腺病毒介导的人端粒酶反转录酶牙周膜细胞系的建立

Abstract

目的

通过腺病毒法建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的牙周膜细胞系，以构建腺病毒介导的高效、稳定的hTERT牙周膜细胞系。

方法

聚合酶链反应（PCR）法扩增hTERT基因编码序列，构建同源重组腺病毒质粒pAd-pshuttle-cmv-hTERT，收集腺病毒颗粒后感染人牙周膜细胞，实时荧光定量PCR检测hTERT及成骨相关基因碱性磷酸酶、核心结合因子2、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达水平，茜素红染色观察成骨分化能力，CCK-8检测细胞增殖能力。

结果

成功构建了含hTERT基因的腺病毒颗粒并感染牙周膜细胞，感染细胞与正常牙周膜细胞形态相似；实时荧光定量PCR结果显示hTERT及成骨相关基因在感染细胞中高表达；茜素红染色显示牙周膜细胞系成骨能力强；CCK-8结果示牙周膜细胞系增殖能力强。

结论

通过腺病毒法成功建立了过表达hTERT的人牙周膜细胞系，其具有较强的成骨分化能力，这为研究牙周膜再生机制提供了一个理想的细胞系。

牙周膜是连接牙骨质和牙槽骨的结缔组织，牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）中有多种细胞群体，主要有成纤维细胞、成牙骨质细胞、造骨细胞、内皮细胞、Malaseez上皮细胞、破骨细胞等。近年来的研究[1]–[2]发现，PDLCs中有类似间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）功能的细胞，能在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞及神经样细胞，使牙周组织的再生成为可能，遗憾的是牙周膜的再生机制尚不明晰。牙周膜的再生研究方面，主要受限于原代PDLCs的传代培养会降低细胞的分化潜能，并失去原代特性，比如不同代数牙周膜的成骨分化能力差异非常大[3]。所以建立与原代PDLCs表型和生长特性相同、并能稳定传代的PDLCs细胞系，为牙周膜再生机制的研究提供细胞平台，具有着重大的意义。

构建保留原代细胞特征的稳定的人PDLCs细胞系存在诸多难点。Kamata等[4]通过共转染人端粒酶反转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）和人乳头状瘤细胞病毒16成功构建了人PDLCs系，但这些细胞失去了钙化潜能。本课题组在前期研究中发现，通过导入各种抑癌基因以期构建稳定的细胞系时，细胞的形态、生长状态都可能发生改变。hTERT是细胞内的正常基因，诱导端粒长度伸长并延伸体细胞的复制寿命，相对于传统的永生化基因，端粒酶转染建立的细胞系是正常细胞而非转化细胞，具有正常的核型和生长速度[5]。

研究[6]表明，通过慢病毒过表达hTERT可以构建PDLCs细胞系，但hTERT基因片段大，重组病毒的滴度不高，表达hTERT效率低，效果不理想。重组腺病毒是比较高效和可靠的重组病毒表达系统之一，其病毒滴度高，可以更有效地介导hTERT的表达。因此，本研究目的是通过腺病毒介导过表达hTERT建立稳定的PDLCs细胞系，探索构建与原代PDLCs相同的PDLCs细胞系的高效、简便的方法，为牙周膜再生机制的研究提供细胞平台，同时也为牙周病的治疗奠定一定的研究基础。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂

Rochel反转录试剂盒（Rochel公司，美国），Platinum Pfx DNA Polymerase高保真DNA聚合酶（Invitrogen公司，美国），限制性内切酶（New England Biolab公司，美国），GeneJet聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）纯化、胶回收试剂盒（Thermo Scientific™公司，美国），质粒小量提取试剂盒（OMEGA公司，美国），RNeasy Mini Kit试剂盒（Qiagen公司，德国），FuGENE6 Transfection Reagen转染试剂盒（Promega公司，美国），α-MEM、胎牛血清（fetal bovine serum）（Gibco公司，美国），BJ5183感受态（北京华越洋生物科技有限公司），质粒pAd-Easy-1和质粒pshuttlecmv（Agilent Technologies，美国），上下游引物合成及DNA测序由北京华大基因公司完成，CCK-8试剂（东仁化学科技上海有限公司）。

1.2. 人正常PDLCs的分离和培养

本研究由兰州大学伦理委员会审批。在患者知情同意下，选取兰州大学口腔医院正畸减数拔牙患者上颌第一前磨牙，PBS冲洗5遍，刮取根中1/3牙周膜，Ⅱ型胶原酶及dispase酶混合液于37 °C温箱中消化30 min，每10 min震荡1次。800 r·min^-1离心5 min，弃上清，PBS吹打冲洗3遍，α-MEM培养液培养，7 d后见细胞贴壁。

