Abstract
目的
探讨牙周非手术治疗对伴二型糖尿病(T2DM)慢性牙周炎(CP)大鼠模型中血清白细胞介素6(IL-6)的表达及颈动脉血管壁的影响。
方法
将28只6周龄清洁级SD大鼠随机分为A组(正常对照组,7只)、B组(T2DM+CP组,21只),将B组按照不同干预措施随机分成B1(自然进程组)、B2(机械治疗组)、B3(机械治疗+盐酸米诺环素+抗生素组),用酶联免疫吸附测定法进行血清IL-6的测定,苏木精-伊红(HE)染色后光镜下观察颈动脉组织的病理变化。
结果
A组血管壁形态正常;B1组内皮细胞脱落消失,中膜弹性纤维排列紊乱,平滑肌组织局部坏死呈无定型颗粒,少量钙盐沉积,管壁增厚明显;B2、B3组内皮细胞脱落消失,中膜部分平滑肌细胞空泡变性,血管壁无明显增厚。B1组血清IL-6含量随时间持续升高,高于A组(P<0.001)。各干预组血清IL-6的含量在第一次干预后1周达到峰值,随后逐渐下降,在第二次干预后5周,B2、B3组均显著低于B1组(P<0.001)。
结论
对于伴有糖尿病的牙周炎大鼠,单纯牙周机械治疗在短期内可能会引起血清IL-6水平升高,远期疗效则可能会降低机体的炎症状态,且伴有颈动脉血管病变的改善;联合使用局部及全身抗生素可能优化其疗效。
Keywords: 慢性牙周炎, 二型糖尿病, 白细胞介素6, 颈动脉血管壁, 牙周非手术治疗
Abstract
Objective
To study the effect of periodontal non-surgical treatment on serum interleukin-6 (IL-6) expression and carotid vascular wall in a rat model of chronic periodontitis (CP) with type 2 diabetes mellitus (T2DM).
Methods
Twenty-eight 6-week-old SD rats were randomly divided into group A (control group, 7 rats) and group B (T2DM+CP group, 21 rats). According to different intervention measures, group B was randomly subdivided into B1 (natural process), B2 (periodontal mechanical treatment), and B3 (periodontal mechanical treatment + 2% minocycline hydrochloride + systemic metronidazole plus amoxicillin). Serum IL-6 was measured by enzyme-linked immunosorbent assay, and carotid tissue was observed under light microscopy after hematoxylin-eosin (HE) staining.
Results
The carotid artery wall of group A was normal. In group B1, the endothelial cells disappeared, the elastic fibers of the middle membrane were disordered, the local necrosis of smooth muscle tissue was amorphous particles, a small amount of calcium salt was deposited, and the wall thickening was obvious. The endothelial cells in groups B2 and B3 disappeared, and the smooth muscle cells in the middle membrane underwent denaturation. No significant thickening of the vessel wall was noted. The serum IL-6 level in group B1 continually increased with time, and it was higher than that in group A (P<0.001). The IL-6 levels of groups B2 and B3 peaked a week after the first intervention. Subsequently, IL-6 levels gradually decreased. At the last point (five weeks after the second intervention ), the IL-6 levels of groups B2 and B3 were significantly lower than that of group B1 (P<0.001).
Conclusion
For rats with periodontitis and diabetes, periodontal mechanical treatment may elevate serum IL-6 levels in the short term but might reduce the whole inflammatory state in the long term. Thus, this treatment might be valuable to the improvement of vascular disease. The adjunctive benefits of systemic metronidazole and amoxicillin in non-surgical periodontal therapy are decreased serum IL-6 expression and normal carotid artery.
