Abstract
目的
研究自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3（LC3B）和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在吸烟与不吸烟口腔白斑（OLK）患者中的表达情况及相互关系，探讨吸烟与OLK恶变潜能的关系。
方法
采用免疫组织化学法检测LC3B和mTOR在120例OLK组织中的表达，回顾性分析吸烟者与不吸烟者的临床资料，探讨吸烟与LC3B和mTOR表达及其与各临床因素之间的关系。
结果
吸烟与不吸烟OLK患者在性别、年龄、病变部位、病理分型及恶变情况均存在差异，LC3B在不吸烟组中的阳性率高于相应的吸烟组，而mTOR在吸烟组中的阳性率则高于相应的不吸烟组，差异均有统计学意义（P<0.05），吸烟情况与mTOR阳性率呈正相关（P<0.05），与LC3B的表达无明显相关性，LC3B与mTOR阳性表达率随吸烟情况的加重呈负相关（P<0.05）。
结论
吸烟对OLK的影响可能与自噬相关蛋白的表达有关。
Keywords: 微管相关蛋白1轻链3, 雷帕霉素靶蛋白, 吸烟, 口腔, 白斑
Abstract
Objective
This study aimed to investigate the expression patterns and relationship of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3B) and mammalian target of rapamycin (mTOR) in oral leukoplakia (OLK) in smokers and never-smokers. This work also analyzed the relationship between smoking and the carcinogenic potential of OLK.
Methods
Immunohistochemistry was used to detect the expression of LC3B and mTOR in 120 patients with OLK. Clinical data from 120 smokers and never-smokers with OLK were analyzed. Subsequently, the relationships among LC3B and mTOR expression, clinical factors, and smoking were analyzed.
Results
Smoking and nonsmoking patients with OLK differed in terms of gender, age, lesion location, pathological typing, and carcinogenic situation. The positive rate of LC3B in never-smokers was higher than that in smokers. Whereas the positive rate of mTOR in smokers was higher than that in the corresponding never-smokers, and the differences were statistically significant (P<0.05). Smoking was positively correlated with the positive rate of mTOR (P<0.05), and had no significant correlation with LC3B expression. The positive rates of LC3B and mTOR were negatively correlated with the intensity of smoking (P<0.05).
Conclusion
The effect of smoking habits on OLK may be linked to the expression of proteins that are directly associated with autophagy.
Keywords: microtubule-associated protein 1 light chain 3, mammalian target of rapamycin, smoking, oral cavity, leukoplakia
口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，世界范围内每年有超过300 000名患者。其发病率和死亡率均较高，5年生存率低于50%[1]–[2]，有效地诊断和治疗癌前病变对预防OSCC具有积极意义。口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是最常见的癌前病变，患病率为2.60%[3]。OLK形成是多因素导致的，最典型的病理改变为上皮异常增生，且随病变严重程度增加异常程度增大。目前已经明确吸烟在OLK的发生发展中扮演重要角色，然而，吸烟对OLK恶变进程的确切作用有待进一步阐明[4]–[6]。
