一个掌跖角化-牙周破坏综合征患者家系组织蛋白酶C基因突变分析

Abstract

目的

对一个掌跖角化-牙周破坏综合征（PLS）患者及其家系组织蛋白酶C基因（CTSC）突变位点进行分析，探讨PLS的分子致病机制。

方法

提取1例PLS先证者及其直系血亲（父母、弟弟）的基因组DNA，应用聚合酶链反应和DNA直接测序技术分析先证者及其直系血亲CTSC基因的突变情况。

结果

PLS先证者CTSC基因存在复合型杂合突变。先证者位于外显子6的第800位碱基发生了一个杂合错义突变，该碱基对中的碱基T被C取代（c.800T>C），其编码的氨基酸由亮氨酸改变为脯氨酸（p.L267P）；位于外显子7的第1015位碱基发生了一个杂合错义突变，该碱基对中的碱基C被T取代（c.1015C>T），其编码的氨基酸由精氨酸改变为半胱氨酸（p.R339C）。其中，c.800T>C来自母亲，c.1015C>T来自父亲，弟弟的CTSC基因未见突变。

结论

PLS的临床表征与CTSC基因突变有关。

掌跖角化-牙周破坏综合征（Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）于1924年由Papillon与Lefèvre首次报道[1]，是一种常染色体隐性遗传性疾病，患病率为百万分之一至百万分之四，约1/3有近亲婚配史[2]。PLS的临床特征是快速性的早期牙周组织破坏，肘部、膝盖、掌跖部位的皮肤过度角化。男女发病率相似，无种族差异[3]，常致乳牙和恒牙过早脱落。PLS主要由组织蛋白酶C（cathepsin C，CTSC）基因突变引起，导致CTSC功能丧失，引起免疫调节紊乱继而发生严重的炎症反应[4]。本研究对临床确诊的一个掌跖角化-牙周破坏综合征患者的家系进行了CTSC基因分析。

1. 材料和方法

1.1. 研究对象

先证者为一名临床确诊为PLS的患儿，男，11岁，2017年6月因多牙松动、部分脱落、前牙牙龈肿痛就诊。该患儿恒牙列，卫生状况差，牙石（++），前牙区牙龈红肿，质地松软，探诊易出血，探诊深度为3~10 mm。16、12、11、21、22、26、32、42、46牙Ⅲ度松动，36牙Ⅱ度松动；31、41牙缺失，下颌缺失牙区牙槽嵴低平；牙体发育未见明显异常，无龋坏（图1）。全景片显示全口牙槽骨广泛性吸收，根尖孔尚未形成的牙齿及牙胚牙槽骨均未见明显牙槽骨吸收（图2）。患儿发育一般，智力正常。手掌、脚掌、肘部、膝盖的皮肤过度角化、皲裂、脱屑，病损厚度不均，呈鱼鳞状（图3）；双侧膝关节皮损累及大腿根部，耳前区见轻度脱屑，指甲、手背、脚背无明显异常。无多汗及臭汗。家系追溯3代，现存22人（图4），患者父母无近亲结婚史，了解相关病史，对各家系成员进行全身及牙周专科检查，仅发现先证者一人受累。先证者共有直系血亲3人，包括父亲、母亲及一同胞弟弟，3人的牙周及全身检查结果均显示无侵袭性牙周炎及掌跖角化症状。

图 1. 患者初诊时口内照.

Fig 1 Intraoral view of propositus at the baseline

A：正面观；B：右侧位观；C：左侧位观。

图 2. 患者初诊时的全景片.

Fig 2 Panoramic radiograph of propositus at the baseline

图 3. 患者手掌、脚掌、肘部、膝盖皮肤过度角化、皲裂、脱屑，呈鱼鳞状.

Fig 3 Bilaterally symmetrical hyperkeratotic plaques over hands and feet which have involved dorsal aspects of hands, feet, elbow and knee skin

A：手掌；B：脚掌；C：肘部；D：膝盖。

图 4. 患者3代家系图.

Fig 4 Family tree of three generations of propositus

1.2. 方法

1.2.1. 基因组DNA的提取

因该PLS家系仅患儿一名先证者，故选择先证者及其直系血亲作为实验对象。取得受试者知情同意后，抽取外周静脉血各4 mL，EDTA抗凝，使用血液DNA提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取基因组DNA。

1.2.2. 引物设计和合成

参照Toomes等[5]和Hart等[6]关于CTSC基因1~7外显子引物设计方案设计引物，并用NCBI网站上的Primer-BLAST进行引物特异性比对。引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表 1. CTSC基因PCR扩增引物及PCR产物特征.