1.3. 腺病毒颗粒获得

1.3.1. pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建

根据NCBI（NM_198253.2）hTERT基因cDNA序列设计引物，上游引物：5′-CTAGGGTACCATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3′；下游引物：5′-CTAGAAGCTTTCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTCT-3′。其中在上游引物添加了HindⅢ酶切位点及保护碱基，在下游引物添加了KpnⅠ酶切位点及保护碱基。参照高保真DNA聚合酶Platinum Pfx DNA Polymerase说明书，PCR特异性扩增hTERT基因编码序列。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果，得到大小约为3.3 kb条带。限制性内切酶HindⅢ及KpnⅠ双酶切hTERT和质粒pshuttle-cmv，酶切产物胶回收，T4连接酶连接，连接产物转化Trans-T1感受态细胞，使用质粒小量提取试剂盒说明书抽提质粒，用PmeⅠ酶切鉴定，将鉴定为阳性的质粒送北京华大基因公司测序。

1.3.2. BJ5183/p超级感受态的制备

热激法将质粒pAd-Easy-1转化BJ5183感受态，涂氨苄霉素琼脂板，12 h后挑取单克隆，采用Inoue方法制备含pAd-Easy-1的BJ5183超级感受态，命名为BJ5183/p。

1.3.3. 同源重组腺病毒质粒pAd-pshuttle-cmv-hTERT的构建

用PmeⅠ酶切pshuttle-cmv-hTERT质粒使其线性化，热激法转化超级感受态BJ5183/p，涂氨苄抗性琼脂板，12 h后挑取10个菌落较小的单克隆，扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒说明书抽提质粒，PacⅠ酶切鉴定，将重组成功质粒命名为pAd-pshuttle-cmv-hTERT，扩增。

1.3.4. 腺病毒颗粒收集

将生长状态好的293细胞按1︰3传代，第2天细胞生长达50%时按照FuGENE6 Transfection Reagen转染试剂盒说明书将重组质粒转染293细胞，7 d后将细胞及上清反复冻融3次后离心，收集上清，再感染293细胞，7 d后收集细胞上清，0.22 µm滤器过滤，分装冻存于-80 °C冰箱。

1.4. 腺病毒颗粒感染PDLCs

PDLCs传至第6代时，用腺病毒颗粒感染细胞。稳定传代后命名为PDL-PAD细胞。

1.5. 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测hTERT的表达

分别提取第6代PDLCs细胞、第15代PDL-PAD细胞及第35代PDL-PAD细胞RNA，按反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。基因引物设计如下。hTERT：上游引物5′-TCTGGGATGCGAACGGGC-3′，下游引物5′-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3′；GAPDH：上游引物5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′；下游引物5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′。按照Thermo Scientific DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit试剂盒说明书进行qPCR扩增，以第6代PDLCs细胞组为对照组，每个基因4个重复，其相对表达量均以GAPDH的量作为内参照，基因相对定量采用2^-ΔΔCt法计算。

1.6. qRT-PCR检测成骨相关基因的表达

分别提取第6代PDLCs细胞、第35代PDL-PAD细胞RNA，按反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。成骨相关基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、核心结合因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、骨桥素（osteopontin，OPN）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ，COLⅠ）的引物设计见表1。按照Thermo Scientific DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit 试剂盒说明书进行qPCR扩增，以第6代PDLCs细胞组为对照组。每个基因4个重复，其相对表达量均以GAPDH 的量作为内参照，基因相对定量采用2^-ΔΔCt法计算。

表 1. 成骨相关基因qRT-PCR的引物序列.