近年来，一种与凋亡相似的生物现象——自噬引起了人们的关注。自噬活性的异常改变与肿瘤的发生、发展密切相关[7]。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是自噬体膜在形成过程中必不可少的基因，其模型LC3B的含量与自噬发生程度呈正相关，由于其自噬体及以往在OSCC中表达的特殊性常被选定为研究对象[8]用于衡量细胞自噬活性[9]。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在自噬通路中作为逆向调控者是负向调节细胞自噬的核心基因。本研究的目的在于利用免疫组织化学方法，从正启动及负反馈的双方向同时检测LC3B和mTOR在吸烟与不吸烟OLK患者组织中的表达及相互关系，并结合临床因素进行分析，探讨吸烟在OLK发生发展中的作用。
1. 材料和方法
1.1. 材料
1.1.1. 样本来源
收集2016年12月—2017年11月于湖南省长沙市湘雅口腔医院就诊患者的病理蜡块，确诊为OLK组织者120例，其中OLK单纯增生及轻、中、重度上皮异常增生各30例，采用回顾性分析患者的临床资料，包括性别、年龄、吸烟史（“吸烟”和“从不吸烟”）、吸烟情况（“吸烟数量”和“烟龄”）、病变部位以及恶变情况（截止到2018年6月）。所有患者术前均未使用激素治疗、化学治疗及放射治疗，且无自身系统性疾病。本研究获得中南大学湘雅二医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。
120例患者分为两组：1）吸烟组，曾经有吸烟经历者；2）不吸烟组，活检前从未主动吸过烟。吸烟组记录其吸烟情况，即每日吸烟数量和烟龄。两组（吸烟组和不吸烟组）患者根据组织病理学改变划分为“单纯增生”和“异常增生”，“异常增生”根据其恶变危险性划分为“轻度异常”和“中、重度异常”。根据吸烟和组织病理学改变，研究最终分为以下4组：1）吸烟单纯增生组；2）吸烟异常增生组；3）不吸烟单纯增生组；4）不吸烟异常增生组。
试剂
兔抗人LC3B多克隆抗体（ab48394）及兔抗人mTOR单克隆抗体（ab32028）均购自美国Abcam公司，稀释倍数分别为1∶300、1∶400。免疫组织化学Super Vision试剂盒（SV0002）购自武汉博士德生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自北京嘉美生物科技有限公司。
1.2. 实验方法
1.2.1. 免疫组织化学法检测LC3B和mTOR的表达
将石蜡标本3 µm连续切片，烘干，脱蜡至水，枸橼酸微波抗原修复，3%H2O2常温孵育30 min以避免内源性过氧化物酶活性干扰；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗，5%BSA封闭，加一抗，4 °C过夜，复温后PBS冲洗，滴加聚合辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗兔IgG， 37 °C孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。用已知的阳性照片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。
1.2.2. 免疫组织化学结果判定
由两人采用双盲法阅片，随机选取5个视野观察（×400），根据染色强度及阳性细胞百分比对染色结果进行半定量分析，结果取平均值。LC3B和mTOR均以细胞膜和（或）细胞质染成棕黄色为阳性细胞。A为染色强度，评分分别为0（无染色）、1（淡黄色）、2（黄色）、3（棕黄色）；B为阳性细胞百分比，评分分别为1（0~10%）、2（10%~50%）、3（50%~100%）。最后评分为：A×B。0~3分记为阴性，4分及以上记为阳性。
1.3. 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。采用卡方检验和Fisher确切概率法比较不同临床因素间及LC3B、mTOR表达的差异，通过Spearman相关性分析实现相关性检验，检验水准为双侧α=0.05。
2. 结果
2.1. 吸烟与临床因素
120例OLK患者中，吸烟者97例，不吸烟者23例，全部纳入研究。患者吸烟习惯与临床因素间的关系见表1：吸烟组，每天吸烟数量在OLK单纯增生和异常增生组的中位数分别为22支和26支，烟龄的中位数分别为28年和46年，所有吸烟者的烟龄均在10年以上。年龄方面，各组的中位年龄为48~66岁，吸烟组无论单纯增生还是异常增生，都以50岁以上者居多，不吸烟者以50岁以下者居多，差异均具有统计学意义（P<0.05）。从性别上看，不吸烟组比吸烟组女性患者更多，男性患者多集中于吸烟组中，差异均具有统计学意义（P<0.05）。从病变部位上看，吸烟组异常增生者及不吸烟组患者的舌与口底经常受累，而吸烟组单纯增生者其他部位发病更常见，差异具有统计学意义（P<0.05）。对于异常增生来说，吸烟者的病理分型更严重，集中在中、重度异常，而不吸烟者中以轻度居多，差异有统计学意义（P<0.05）。从恶变情况来看，吸烟者的恶变率高于不吸烟者，差异具有统计学意义（P<0.05）。
表 1. 患者吸烟情况与基本临床资料.
