人工合成抗菌肽对口腔细菌抗菌性能的初步研究

Abstract

Objective

This study aims to evaluate the antimicrobial activity of decapeptide, a novel antimicrobial peptide, against several major cariogenic and periodontopathogenic bacteria in vitro.

Methods

In this study, we investigated the anti-microbial activity of decapeptide against Streptococcus mutans (S. mutans), Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus sanguis, Streptococcus gordonii, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans, and Saccharomyces albicans in vitro using the agar diffusion method and broth dilution method. Furthermore, a time–kill kinetic study of decapeptide against S. mutans was performed.

Results

The results showed that decapeptide exhibited antimicrobial activity against various oral bacteria and fungi. The minimum inhibitory concentration (MIC) of main cariogenic bacteria ranged from 62.5 µg·mL⁻¹ to 125 µg·mL⁻¹, and the MIC of periodontopathogenic bacteria tested ranged from 250 µg·mL⁻¹ to 1 000 µg·mL⁻¹. Among the bacteria tested, decapeptide had a strong inhibitory effect on cariogenic S. mutans. Results of the time–kill kinetic studies showed that decapeptide reduced the viable counts of S. mutans by more than one order of magnitude after 20 min of incubation, and thoroughly killed S. mutans after 30 min. No viable cells could be detected after 24 h of incubation.

Conclusion

This study suggest that decapeptide might have potential clinical application in treating dental caries by killing S. mutans within dental plaque.

龋病是在以细菌为主的多种因素作用下，发生在牙体硬组织的慢性、进行性破坏的疾病，龋病及其继发疾病给人类造成很大的危害，被世界卫生组织列为人类重点防治的非传染性疾病。变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是与龋病发生密切相关的主要致病菌，也是牙菌斑生物膜中重要的定植菌。十肽（decapeptide）是从多肽库中筛选出来的一种人工合成的新型抗菌肽，具有较强的抗微生物活性，且作用过程中不产生耐药性。十肽氨基酸序列为KKVVFKVKFK-NH2，其具有的单一氨基酸序列是其主要部分[1]。本研究旨在研究十肽抑制口腔感染性疾病主要致病菌生长的能力，体外评价十肽的抑菌防龋性能，为进一步探索十肽抑制细菌，防止早期菌斑形成的作用机制奠定实验基础。

1. 材料和方法

1.1. 十肽的合成

依据十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法体外合成十肽并进行质谱鉴定（成都诚诺新技术有限公司合成并鉴定）。

1.2. 主要仪器和设备

标准96孔微量板（Sigma公司，美国），光学显微镜（Nikon公司，日本），ProtoCOL SR 全自动抑菌环测量仪（Synbiosis公司，英国），CrystalSpec™比浊仪（Becton Dickinson公司，美国），针孔式滤膜过滤器（孔径：0.2 µm，无锡赛维商贸公司），厌氧培养箱DY-2（浙江义乌冷冻机总厂），超净工作台（苏州净化设备有限公司），高压蒸汽灭菌机（Sanyo公司，日本）。

1.3. 实验菌株

变异链球菌ATCC 25175、表兄链球菌6715、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、血链球菌ATCC 10556、格氏链球菌ATCC 10558、黏性放线菌ATCC 19246、内氏放线菌ATCC 12140、牙龈卟啉单胞菌381、中间普雷沃菌ATCC 25611、具核梭杆菌10953、伴放线放线杆菌29523、白色假丝酵母菌ATCC 10691均由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.4. 实验菌株的培养

变异链球菌、表兄链球菌、格氏链球菌、血链球菌、黏性放线菌、内氏放线菌采用TPY培养基培养；嗜酸乳杆菌采用Rogosa培养基培养；牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌、具核梭杆菌、伴放线放线杆菌采用BHI培养基培养；白色假丝酵母菌采用BA培养基培养。

1.5. 方法

1.5.1. 十肽实验液的配制

将人工合成的十肽重悬于无菌双蒸水，终浓度为4 g·L⁻¹，针孔式滤膜过滤器过滤，−20 °C保存备用。

1.5.2. 菌悬液的配制

实验菌种冻干株接种于相应固体培养基上复苏，于80%N₂、10%H₂、10%CO₂，37 °C下厌氧培养24~48 h，白色假丝酵母菌于恒温培养箱37 °C需氧培养24 h。检查菌落的生长形态，镜检无污染，涂片检查证实为纯培养后，挑取单个菌落于液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌，CrystalSpec™比浊仪测定菌悬液浓度，磷酸缓冲液（PBS）配制浓度为1×10⁸ CFU·mL⁻¹和2×10⁶ CFU·mL⁻¹的细菌菌悬液备用。