Tab 1 Primer sequences of qRT-PCR for osteogenic related gene

基因名称	引物序列
ALP	上游：5′-TCTGGGATGCGAACGGGC-3′
	下游：5′-TCCGGCTCAGGGGCAGC-3′
Runx2	上游：5′- CACTATCCAGCCACCTTTAC-3′
	下游：5′-ATCAGCGTCAACATC-3′
BSP	上游：5′-CATAGCCATCGTATCCTTGTCCT-3′
	下游：5′-CTATGGAGAGGACGCCACGCCTGG-3′
OC	上游：5′-GCAGAGTCCAGCAAAGGGTG-3′
	下游：5′-GTCAGCAACTCGTCACAG-3′
OPN	上游：5′-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3′
	下游：5′-GGTGATGTCCTCGTCTGTA-3′
COLⅠ	上游：5′-AGGGCTCCAACGAGATCGAGATCCG-3′
	下游：5′-TACAGGAAGCAGACAGGGCCAACGTCG-3′

1.7. 茜素红染色观察成骨分化能力

先配置含10 mmol·L^-1 β-甘油磷酸钠、50 µmol·L^-1抗坏血酸二磷酸盐，100 ηmol·L^-1地塞米松的α-MEM成骨诱导液。将第6代PDLCs细胞、第35代PDL-PAD细胞接种于6孔板中，每个样本3个重复。用成骨诱导液培养，每3 d换液，培养21 d。弃培养液，PBS洗3次后，用无水乙醇固定15 min，pH为4.1的茜素红染液染色10 min。

1.8. CCK-8检测细胞增殖能力

分别将第7代PDLCs细胞、第35代PDL-PAD细胞以每孔1×10⁴个的密度接种200 µL于96孔板，每种细胞3个重复组，分别于接种24、36、48 h时取一板细胞，各孔均加入20 µL CCK-8的培养液，在细胞培养箱孵育2 h，酶标仪在450 nm测定各孔吸光度（A）值。

2. 结果

2.1. hTERT重组质粒双酶切鉴定及测序

重组质粒pshuttle-cmv-hTERT经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后，可在3 kb处得到一条亮带（图1），将测序结果与NCBI数据库hTERT（NM_198253.2）cDNA序列进行对比分析，与目的序列一致。这表明重组腺病毒载体质粒pshuttle-cmv-hTERT构建成功。

图 1. pshuttle-cmv-hTERT双酶切鉴定.

Fig 1 Identification of pshuttle-cmv-hTERT by enzyme digestion

M：Marker；1、2：KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切质粒。

2.2. 同源重组腺病毒质粒酶切鉴定

pAd-pshuttle-cmv-hTERT同源重组质粒经PacⅠ酶切后在4.5 kb可见一条亮带（图2），证明腺病毒质粒同源重组成功。

图 2. pAd-pshuttle-cmv-hTERT同源重组质粒PacⅠ酶切.

Fig 2 Identification of recombinant pAd-pshuttle-cmv-hTERT plasmids by enzyme digestion

M：Marker；1、2：同源重组质粒PacⅠ酶切；3、4：同源重组腺病毒质粒；5：pshuttle-cmv-hTERT质粒PacⅠ酶切。

2.3. 转染后细胞形态及表型

倒置相差显微镜下观察，转染hTERT后的PDLCs与正常PDLCs形态相似，为长梭形，呈典型的纤维细胞特征。未转染细胞和转染空载体后的细胞传15~16代后生长缓慢，逐渐死亡，而转染hTERT后的PDLCs生长迅速，增殖稳定（图3）。

图 3. 转染前后细胞形态 倒置相差显微镜 × 100.

Fig 3 Morphological characteristics of cells before and after transfection inverted phase contrast microscope × 100

A：正常PDLCs；B：传代至第16代PDLCs；C：转染hTERT后第35代PDLCs。

2.4. qRT-PCR检测转染后PDLCs中hTERT的相对表达

qRT-PCR结果显示，hTERTmRNA在PDL-PAD中高表达，其表达水平是PDLCS的15~20倍（图4）。

图 4. qRT-PCR检测转染后PDLCs中hTERT的相对表达.

Fig 4 The relative expression of hTERT in infected cells measured by qRT-PCR

A：第6代PDLCs；B：第15代PDL-PAD；C：第35代PDL-PAD。

2.5. qRT-PCR检测转染后PDLCs中成骨相关基因的相对表达

qRT-PCR结果显示，ALP、Runx2、BSP、OC、COLⅠmRNA在PDL-PAD中的表达水平为PDLCs的4~7倍，而OPN mRNA的表达水平二者相似（图5）。

图 5. qRT-PCR检测转染后PDLCs中成骨相关基因的相对表达.

Fig 5 The relative expression of bone-related genes in infected cells measured by qRT-PCR

2.6. 茜素红染色观察成骨分化能力

茜素红染色结果显示，PDL-PAD较PDLCs形成更多矿化结节，有较强成骨能力（图6）。

图 6. 成骨分化 茜素红染色 × 100.