Tab 1 CTSC gene PCR amplimer and PCR characteristic product

引物名称	引物序列	产物长度/bp
外显子1	F：5′-TCCAGTTGCAGCCAAGTGAG-3′	536
	R：5′-GGTCCCCGAATCCAGTCAA-3′
外显子2	F：5′-CTCAAACTGGGTAGCATGAAAGG-3′	381
	R：5′-GGTGTCAATTCCGGTCATCTTC-3′
外显子3	F：5′-ACCTCTCAGGGTGAAGTTTTTGTT-3′	424
	R：5′-TTTTACATAGCATGCCTAATATTTCT-3′
外显子4	F：5′-ACCACTTTCCACTTAGGCACAGA-3′	343
	R：5′-GGCGAGCAACACTGGTAGGA-3′
外显子5	F：5′-CAGGTGCTCTGGGTCTGAATCTA-3′	352
	R：5′-ATCATGCCCATTCCATCTAGGTAT-3′
外显子6	F：5′-TGTTAGTTGAGTCTTCTTATTGTGCT-3′	415
	R：5′-GCCAGACTTGCACTCAGATTTT-3′
外显子7	1F：5′-TAGAAGGAGGATGAAAGGATAGTTA-3′	699
	1R：5′-CTGGAAGGCATACCCTACAATT-3′
	2F：5′-CTGGGGTGAGAATGGCTACTT-3′	659
	2R：5′-CTCCCTGTCATAAAGGTTCATAGTT-3′

1.2.3. 聚合酶链反应（polymerase

chain reaction，PCR） PCR反应体系为25 µL体系，包括10×PCR Buffer 1 µL 10 mmol·L^-1，dNTP 0.5 µL 10 µmol·L^-1，上游引物0.5 µL 10 µmol·L^-1，下游引物0.5 µL 5 U·µL^-1，Taq酶0.2 µL，ddH₂O 20 µL，模板DNA 1 µL。PCR反应条件：95 °C预变性3 min，94 °C变性30 s，按外显子的退火温度58 °C退火30 s，72 °C延伸30~60 s，35个循环后于72 °C再延伸10 min。反应在PCR仪（Verity 96well，美国ABI公司）上进行。

1.2.4. DNA直接测序

纯化后的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，外显子使用PCR扩增引物，测序结果与人类基因组中的CTSC基因序列进行对比，分析先证者及其直系血亲CTSC基因的突变情况。

2. 结果

患者及其父母、弟弟的CTSC基因外显子1~5均未发现基因突变，表现为正常序列，基因外显子6和7发生了错义突变。

2.1. CTSC基因外显子6的错义突变

患者位于外显子6的第800位碱基发生了一个杂合错义突变，该碱基对中的碱基T被C取代（c.800T>C）（图5A），与之相对应的第267位氨基酸密码子由CTA改变为CCA，其编码的氨基酸由亮氨酸改变为脯氨酸（p.L267P）。先证者的母亲在外显子6的第800位碱基也发生了一个与先证者相同的杂合突变（图5B），先证者的父亲及弟弟均未在外显子6上发生突变（图5C、D）。

图 5. CTSC基因外显子6测序.

Fig 5 Sequencing of exon 6 of CTSC gene

A：患者；B：患者母亲；C：患者父亲；D：患者弟弟。A、B中箭头指示患者及其母亲c.800T>C杂合突变位点；C、D中箭头指示其父亲及弟弟c.800T正常序列。

2.2. CTSC基因外显子7的错义突变

患者位于外显子7的第1015位碱基发生了一个杂合错义突变，该碱基对中的碱基C被T取代（c.1015C>T）（图6A），与之相对应的第339位氨基酸密码子由CGT改变为TGT，其编码的氨基酸由精氨酸改变为半胱氨酸（p.R339C）。先证者的父亲于外显子7的第1015位碱基也发生了一个与先证者相同的杂合突变（图6B），先证者的母亲及弟弟均未在外显子7的第1015位碱基上发生突变（图6C、D），但其母亲及弟弟均在外显子7上的第1173位碱基发生杂合同义突变，该碱基对中的碱基T被G取代，与之相对应的第391位氨基酸密码子由ACT变为ACG，但编码的氨基酸仍为苏氨酸，未发生改变。

图 6. CTSC基因外显子7测序.

Fig 6 Sequencing of exon 7 of CTSC gene

A：患者；B：患者父亲；C：患者母亲；D：患者弟弟。A、B箭头指示患者及其父亲c.1015C>T杂合突变位点；C、D箭头指示患者母亲及弟弟c.1015C正常序列。

由此可见，PLS先证者CTSC基因存在复合型杂合突变，突变位点是外显子6上的c.800T>C和外显子7上的c.1015C>T。c.800T>C来自母亲，c.1015C>T来自父亲，而弟弟未见此改变。

3. 讨论

PLS属于常染色体隐性遗传性疾病，位于常染色体11q14.2的CTSC基因突变是PLS的致病基础。PLS常导致乳牙和恒牙过早脱落及掌跖部位皮肤过度角化，皮肤部位的损害在冬天有加重趋势[7]。但在一些病例报道中，第三磨牙可幸免于牙周破坏[8]。除这两个典型临床表现外，还可伴发其他的全身疾病。其中，以反复感染为多，主要表现为脓皮病、肝脓肿，还有报道伴有黄色肉芽肿性肾盂肾炎及无症状硬脑膜异位钙化[9]。