Tab 1 Smoking situation as reported by the patients and clinical data
| 临床因素 | 吸烟组 |
P值 | 不吸烟组 |
P值 | |||
| OLK单纯增生 | OLK异常增生 | OLK单纯增生 | OLK异常增生 | ||||
| （n=19） | （n=78） | （n=11） | （n=12） | ||||
| 吸烟数量/（支·天-1）* | 22（4~44） | 26（9~46） | |||||
| 烟龄/年* | 28（11~54） | 46（19~59） | |||||
| 年龄/岁* | 48（26~71） | 56（44~80） | 52（39~84） | 66（33~86） | |||
| ＜50 | 5（26.3） | 16（20.5） | 0.023F | 8（72.7） | 9（75.0） | 0.000b | |
| ≥50 | 14（73.7） | 62（79.5） | 3（27.3） | 3（25.0） | |||
| 性别 | 男 | 17（89.5） | 73（93.6） | 0.001F | 3（27.3） | 7（58.3） | 0.002b |
| 女 | 2（10.5） | 5（6.4） | 8（72.7） | 5（41.7） | |||
| 发病部位 | 舌及口底 | 7（36.8） | 69（88.5） | 0.026F | 9（81.8） | 7（58.3） | 0.024b |
| 其他 | 12（63.2） | 9（11.5） | 2（18.2） | 5（41.7） | |||
| 病理类型 | 轻度异常 | 21（26.9） | 9（75.0） | 0.003b | |||
| 中、重度异常 | 57（73.1） | 3（25.0） | |||||
| 恶变与否 | 是 | 13（68.4） | 56（71.8） | 0.021F | 2（18.2） | 4（33.3） | 0.009b |
| 否 | 6（31.6） | 22（28.2） | 9（81.8） | 8（66.7） | |||
注：F：吸烟单纯增生组与不吸烟单纯增生组经Fisher's确切概率法比较，P<0.05；b：不吸烟异常增生组与吸烟异常增生组比较，P<0.05；*：项目为中位数及范围，其余项目为例数及构成比。
2.2. 免疫组织化学情况
LC3B和mTOR的免疫组织化学染色见图1。LC3B阳性表达主要定位于细胞质及细胞核。不吸烟单纯增生者LC3B多呈阳性表达，且染色较深；吸烟异常增生者LC3B常见低表达，染色较浅；不吸烟异常增生和吸烟单纯增生者的LC3B染色强度一般，表达情况介于以上两组之间。mTOR阳性表达均位于细胞质中，在不吸烟单纯增生者中不表达或低表达，染色浅；在吸烟异常增生者中多为阳性表达，强染色；不吸烟异常增生与吸烟单纯增生者的染色和表达介于以上两组之间。
图 1. LC3B、mTOR在不同组织中的表达 免疫组织化学染色 × 400.
Fig 1 Expression of LC3B and mTOR in different tissues immunohistochemistry stain × 400
上：LC3B染色；下：mTOR染色；从左至右分别为不吸烟单纯增生、不吸烟异常增生、吸烟单纯增生、吸烟异常增生。
2.3. LC3B、mTOR表达与吸烟因素的关系
表2显示在单纯增生和异常增生组中，LC3B的阳性表达率在吸烟组均低于不吸烟组，而mTOR阳性表达率与之相反，在吸烟组中较高，且差异均有统计学意义（P<0.05）。对异常增生进行分组（表3），可以更明显地看到两种蛋白的表达差异，即在不吸烟组中，无论异常增生程度大小，LC3B阳性率均高于相应的吸烟组，且在轻度异常增生组中表达最高；mTOR在吸烟组中的阳性表达率均高于相应的不吸烟组，且在中、重度异常组最高，差异均有统计学意义（P<0.05）。
表 2. LC3B和mTOR在吸烟与不吸烟OLK患者不同组织中的表达.
Tab 2 Expression of LC3B and mTOR in different tissues in smokers and never-smokers of OLK patients
| 阳性表达 | 吸烟（n/%） |
不吸烟（n/%） |
P值 | ||
| OLK单纯增生（n=19） | OLK异常增生（n=78） | OLK单纯增生（n=11） | OLK异常增生（n=12） | ||
| LC3B | 15/78.9 | 45/57.7 | 10/90.9 | 9/75.0 | 0.024 |
| mTOR | 7/36.8 | 44/56.4 | 4/36.4 | 3/25.0 | 0.026 |
表 3. 异常增生分组中LC3B和mTOR表达情况.