Fig 6 Osteogenesis differentiation alizarin red staining × 100

A：第7代PDLCs；B：第35代PDL-PAD。

2.7. CCK-8检测细胞增殖能力

CCK-8检测结果显示，PDL-PAD较PDLCs有更强的增殖能力（图7）。

图 7. CCK-8检测细胞增殖能力.

Fig 7 The cell proliferation detected by CCK-8

3. 讨论

牙周病是口腔疾病中危害最大、发病率最高的疾病之一，其与糖尿病、心血管疾病等多种全身性疾病的发生发展有正相关关系。牙周病治疗的目标是阻止疾病的发展并使受损组织再生。在牙周病的治疗中，除了基础治疗技术外，牙周膜再生治疗逐渐成为研究的热点。常规治疗如根面平整术、翻瓣术虽可控制牙周病的发展，然而不能实现完整的牙周再生。目前牙周再生的方法包括引导组织再生、骨移植、应用生长因子和宿主调节因子等，但生物安全性、长期效果和稳定性尚需改进[7]。因此，利用替代治疗实现可预测的牙周再生是非常迫切的。

PDLCs的再生能力为牙周再生提供了可能性，但PDLCs的再生机制尚不明晰。原代细胞由于生长受代数限制，不能系统地进行持续研究，因此建立与原代细胞具有相同或者相似生长性能、再生潜能的PDLCs细胞系，可为牙周病的治疗提供一定的实验基础。

本研究通过腺病毒过表达hTERT成功构建了PDLCs细胞系，qRT-PCR结果说明hTERT在细胞系中高表达，与正常细胞有显著性差异。正常PDLCs在传代至第16代时出现明显细胞衰老迹象，而过表达hTERT的PDLCs仍可以快速生长，连续传代，表明过表达hTERT的PDLCs系构建成功。这些细胞保留了原代PDLCs的特征，其形态学外观、基因表达和钙化沉积物的产生与原代细胞类似，因此能作为阐明牙周膜生物学再生机制的有力工具。

hTERT能使MSCs逃脱衰老，在离体增殖期间能增加MSCs的寿命。研究[8]表明，hTERT可以显著增强MSCs的增殖能力，且可增强其体外成骨能力。本研究构建的PDL-PAD中成骨基因ALP、Runx2、BSP、OC、COLⅠmRNA的表达明显增高，证实了hTERT可以上调某些成骨相关基因而加强细胞的成骨分化能力。

ALP是骨形成、代谢、再生等过程中的重要矿化酶，是成骨细胞早期分化的标志，可作为评价细胞骨分化的一项特征性指标[9]。 OC主要在矿化形成期出现，是成骨细胞成熟的标志；ALP及OC的表达程度可以反映骨的形成进程[10]。Runx2是成骨细胞开始分化的标志，诱导MSCs发育为成骨细胞或软骨细胞，是骨形成过程中最早和最具特异性的标志基因[11]。COLⅠ含量的高低与细胞骨形成能力的强弱相辅相成，可以作为成骨细胞分化能力的一个重要检测指标。BSP在成骨细胞的矿化过程中具有很重要的调节作用，可促进成骨细胞黏附，是成骨细胞诱导成功并具有矿化功能的重要指标[12]。OPN作为成骨细胞分化的早期标志，在骨基质矿化开始以后，成骨细胞中的OPN mRNA水平开始升高，OPN可以诱导成骨细胞分化，促进矿化组织重建[13]。

PDL-PAD中5个成骨标志基因ALP、RUNX2、BSP、OC、COLⅠmRNA的表达较正常PDLCs有明显增高，相对应的茜素红染色中PDL-PAD较正常PDLCs形成更多的矿化结节，所以这种细胞系有较强的成骨分化能力，这为研究牙周膜再生机制提供了一个更理想的细胞系。

本研究中，PDL-PAD细胞成骨标记基因OPN mRNA的表达与正常PDLCs接近，而并未像其他5个标记基因一样明显增大，这可能是由于OPN信号通路与其他基因信号通路不同，具体原因有待进一步研究。

综上，本研究组成功构建了腺病毒过表达hTERT基因的PDLCs系，这种细胞具有与原代细胞相似的性状，增殖能力更强，更重要的是这种细胞有更强的成骨分化能力，在应用于牙周膜再生机制的研究中有其独特的优势，为牙周膜再生治疗的研究提供了一种有力的工具。

Funding Statement

[基金项目] 甘肃省自然科学基金（17JR5RA217）

Supported by: The Natural Science Foundation of Gansu Province (17JR5RA217).