Keywords: chronic periodontitis, type 2 diabetes mellitus, interleukin 6, carotid artery wall, periodontal non-surgical therapy
研究[1]表明,糖尿病与牙周炎相互影响,互为危险因素。糖尿病的急慢性并发症可累及全身多个器官,血管并发症是糖尿病最常见的并发症。目前,普遍认为牙周炎与糖尿病之间是由于宿主共同的炎症背景而发生关联。越来越多的证据表明:牙周炎患者因长期存在大面积溃疡面的低度感染,其致病微生物及其毒力因子进入血循环导致全身系统性炎症而被视为是糖尿病的高危因素[2]。
白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)是一种与慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)、二型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)及其血管并发症紧密相关的炎症因子。IL-6对糖尿病动脉硬化发展具有较强的预测价值[3]。此外其还与不良心血管事件、心肌梗塞等疾病密切相关,IL-6可能参与了这些疾病的病理生理过程[4]。
牙周基础治疗能够降低探诊深度,增加临床附着水平[5]。Meta分析表明,牙周治疗改善了内皮功能并减少了动脉粥样硬化疾病的生物标志物,特别是冠心病(cardiovascular disease,CVD)和/或糖尿病患者[6]。Piconi等[7]研究发现,牙周治疗改善了血管内皮功能障碍,减少了颈动脉内膜中层厚度。牙周治疗可改善牙周局部及全身系统的炎症状态,降低与血管内皮功能相关的生物标志物,进而改善内皮功能障碍。但是,以上实验都是通过中间替代标志物分析牙周治疗与血管内皮之间的关系,缺乏直接的病理结果。因此,本实验通过建立伴T2DM的CP大鼠模型,对其进行牙周干预治疗,处死后取颈动脉分叉组织,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色后观察颈动脉病理变化,同时用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测不同干预措施后血清IL-6的水平变化,探讨牙周炎症及干预对伴T2DM的CP大鼠颈动脉血管的影响,进而为临床提供实验依据。
1. 材料和方法
1.1. 材料和试剂
6周龄清洁级雄性SD大鼠28只,体重200 g[山西医科大学动物实验中心提供,合格证号:SCXK(晋)2015-0001];牙龈卟啉单胞菌(Porphyromanus gingival,P. gingival)标准菌:ATCC33277(首都医科大学口腔微生物研究室提供);高脂高糖饲料(北京科澳协力饲料公司);链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(Sigma公司,美国);Williams牙周探针(上海康桥齿科器械厂):Hu-Friedy;大鼠血清IL-6的ELISA试剂盒(灵敏度<61 pg·mL−1,上海西唐生物有限公司)。
1.2. 方法
1.2.1. 细菌培养
配制CDC厌氧菌血琼脂固体及液体培养基,将标准菌株接种于CDC厌氧血琼脂板,37 °C恒温箱下培养5~7 d,传代,接种于CDC液体培养基,37 °C恒温箱继续培养48~72 h,达到最佳浓度,使用前将P. gingival菌液稀释至备用浓度1×106 CFU·mL−1,细菌悬液当天使用(图1)。
图 1. CDC固体培养基(左)与CDC液体培养基(右).
Fig 1 CDC solid medium (left) and CDC liquid medium (right)
1.2.2. 分组及建模
将28只实验大鼠适应性喂养2周之后,按随机数字表法进行分组,分别为A组(正常对照组,7只)和B组(T2DM+CP组,21只)。以大鼠上颌双侧第一、二磨牙为实验牙,A组普通饮食并且口腔不做任何处理,B组大鼠将缠绕3-0丝线的结扎丝用8字结扎法置于实验牙牙颈部,并在结扎丝上涂布P. gingival悬液,每3 d一次,持续7~8周,同时用高脂高糖饲料(66.5%基础饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%猪胆盐)及小剂量(25 mg·kg−1)STZ多次腹腔注射的方法建立T2DM糖尿病模型,详见文献[8]。成模标准:空腹血糖(fasting blood sugar,FBG)≥7.8 mmol·L−1或随机血糖≥17.8 mmol·L−1。
1.2.3. 口腔干预
B组大鼠建模成功后,根据不同干预措施按随机数字表法进行分组:B1(自然进程组)、B2(机械治疗组)、B3(机械治疗+盐酸米诺环素+抗生素组),每组7只,B1组大鼠不进行任何干预治疗;B2组大鼠进行牙周机械治疗(洁治+刮治+根面平整),每次一个象限2颗实验牙,共2次完成,2次干预间隔1周;B3组大鼠每次牙周机械治疗后,牙周袋内置2%盐酸米诺环素,同时灌胃法给予甲硝唑(100 mg·kg−1)和阿莫西林(200 mg·kg−1)3 d(术前1 d,术后2 d)。
1.2.4. 取材及处理
血清的采集:在干预前1周,第一次干预后1周,第二次干预后1、3、5周进行眼球内眦静脉采血,采血前禁食12 h,采血后静置30 min,3 800 r·min−1离心取上清,−80 °C保存备用,严格按说明书用ELISA法检测血清IL-6含量。
颈动脉的采集:大鼠处死后截取双侧颈动脉血管分叉处上下10 mm,0.9%氯化钠溶液浸泡冲洗,一侧置于无菌EP管中,−80 °C保存备用,另一侧置于10%甲醛中固定24~48 h,石蜡包埋制成石蜡组织块,以4 µm的厚度连续切片,烤片后HE染色,光镜下观察,具体取材方法见文献[8]。
1.3. 统计学方法
采用SAS V8软件对定量资料数据进行统计学分析,血清IL-6含量比较采用重复测量资料的方差分析,同组内不同采血时间点血清IL-6含量两两比较采用Bonferroni法检验,以双侧P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 牙周检查
建模前各组大鼠牙龈色粉质韧,牙周状况良好。建模后A组大鼠实验牙牙龈色粉,质韧,无探诊出血及牙周袋。B组大鼠实验牙出现典型的CP症状:牙颈部可见软垢和牙石聚集,牙龈红肿、质脆,探诊出血及牙龈退缩明显,部分实验牙根分叉暴露,Ⅱ°松动(图2)。第二次干预后5周,B1组牙龈红肿及牙龈退缩明显,松动度达Ⅱ°~Ⅲ°;B2、B3组牙龈色粉质韧,牙龈退缩有所改善,松动度为Ⅰ°~Ⅱ°。
图 2. 建模成功后大鼠的口内照.