Tab 3 Expression of LC3B and mTOR in dysplasia groups
| 阳性表达 | 吸烟（n/%） |
不吸烟（n/%） |
||
| OLK轻度异常增生（n=21） | OLK中、重度异常增生（n=57） | OLK轻度异常增生（n=9） | OLK中、重度异常增生（n=3） | |
| LC3B | 14/66.7 | 30/52.6 | 8/88.9 | 2/66.7 |
| mTOR | 9/42.9 | 34/59.6 | 3/33.3 | 1/33.3 |
在异常增生组内进行分析，每日吸烟数量与mTOR表达呈正相关（r=0.882，P=0.048），结果具有统计学意义（图2），而与LC3B的表达无明显相关性（r=-0.854，P=0.066）。烟龄与异常增生组LC3B、mTOR表达均无相关性，而将单纯增生纳入后发现，烟龄与mTOR阳性率存在正相关（r=0.945，P=0.015），结果有统计学意义（图3）。在吸烟数量与烟龄两因素中，LC3B与mTOR阳性率之间均呈负相关（吸烟数量因素，r=-0.975，P=0.005；烟龄因素，r=-0.973，P=0.005），结果均具有统计学意义（P<0.05）。
图 2. 吸烟数量与LC3B、mTOR表达相关性.
Fig 2 Correlation of number of cigarettes with expression of LC3B and mTOR
A：单纯增生+异常增生组LC3B阳性率；B：单纯增生+异常增生组mTOR阳性率；C：异常增生组LC3B阳性率；D：异常增生组mTOR阳性率。
图 3. 烟龄与LC3B、mTOR表达相关性.
Fig 3 Correlation of time of smoking with expression of LC3B and mTOR
A：异常增生组LC3B阳性率；B：异常增生组mTOR阳性率；C：单纯增生+异常增生组LC3B阳性率；D：单纯增生+异常增生组mTOR阳性率。
3. 讨论
本研究目的在于分析吸烟与不吸烟OLK患者不同病理类型中的临床因素，以及确定吸烟情况是否与LC3B、mTOR表达存在相关性。目前，吸烟已被证实与OLK的发生发展密切相关[10]，许多临床因素包括患者性别、年龄、发病部位等均可预测OLK恶变的可能性[11]。LC3B和mTOR在以往的研究中也被证实都与细胞自噬有关，它们的表达或缺失可能预示细胞恶变的潜能。研究其在OLK中的表达差异有助于探究口腔肿瘤的发生及恶变进程，对今后的治疗有深远影响。LC3B为LC3表达产物LC3A与磷脂酰乙醇胺结合形成的膜型，其含量与自噬发生程度正相关，被认为是判定自噬活性的特异性灵敏标志分子[12]。PI3K/AKT/mTOR通路是研究最多的一种癌前及致癌途径，该通路的过度激活与许多关键的癌症行为有关[13]，其中的关键基因mTOR能感受诸多信号的作用，为自噬功能的中心调控者，逆向调控自噬诱导及自噬体形成。尽管很多研究表明LC3B和mTOR在癌前病变与癌症中表达存在差异，本课题组以往研究[14]也证实LC3B低表达mTOR高表达预示OLK恶性程度增加，而对于其在OLK吸烟者与不吸烟者中的研究还少见报道。