1.5.3. 琼脂扩散实验

实验分为阳性对照组（0.1%氯己定）、阴性对照组（PBS缓冲液）、实验组（4 g·L⁻¹的十肽实验液）。采用琼脂扩散的方法，制备含菌的培养基，微量加样枪吸取浓度为1×10⁸ CFU·mL⁻¹的菌悬液各200 µL加入20 mL培养基中，充分混匀，铺板（培养皿直径90 mm），使细菌菌悬液最终浓度为1×10⁶ CFU·mL⁻¹，平均划分3个加样区，打孔器均匀制备加样孔（直径约3 mm），分别加入0.1%的氯己定、PBS缓冲液及4 g·L⁻¹的十肽实验液各5 µL，培养24~48 h，ProtoCOL SR全自动抑菌环测量仪测量抑菌环直径大小，每种细菌设置6个平行对照组。

1.5.4. 最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定

实验分为阳性对照组（含0.1%氯己定的菌悬液培养基）、阴性对照组（含PBS的菌悬液培养基）、实验组（含不同浓度的十肽菌悬液培养基）。以上各组均设置3个平行组。使用液体稀释法对MIC和MBC进行测定，将浓度为4 g·L⁻¹的十肽实验液按对倍稀释溶于液体培养基中，使其终浓度为2 g·L⁻¹、 1 g·L⁻¹、500 µg·mL⁻¹、250 µg·mL⁻¹、125 µg·mL⁻¹、62.5 µg·mL⁻¹、31.3 µg·mL⁻¹、15.6 µg·mL⁻¹。浓度为2×10⁶ CFU·mL⁻¹菌悬液与各组药液按比例1∶1各100 µL，分别接种于无菌96孔板中，使菌悬液的终浓度为1×10⁶ CFU·mL⁻¹，置于适当的培养条件下培养24~48 h。在黑色背景下，凡肉眼观察微孔内液体清亮无浑浊或沉淀生长的最低药物浓度为十肽的MIC。用无菌接种环分别挑取肉眼观察无细菌生长的微孔板中的培养物20 µL，划线接种于固体培养基上，相同条件下培养，观察菌落数少于5~6个的最低浓度为最小杀菌浓度（MBC）值[2]–[3]。所有菌种的MIC测定实验重复3次。

1.5.5. 十肽对变异链球菌时间-杀菌曲线的测定

实验分为阳性对照组（含0.1%氯己定的TPY液体培养基）、阴性对照组（TPY液体培养基）、实验组（含MBC浓度的十肽的TPY液体培养基）。将200 µL的变异链球菌菌悬液分别加入实验组、阳性对照组及阴性对照组中，菌悬液与TPY液体培养基的比例为1︰9，变异链球菌的终浓度为1×10⁶ CFU·mL⁻¹，37 °C兼性厌氧培养，分别培养0、10、20、30 min，及1、2、4、8、24 h提取菌液。PBS缓冲液梯度稀释（0、10、100、1 000倍）后取50 µL菌悬液接种于TPY固体培养基上，培养24~48 h后计数菌落数。以时间为横坐标，菌落形成单位数（CFU·mL⁻¹）的对数值（log）为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。活菌计数减少99.9%即差异>3 log CFU·mL⁻¹者视为有杀菌作用，活菌计数下降1~3 log CFU·mL⁻¹者视为有抑菌作用[2],[4]。实验重复3次，取平均值。

1.6. 统计学分析

采用SPSS 13.0软件对抑菌环直径行配对t检验分析。

2. 结果

2.1. 十肽的合成分析结果

质谱分析十肽相对分子质量为1 249.958，与理论相对分子质量的1 249.7基本一致，误差小于2‰。高效液相色谱分析十肽纯度为98.22%。

2.2. 琼脂扩散法结果

琼脂扩散实验表明，实验组培养基中均显示出较明显的抑菌环，经测量抑菌环直径及配对t检验分析表明：同阳性对照组相比，变异链球菌、嗜酸乳杆菌、血链球菌、格氏链球菌及内氏放线菌组的抑菌环直径大小差异无统计学意义（P>0.05），表明4 g·L⁻¹的十肽与0.1%氯己定对上述5种细菌的抑菌效果接近；表兄链球菌、黏性放线菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、中间普雷沃菌、伴放线放线杆菌及白色假丝酵母菌组的抑菌环直径大小差异有统计学意义（P<0.05），表明0.1%氯己定对上述7种细菌的抑菌效果优于4 g·L⁻¹的十肽（表1）。

表 1. 十肽和0.1%氯己定对实验细菌的抑菌环直径大小及配对t检验结果.