Fig 2 Intraoral photography of the rats after successful modeling
左:A组;右:B组。
2.2. 血清学结果
随着时间推移,A组IL-6含量保持平稳,B1组IL-6含量持续升高,并显著高于A组,在第5次时间点达A组的3.12倍,差异有统计学意义(P<0.001);B2及B3组血清IL-6的含量于第一次干预后1周达到峰值[分别为(656.802±54.232)、(631.248±37.038)pg·L−1]且均显著高于B1组[(293.311±17.220)pg·L−1],差异有统计学意义(P<0.001),其中B2组达到A组的4.5倍,B3组达到A组的4.3倍,随后逐渐下降,在第二次干预后5周,B2、B3组IL-6的含量均低于B1组,但仍高于A组,且B2组与A组的差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表 1. 不同采血时间点各组IL-6的浓度变化情况.
Tab 1 Changes of IL-6 concentration in each group at different time points of blood collection
组别 | 第一次干预前1周 | 第一次干预后1周 | 第二次干预后1周 | 第二次干预后3周 | 第二次干预后5周 |
A | 145.090±41.174 | 144.428±24.242 | 153.082±24.026 | 146.012±4.024 | 155.856±28.919 |
B1 | 153.529±9.492 | 293.311±17.220* | 318.641±27.406* | 354.849±25.540* | 487.724±18.830* |
B2 | 206.247±63.609**## | 656.802±54.232*# | 289.060±36.427* | 263.783±28.460*# | 206.890±28.055**# |
B3 | 225.446±37.231*## | 631.248±37.038*# | 281.432±45.458* | 235.854±21.892*# | 184.652±24.282# |
注:与A组比较,*P<0.001,**P<0.05;与B1组比较,#P<0.001,##P<0.05。
pg·L−1, n=7, x±s
2.3. 颈动脉组织病理学结果
颈动脉组织病理学结果见图3。A组血管内膜完整,内皮细胞呈扁平状,中膜平滑肌细胞及弹性纤维排列整齐,管壁无增厚;B1组内皮细胞脱落消失,中膜暴露,中膜弹性纤维排列紊乱,部分断裂,平滑肌细胞增生肥大,排列紊乱,细胞间间隙增大,平滑肌组织局部坏死,呈无定型颗粒,少量钙盐沉积,染色加深,管壁增厚明显;B2组内皮细胞脱落消失,中膜暴露,中膜弹性纤维排列紊乱,呈分叉状,部分平滑肌细胞肿胀,空泡变性,细胞间隙增大;B3组内皮细胞脱落、消失,中膜暴露,中膜弹力纤维排列整齐,部分平滑肌细胞肿胀,空泡变性,细胞间间隙增大,血管壁无明显增厚。
图 3. 各组颈动脉血管病理变化.