分析本研究中吸烟组发现，每日吸烟数量与烟龄的中位数在异常增生组（26支，46年）高于单纯增生组（22支，28年），OLK患者的中位年龄在48~66岁，吸烟组中50岁以上者居多，不吸烟组50岁以下者偏多，而中位患病年龄则是不吸烟组高于相应的吸烟组。出现这种差异的原因，推测吸烟在诱发OLK的产生过程中，长期吸烟者口腔黏膜受灼伤，局部充血、水肿，起病较早，而烟草内毒性物质通过长期慢性刺激，使局部形成一种慢性炎症过程，机体产生防御性增生反应[15]，有可能导致病理进展时间相对延长，或者对于轻微的黏膜改变不易察觉，就诊年龄偏大。对于非吸烟者，正常黏膜相对敏感，轻微的不良刺激可能更容易诱发OLK，导致较早出现病理改变，而由于口腔黏膜长期处于正常的微环境下，缺少疾病诱发因子，其发病年龄可能会相对较晚。不吸烟组的女性患者较多，这与以往的报道一致[16]，是否可以考虑女性由于生理结构、激素水平等原因，对OLK有更明显的易患性，有待进一步证实。以往的研究中，舌与口底都是OLK高发部位，本研究中在不吸烟组以及吸烟的异常增生组中，舌与口底为常见发病部位，在吸烟单纯增生组中，其他部位更为易发，有报道[6]证实，牙龈和颊黏膜是其常发部位。同时，吸烟患者的OLK异常增生程度明显大于不吸烟者，中、重度增生更多，且吸烟患者恶变率显著高于不吸烟者，考虑吸烟在OLK恶变进程中起促进作用。值得注意的是，临床上遇到有吸烟习惯的早期OLK患者，应结合临床因素多加考虑其恶变风险。
本课题组以往的研究[14]表明，LC3B和mTOR表达与OLK增生程度有关（P<0.05），而与吸烟史无明显关系（P>0.05）。本实验对患者的吸烟情况进一步分层分析，结果发现：在吸烟异常增生组中，从mTOR的阳性率来看，吸烟数量的增加与细胞自噬水平直接相关；而在将单纯增生纳入研究之后，烟龄的增加与mTOR的阳性率也表现出正相关关系（r=0.945，P<0.05）；与LC3B的阳性率虽没有达到统计学意义，但已经非常接近（P=0.051），推测如果增加样本量，很可能出现阳性结果。在异常增生组内，无论是每日吸烟数量还是烟龄的增加，LC3B和mTOR的表达率都存在负相关，结果均有统计学意义。而将单纯增生纳入后，两种蛋白在烟龄方面的相关性消失，推测以上结果的产生原因，很可能是烟龄对于OLK进展的影响弱于每日吸烟数量，吸烟量增加，烟草内有害物质对口腔黏膜刺激加大，这种刺激对mTOR参与的PI3K/AKT/mTOR通路有更显著的激活作用，诱导细胞自噬活性降低。而烟龄诱导的自噬水平改变在OLK发生发展中可能属于早发事件，在OLK异常增生中，烟龄的增加对疾病进展的诱导作用减弱，或者由于吸烟者机体内产生某种适应性改变，对烟龄因素引起的微环境改变具有适应性。这种假设并没有在分子层面上进行验证，亟待更深入的研究证实。对于LC3B低表达mTOR高表达，两者共同提示无论是烟草的量还是作用时间增加，细胞自噬活性降低，组织恶性程度增大，危险性增高。因此，戒烟是防治OLK的重要手段。
综上，吸烟与不吸烟OLK患者在性别、年龄、病变部位、病理分型及恶变情况均存在着差异，自噬相关蛋白LC3B和mTOR很可能参与了吸烟诱导的OLK恶变进程，因此，临床上可以考虑综合患者临床因素与分子检测共同监测OLK恶变。在以往报道中，单独检测LC3B这一指标用以证明自噬活性，然而其表达升高，或许并不能明确是自噬水平的提高，也有可能是自噬之后的步骤被抑制，导致自噬泡含量升高，因此单独检测LC3B说服力不足。本研究联合检测发现LC3B表达缺失而mTOR过表达，共同提示随吸烟因素加入，组织恶性程度增加，自噬水平降低。本研究尚存在着局限性，一方面由于是回顾性研究，各临床参数分布不均，会发生各种偏倚；另一方面，纳入研究的样本量相对较小，也可能导致结果与实际存在偏差，但已经满足研究与检验的基本要求。未来，期待设计严谨、样本量充足的前瞻性研究，进而阐明吸烟对OLK自噬水平的影响，为临床及科研工作提供参考。
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