Tab 1 Antimicrobial ring diameter of decapeptide and 0.1% chlorhexidine against tested bacterial and results of t test

菌种	阳性对照组/mm	实验组/mm	t值	P值
变异链球菌	20.91±0.82	20.74±0.71	0.464	>0.05
表兄链球菌	23.61±0.59	15.41±0.84	21.918	<0.05
嗜酸乳杆菌	18.23±0.38	17.64±0.57	1.738	>0.05
血链球菌	11.97±0.57	11.57±0.44	2.484	>0.05
格氏链球菌	16.43±0.71	15.36±0.95	1.769	>0.05
内氏放线菌	13.99±0.72	12.08±1.18	1.633	>0.05
黏性放线菌	22.26±1.13	17.53±0.83	6.667	<0.05
牙龈卟啉单胞菌	17.50±0.69	9.17±0.75	17.589	<0.05
具核梭杆菌	21.60±0.96	15.91±0.88	10.060	<0.05
中间普雷沃菌	23.56±0.71	8.88±0.71	29.241	<0.05
伴放线放线杆菌	17.48±0.75	12.24±0.75	25.565	<0.05
白色假丝酵母菌	13.44±0.76	11.54±0.91	18.800	<0.05

2.3. MIC和MBC的测定

十肽对口腔感染性疾病主要致病菌的MIC及MBC值见表2。由表2可见，十肽对大部分兼性厌氧菌的MIC值为62.5~125 µg·mL⁻¹，专性厌氧菌的MIC值为250~1 000 µg·mL⁻¹，白色假丝酵母菌的MIC值为250 µg·mL⁻¹。受试菌MBC值均大于MIC值。其中，十肽对变异链球菌和嗜酸乳杆菌的抑菌效果最为显著，表明十肽对受试菌有稳定的抑制作用，且随着十肽浓度增加，抑菌效果更好。

表 2. 十肽对口腔感染性疾病主要致病菌的MIC和MBC值.

Tab 2 MIC and MBC of decapeptide against oral pathogenic bacteria

菌种	MIC值	MBC值
变异链球菌	62.5	125
表兄链球菌	125	500
嗜酸乳杆菌	62.5	125
血链球菌	250	2 000
格氏链球菌	500	2 000
内氏放线菌	125	250
黏性放线菌	125	500
牙龈卟啉单胞菌	1 000	2 000
中间普雷沃菌	1 000	>2 000
具核梭杆菌	250	1 000
伴放线放线杆菌	500	2 000
白色假丝酵母菌	250	1 000

µg·mL⁻¹

2.4. 十肽对变异链球菌时间-杀菌曲线的测定

十肽对变异链球菌的时间-杀菌曲线见图1。由图1可见，阴性对照组在24 h之内细菌的数量呈稳定增长趋势，阳性对照组在10 min后完全杀灭细菌。MBC浓度的十肽在10 min内就能够减少变异链球菌的数量，20 min后可达到杀菌效果，30 min之后可完全杀灭细菌。

图 1. 十肽对变异链球菌的时间-杀菌曲线.

Fig 1 Effect of decapeptide on the time-kill curves for S. mutans

3. 讨论

抗菌肽是一类对抗外界病原体感染的肽类活性物质，它们多为12~50个氨基酸组成的短肽[5]。抗菌肽最重要、最引人关注的生物学活性是其高效广谱的抗微生物活性，其抗菌作用具有以下特点：抗菌谱广，对革兰阳性、阴性菌都表现出较强的抗菌作用；杀菌快速；不易产生耐药性，已经在临床上得到广泛应用。抗菌肽的杀菌方式多种多样，主要作用机制包括：细胞膜攻击作用、线粒体攻击作用、对染色体的破坏作用、干扰细菌代谢或直接作用于胞浆成分、促进调亡相关蛋白及配体的表达、影响DNA的复制和转录[6]–[7]。但是，人们对其确切的杀菌机制尚缺乏足够的认识。