Fig 3 Pathological changes of carotid vascular in each group
第一列:A组,红色箭头示内皮细胞;第二列:B1组,蓝色箭头示钙盐沉积;第三列:B2组,黑色箭头示空泡性变;第四列:B3组,黑色箭头示空泡性变。上:HE × 4;下:分别为上图红圈所对应放大区域,HE × 200。
3. 讨论
有研究表明牙周健康与颈动脉粥样硬化的存在有关,与没有斑块的患者相比,颈动脉斑块患者具有更高的牙周指数(牙龈指数:1.40±0.71对比0.69±0.64,P=0.006)。颈总动脉壁面剪切应力与牙周指数呈负相关[9]。牙周基础治疗能够改善颈总动脉壁面剪切应力[10],进而改善内皮功能障碍并降低全身炎症[11],颈动脉粥样硬化斑块好发于颈总动脉分叉部位。Meta分析从动脉粥样硬化的替代指标和血糖控制方面证实了牙周治疗对全身健康的潜在益处,降低口腔感染可导致全身炎症的总体减少,由于伦理方面的因素,以上临床研究中只能通过中间替代指标来预测对血管的影响,缺乏血管病理结果的直接证据[12]。因此,本实验通过建立伴糖尿病的牙周炎大鼠模型,探讨口腔干预对大鼠血清IL-6及颈动脉血管的影响。
本实验结果显示:伴T2DM的牙周炎大鼠,B1组血清IL-6水平随时间的推移呈持续升高的趋势,同时颈动脉病理结果显示内皮细胞脱落消失,平滑肌组织局部坏死呈无定型颗粒,有少量钙盐沉积,弹性纤维排列紊乱,部分断裂,管壁增厚明显。这可能是由于牙周炎和糖尿病共同的炎症积累导致血管内皮损伤,中膜平滑肌局部坏死,并伴有中膜钙化的趋势。有研究[13]表明,C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)与牙周炎和血管钙化关系密切,当两者同时存在时,血清炎性因子的含量可能叠加。IL-6是炎症标志物的上游,与稳定型冠心病患者的主要不良心血管事件,心肌梗塞等疾病发生的风险独立相关,IL-6可能参与了这些事件发展过程中涉及的病理生理过程。牙周炎患者的CRP、纤维蛋白原、TNF-α、IL-1、IL-6和其他急性期反应物水平升高与心血管事件的发生有关[12]。牙周炎和糖尿病两者互为危险因素,相互促进,使得局部与全身炎症增强,这些炎症因子及宿主的炎症免疫反应进一步促进血管内皮细胞的损伤,甚至脱落,中膜平滑肌细胞的变性及钙化。
Aziz等[14]研究表明牙周基础治疗导致伴糖尿病牙周炎患者IL-6水平显著降低(P<0.01)。本实验研究表明:干预组在第一次牙周干预后1周IL-6的含量急剧升高,之后逐渐下降,在第二次干预后5周IL-6的水平显著低于B1组(P<0.001),这与以上研究结果一致,牙周非手术治疗去除牙周局部的牙石、菌斑,消除了口腔局部的炎症状态,口腔感染的减少也大幅度降低了全身炎症因子的水平。
Meta分析结果表明牙周治疗减少了T2DM患者血清中TNF-α和CRP的水平,炎症负荷的减少对代谢控制有重要意义,并且可以部分解释炎症因子的升高与牙周炎及T2DM血管并发症风险增加的相关机制[15]。牙周机械治疗属于有创治疗,可能引起一过性菌血症,使炎症因子水平瞬时升高[11]。本实验在第一次干预后1周血清IL-6达到峰值,与上述研究结果一致,随后逐渐降低,在最后检测时间点各干预组IL-6水平均低于B1组。同时,干预组血管病变最轻,提示:牙周非手术治疗在短期内增强机体炎症状态,从远期疗效来看,牙周非手术治疗可能降低机体局部及全身炎症水平,这可能与血管的病变程度减轻有关。牙周机械治疗联合使用局部及全身抗生素与不使用抗生素相比,血清IL-6的水平差异无统计学意义,但在第二次干预后5周B3组IL-6的浓度值最低,同时血管病变最轻,可见牙周机械治疗联合应用局部与全身抗生素,其效果优于单纯机械治疗。本实验也有一定的不足之处,在第一次干预后1周时IL-6呈峰值,缺乏相对应的病理结果。
综上,本实验对伴T2DM的CP大鼠进行牙周基础治疗,结果提示:牙周非手术治疗在短时间内可能会因全身炎症因子的急剧升高而增加糖尿病血管并发症的发生风险,但远期则可能会降低其风险。联合使用局部及全身抗生素,可能优化治疗效果。但是本实验为动物实验,结果是否适用于临床仍需进一步研究。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金(81271144)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81271144).
Footnotes
作者声明本文无利益冲突。
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