目前，全球共报告了70多种CTSC基因突变型与PLS有关，其中无义突变约占致病性CTSC突变的23%，大多数突变位于外显子5和外显子7上[10]。在CTSC基因突变类型中，以纯合突变或纯合子突变合并杂合突变为主，目前尚不能确定CTSC基因是否有特异性突变。在我国，有关CTSC基因突变的报道不多，突变包括以下位点：c.116delG、c.415G>A、c.748C>T、c.763T>A、c.774C>G、c.778T>C、c.941T>C、c.1005A>C、c.1015C>T、c.1040A>G[11]–[13]。本研究发现了c.800T>C突变位点，目前在NCBI人类基因库中暂未发现c.800T存在单核苷酸多态性，这可能是CTSC基因的新突变位点。c.800T和c.1015C都位于CTSC基因的高度保守序列[14]，本例患者是由两个杂合突变组合成的复合突变，c.800T>C导致第267位氨基酸密码子CTA改变为CCA，转录过程中脯氨酸替换正常序列中的亮氨酸（p.L267P）。c.1015C>T导致第339位氨基酸密码子CGT改变为TGT，转录过程中半胱氨酸替换正常序列中的精氨酸（p.R339C）。虽然目前的研究显示CTSC基因突变导致其编码的蛋白质异常是引起PLS的主要原因，但PLS的病因学仍不清楚，对皮肤病损和牙龈病变二者的关系也不确定。本实验中先证者的2个新突变可能改变了肽链的结构，影响肽链的折叠和组装，妨碍CTSC功能蛋白质的形成，改变了CTSC基因编码的蛋白质结构，降低甚至是抑制了CTSC的活性，影响了免疫反应，引起了疾病的显型。

CTSC在中性粒细胞、具有细胞毒性的淋巴细胞、自然杀伤细胞、牙槽骨内巨噬细胞以及肥大细胞等免疫细胞中表达较高，可以活化中性粒细胞衍生的丝氨酸蛋白酶和粒酶，影响免疫反应[15]。由于CTSC基因突变引起的免疫紊乱增加了PLS患者的炎症易感性，致使PLS患者更容易发生严重的炎症性疾病[16]。先证者存在乳牙早脱、萌出恒牙早发性重度牙周炎及明显的掌跖部位过度角化的临床表现，与上述推测符合。

学者[17]就CTSC基因的突变位点及类型与PLS患者的临床表型之间的关系进行了研究，结果显示：PLS患者致病基因的遗传异质性低、等位基因异质性高，即PLS的致病基因仅是CTSC基因，CTSC基因发生不同类型的突变产生多种异常表型的概率高；PLS患者显著的表型异质性与特别的基因突变类型间无确切联系，但可能与一些附加基因的修饰和后天环境因素的影响有关。PLS需与Haim-Munk综合征相鉴别，Haim-Munk综合征是一种极罕见的常染色体隐性遗传性疾病，亦与CTSC基因突变有关，临床表现除有掌跖过度角化和牙周组织破坏外，还有肢端骨质溶解症及蜘蛛样细长指（趾），有时也有特征性的甲弯曲和扁平足[18]。

目前对PLS还没有明确的治疗方法，常规的治疗措施可以控制牙周病：1）口腔卫生宣教，指导患者保持良好的口腔卫生；2）常规牙周治疗，通过对特定牙周微生物的鉴定，使用特定抗生素降低口腔病原微生物的数量，及时拔除无保留价值的患牙，延长余牙使用寿命；3）在牙周炎活跃期，给予系统抗生素以保护牙齿，防止菌血症和肝脓肿；4）对缺失的牙齿进行牙周、外科、修复、正畸联合治疗，保留恒牙，维持颌间间隙，恢复咀嚼功能[19]。对皮肤部位的治疗，有报道[20]服用维生素A类药物及局部涂拭水杨酸、润肤剂可以缓解PLS患者的皮肤角化。

本研究对一个PLS家系的CTSC基因的外显子1~7进行了测序分析，发现患者的父母分别存在c.800T>C、c.1015C>T的杂合突变。经询问，患者的父母及其3代以内并无血缘关系，说明该基因突变在我国的人群中有一定的频率。鉴于PLS是常染色体隐性遗传病，避免近亲结婚可能降低其发病频率。另外，研究[21]观察，PLS患者的牙周炎症在青少年时期达到顶峰，之后牙周炎症反应随着年龄增长而降低。牙周炎症反应的改变与血清IgE含量变化一致，控制IgE水平有可能作为降低PLS牙周炎症的一个目标。CTSC基因检测可作为一种筛查手段，增大早期发现PLS的机率，及早确定PLS的病因和致病机制，对症治疗。采用基因治疗的方法纠正或补偿CTSC基因的异常和缺陷，有望打破PLS治疗方面的困境。

Funding Statement

[基金项目] 江西省自然科学基金（2515BAB205095）

Supported by: Natural Science Foundation of Jiangxi Province(2515BAB205095).