在多肽菌库中，新型抗菌肽十肽被证明有较强的抗菌作用。体外细胞毒性实验表明，当十肽的浓度增加到1 g·L⁻¹的高浓度时也不会导致人牙龈成纤维细胞死亡且仍能使细胞膜保持较完整的结构。研究进一步证明十肽的作用只针对原核生物界，对哺乳动物细胞并无毒性[8]。研究[9]发现十肽对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、普通变形杆菌、耻垢分支杆菌、白喉杆菌、弗氏志贺菌等都有较强的抑菌杀菌作用，并且主要是通过改变细菌生物膜上的结构实现的。进一步研究发现在利用双重的流动细胞系统技术构建人工合成的生物膜中，十肽作用后能使成熟的生物膜断裂，以有效地阻滞早期牙菌斑生物膜的形成，提示在传统的牙膏中加入十肽可能会通过阻断牙菌斑的形成从而抑制龋病的发生。在以往对十肽作用机制的研究中发现，由于十肽具有阳离子残基及亲水性的特性，认为它的抗菌机制可能是：十肽的双亲性α-螺旋结构上的正电荷与细菌细胞膜上负电荷之间通过静电吸引而结合并聚集在质膜上，打乱了质膜上的脂质和蛋白质原有的排列秩序，从而导致细胞膜的结构紊乱，最后杀灭细菌。但是其确切的抑菌机制尚不清楚[4],[10]–[12]。

本实验依据十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法体外合成十肽。此法的基本过程是：将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。该法节省了分离纯化的时间，反应效率高，产物纯度高。十肽合成后，通过高效液相色谱检测其纯度。以往研究表明抗菌肽的纯度大于80%即可以发挥抑菌作用。本次实验合成十肽的纯度高于98%，既保证了十肽本身的抑菌性能，又基本排除了杂质对实验的干扰，保证了实验的科学性。

本实验采用美国国立临床实验室标准化委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）推荐的药物敏感试验琼脂扩散法观测十肽对实验菌株抑菌环大小，实验中使用全自动抑菌环测量仪测量抑菌环直径大小，在一定程度上避免了人工测量引起的误差，具有一定的实用性。为了进一步测试实验菌株对十肽的敏感性，本实验使用了敏感的液体稀释法观测十肽的抑菌性能，方法易于掌握，结果重复性好。结果表明：十肽对口腔常见致龋菌的MIC为62.5~500 µg·mL⁻¹，该结果与Concannon等[13]的研究有一定的区别。这可能与所选用的菌悬液浓度及所选菌种不同有关，本实验选用的实验菌株均为四川大学华西口腔医学院微生物实验室保存的标准菌株，实验中并未选择临床菌株，旨在对十肽对口腔细菌的抗菌性能进行初步评价，筛选出抑菌效果最好的菌株进行后续研究。此外，本实验还评价了十肽对牙周病主要致病菌的影响，研究结果表明十肽对革兰阴性专性厌氧菌也表现出较明显的抑制作用，但其抑菌性弱于主要致龋菌，造成十肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌的不同抑菌性能的机制目前尚不清楚。但是以往的研究结果发现，由于十肽具有阳离子残基及亲水性，它的抗菌机制可能主要包括静电学说、氢键或与细菌生物膜表面的膜受体的疏水性作用，进而破坏细菌生物膜，因此，本课题组将对这种抑菌机制的差异及十肽对口腔主要致龋菌生物膜生长的影响进行深入的研究。时间-杀菌曲线是一项评价抗菌药抗菌活性的实验，用这种方法可以评价抗菌药物抗菌效力的强弱，为临床择药提供依据。通过观察十肽对变异链球菌生长的时间-杀菌曲线发现，十肽作用20 min后开始杀菌，30 min之后可完全杀灭细菌，且在24 h之内无细菌生长。研究证明十肽能在较短时间内杀灭变异链球菌，并提示十肽可能具有抗生素后效应（即指细菌与抗生素或抗菌药物，经短时间接触，将残留抗生素清除后，细菌生长仍受抑制的生物现象）。由此研究结果推测，将来临床应用中将十肽用于口内局部用药，通过短时间的药物接触后能持续抑制口腔变异链球菌生长，可能初步达到防龋目的。

Funding Statement

[基金项目] 四川省科技支撑计划基金资助项目（2008FZ0173）