牙槽骨丧失，从而导致牙周炎发生。
HIF-1是一种氧调控转录因子，在哺乳动物的生理疾病的发病机制中发挥重要作用[14]。HIF-1由α和β两个亚单位构成，与多种疾病密切相关[15]–[16]。在组织低氧的情况下，可以诱导HIF-1α蛋白水平增加。Ng等[17]认为，由于炎症牙周组织的血管微循环受阻，白细胞浸润增加，牙周组织氧含量失调，产生的一些炎症介质如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可以激活HIF-1通路，导致牙周组织中HIF-1α表达增加。有学者[18]通过氯化钴模拟低氧实验发现，低氧通过激活HIF-1α促进牙周成纤维细胞的凋亡。这些实验均提示HIF-1α在牙周炎发展中起重要作用。
本实验成功建立了慢性间歇低氧牙周炎大鼠模型，可以观察到间歇低氧牙周炎组大鼠牙龈组织糜烂，影像学和组织学观察显示牙周组织破坏在4组中最为严重。BI结果显示，低氧对照组与常氧对照组、低氧牙周炎组与常氧牙周炎组的差异均无统计学意义，考虑可能是样本量较小的缘故。此外，低氧对照组与常氧对照组相比，低氧牙周炎组与常氧牙周炎组相比，AL的差异均有统计学意义，说明间歇低氧能促进牙周附着丧失，加重牙周炎症。同时，低氧对照组血清及牙龈组织中IL-18、HIF-1α质量浓度较常氧对照组，低氧牙周炎组较常氧牙周炎组均有显著升高（P<0.05），与苏晓丽等[6]的部分研究结果一致。此外，低氧牙周炎组IL-18、HIF-1α的质量浓度和AL存在正相关（P<0.05）。这些结果均说明慢性间歇低氧能促进牙槽骨的附着丧失，加重牙周炎症，并且与IL-18、HIF-1α的表达有关。慢性间歇低氧诱导IL-18、HIF-1α表达的增加，可能是OSAHS加重牙周炎的机制之一。目前，关于慢性间歇低氧诱导IL-18的机制仍不清楚。Li等[5]认为可能的机制是：1）许多细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6诱导IL-18的表达；2）重复的夜间血氧不足和氧化应激反应直接诱导IL-18表达。有研究[19]表明，慢性间歇低氧可能通过激活NF-κB炎症通路，使TNF-α、IL-8等炎症细胞因子的浓度升高。由此推断，慢性间歇低氧可能通过激活NF-κB炎症通路，进而诱导IL-18表达的增加，从而加重牙周炎症。
本文探讨了慢性间歇低氧条件下大鼠血清及牙龈中IL-18、HIF-1α质量浓度的变化，为研究OSAHS患者牙周炎的发病机制提供了相关依据，但OSAHS和牙周炎都是多因素作用的炎症性疾病，其具体机制有待进一步研究。
Funding Statement
[基金项目] 山西省自然科学基金资助项目（2014011046-2）
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