人体微生物碳水化合物活性酶的研究进展

Abstract

人体定植着大量微生物，主要位于肠道、口腔、皮肤、阴道及鼻腔等位点。微生物复杂多样的代谢活动不仅辅助人体的消化功能，还参与了各系统的重要生理及病理活动。碳水化合物活性酶（CAZymes）是一系列具有降解、修饰及生成糖苷键功能的酶。微生物可产生众多CAZymes，协同人体细胞一起对数目庞大、种类繁多的复杂碳水化合物进行降解，便于进一步代谢利用并产生新的生物信号分子，是微生物参与人体生理及病理过程的重要渠道之一。本文对人类各微生物聚集位点，尤其是肠道和口腔的复杂多糖代谢机制以及微生物CAZymes相关代谢研究进展进行综述，对微生物CAZymes与人体健康和疾病关系的研究及前景进行总结。

人体聚集着大量微生物，主要位于肠道、口腔、皮肤、阴道及鼻腔等位点[1]。随着人类基因组学计划进入多组学整合研究的第二阶段，人体微生物组对宿主生理功能和疾病状态的影响是当前微生物组学研究的热点[2]。人体肠道菌群以复杂的膳食多糖作为主要碳源，协助人体消化系统降解碳水化合物。人体微生物复杂多样的代谢活动不仅辅助消化功能，还参与各系统的重要生理及病理活动。

人类每日摄入的食物种类繁多，其中复杂碳水化合物代谢是由一组参与其组装和分解的酶控制，统称为碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes，CAZymes），其具有降解、修饰及生成糖苷键的功能[3]。CAZymes作用于糖复合物、寡糖及多糖，将大分子碳水化合物分解为小分子产物，同时伴随ATP的释放。人类自身基因组只编码17种多糖的消化酶[4]，只有淀粉可被人类消化道细胞分泌的水解酶完全降解[5]。除此之外，数量庞大的CAZymes均由人体微生物基因组编码[6]。

定植于人体表及体内的常驻菌群，与相应微生境的人体细胞、体液等产生密切而复杂的相互作用，其生存也依赖于对宿主来源复杂碳水化合物的分解代谢。通过分析肠道、口腔、呼吸道、神经系统、皮肤及泌尿生殖道的CAZymes分布，学者[4]发现，CAZymes的功能及微生物定植与各器官组织局部的碳水化合物组成相适应。因此，微生物CAZymes在人体正常生理活动中可能具有重要作用。本文系统阐述了人体肠道、口腔等位点微生物复杂多糖代谢机制及相关CAZymes的研究进展，以及微生物代谢复杂碳水化合物在人体生理稳态维持与疾病发生发展中的作用，为肠道、口腔及其他多领域碳水化合物降解相关研究及应用提供新的思路。

1. CAZymes

CAZymes数据库（www.cazy.org）建立于1999年，是提供CAZymes的序列、结构及分子机制相关的综合资源[3]。根据氨基酸序列相似性、蛋白结构及催化功能的不同，CAZymes主要分为五类催化酶及一类非催化模块，催化酶分别为糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GHs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs）、糖基转移酶（glycosyltransferases，GTs）、辅助氧化还原酶（auxiliary activities，AAs），非催化模块即碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding modules，CBMs）。

切断糖苷键的两类酶是GHs与PLs。GHs是一组能够降解2个或多个碳水化合物间及碳水化合物与非碳水化合物间糖苷键的酶，一般通过插入水分子来完成，主要参与碳水化合物主链的降解[7]。PLs是一组通过β-排除机制降解含糖醛酸的多糖长链的酶，降解中会产生不饱和烯糖醛酸残基和新的还原性末端[8]。GHs和PLs目前分别分为153个族和28个族。

CEs是一组能够去除多糖酯基、参与碳水化合物侧链降解的酶，可易化GHs、PLs的降解作用[9]。GTs与双糖、寡糖及多糖的合成有关，是一组催化糖基从活化的供体分子转移到特定的受体分子从而形成糖苷键的酶，在人体微生物的适应性和致病性方面起到重要作用[10]。AAs分为木质素水解酶（ligninolytic enzymes）和裂解多糖单加氧酶（lytic polysaccharide mono-oxygenases）。其中木质素水解酶与经典的多糖解聚酶具有协同作用[11]。CBMs为CAZymes中具有碳水化合物结合活性的连续氨基酸序列，其本身没有酶活性，但可以通过促进与底物的长时间作用，增强多种CAZymes的催化功能[12]。

目前人体微生物相关CAZymes的研究中，肠道微生物研究最为突出，口腔领域也开始有研究出现，其他位点微生物相关CAZymes的研究还较少。

2. 肠道微生物CAZymes

人类肠道中含量最丰富的微生物主要来自厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。近年来，关于拟杆菌门消化酶的研究较其他门微生物的研究更为深入。拟杆菌门主要通过淀粉降解利用系统（starch utilization system，Sus）来完成多糖的序列降解[13]，目前研究已较成熟。

2.1. 肠道微生物通过CAZymes的协同作用降解多糖

在降解同一复杂多糖时，各类CAZymes体现相互协作的特性。多糖越复杂，降解其所需的CAZymes越多[14]。多糖主链的降解主要通过GHs和一部分PLs来完成；侧链的降解则需要包括木糖苷酶、甘露糖苷酶及CEs在内的大量水解酶的参与[7]。侧链的移除暴露了新的末端，为主链降解提供了新的作用位点。Ndeh等[15]详细论述了多形拟杆菌在降解鼠李糖醛酸Ⅱ过程中所需要的包括GHs、PLs、CEs在内的一系列CAZymes及其降解机制。目前研究认为，没有一种肠道微生物能够降解肠道内的所有多糖[16]，其中一部分微生物降解复杂多糖所形成的可溶性、短链初步产物可提供给其他微生物进一步降解[17]。

卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）ATCC8483能增加菊粉环境中普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）ATCC8482的适应性，这可能是因为卵形拟杆菌降解菊粉所形成的小分子产物能够被普通拟杆菌进一步代谢利用[18]。直肠真杆菌（Eubacterium rectale）仅能分解阿拉伯木聚糖的树胶醛糖侧链，而长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）则进一步代谢初级产物形成单糖，供直肠真杆菌利用[19]。因此，微生物间协同完成复杂的多糖降解，对生存和代谢具有不可或缺的作用。

此外，新发现的CAZymes被不断报道，丰富了肠道微生物CAZymes体系[19]–[20]。学者[20]认为，利用人类肠道内复杂多糖降解来维持自身生命活动，是微生物肠道内生存的选择压力之一。人类肠道微生态系统中陆续发现的CAZymes为理解微生物组成及其变化提供了大量资源。

2.2. 肠道CAZymes表达的影响因素及与肠道疾病的关系

肠道微生物不仅能降解人类食谱中的植物多糖成分，也同样能够降解动物源性多聚糖及人类肠上皮分泌的内源性黏蛋白[21]。研究[22]–[23]表明，肠道菌群组成随着进食种类的不同而改变，可能与免疫反应的变化及结肠炎的发生有关。高膳食纤维饮食上调与纤维或内源性聚糖相关的CAZymes基因表达[24]，通过选择性富集产短链脂肪酸细菌，驱动胃肠道激素及胰岛素对血糖的调节来缓解2型糖尿病[25]。

肥胖与部分肠道微生物CAZymes的表达、拟杆菌门与厚壁菌门的构成比等有相关性，包括GH13在内的10个GHs家族与个体身体质量指数（body mass index，BMI）呈正相关[26]。抗生素治疗同样可能影响GHs的活性及碳水化合物的代谢，β-内酰胺类药物的使用可改变控制肠道黏蛋白聚糖厚度、组成及连续性的酶活性[27]。

在2型糖尿病的治疗中，阿卡波糖作为一种作用于肠道细胞的α-葡萄糖苷酶抑制剂，对抑制2型糖尿病的进展有明确作用[28]。GH130抑制剂在抑制N-聚糖降解、保护或恢复肠道上皮屏障方面起到重要作用[29]；O-β-N-乙酰葡萄糖胺抑制剂的提出，提示了CAZymes抑制剂治疗阿尔茨海默症的可能性[30]。结直肠癌患者的血清及肿瘤组织中，聚糖的表达发生改变。这种糖基化合成的控制可能与GTs相关基因表达有关[31]，因此可用于结直肠癌的分子诊断。此外，动脉粥样硬化等代谢综合征、自身免疫及变态反应疾病、抑郁症等疾病的发生与肠道微生物的改变密切相关，而肠道微生物CAZymes的相应变化及其机制目前尚缺乏进一步研究。

3. 口腔微生物CAZymes

目前有关人体微生物CAZymes的研究中，除肠道外，其他组织或器官微生物CAZymes的研究尚缺乏完整的理论体系。口腔是人体中微生物丰度、种类最多的位点之一，目前已发现并命名近700种微生物，其生长代谢与包括龋病、牙周病在内的感染性疾病的发生发展密切相关。口腔微环境中微生物充分接触食物、宿主等来源的复杂碳水化合物，目前已经有一些关于CAZymes尤其是GHs的研究出现。研究[4]指出，具有植物细胞壁切断酶活性的GH66、GH70及GH87可能是牙菌斑生物膜形成的标志物；GH4、GH8、GH42及GH68在龈上及龈下菌斑中表达量丰富，其中GH8及GH68可能参与了生物膜中多糖的合成。唾液宏蛋白组学研究[32]发现，唾液微生物在唾液糖蛋白的代谢和糖基水解中发挥积极作用，提示了CAZymes可能存在的潜在作用，为口腔领域CAZymes的进一步研究提供了思路。

唾液是口腔细菌赖以生存的微环境，唾液本身基本不含小分子寡糖或游离单糖，而富含复杂聚糖，因此CAZymes可能在其中有活跃作用。在CAZy数据库中比对发现，厚壁菌门口腔细菌含有丰富的GHs，其中牙菌斑生物膜早期定植菌及常驻菌具有更多的GHs种类及数量，且表达更多的胞壁锚定及分泌性GHs；而龋病相关的变异链球菌（Streptococcus mutans）、远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）等仅含有少量的GHs，且基本位于胞内[33]。本课题组对口腔常见的16个属中的32株细菌进行了以人全唾液为底物的体外培养，发现戈登链球菌（Streptococcus gordonii）、口腔链球菌（Streptococcus oralis）生长良好，变异链球菌生长相对较差，而包括血链球菌（Streptococcus sanguinis）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）在内的多种口腔细菌却几乎无法在此条件下生长，唾液蛋白以及糖蛋白成分无明显变化[33]。敲除GH2、GH20、GH85表达基因位点的戈登链球菌突变株几乎不表达胞外GHs，在唾液培养条件下生长以及生物膜形成较野生株明显下降，其主要差异为唾液中高度糖基化的碱性富脯氨酸糖蛋白（proline-rich glycoprotein，PRG）降解减少[33]。综合前期研究，笔者认为胞外表达的GHs为牙菌斑生物膜早期定植菌在口腔微环境中的生存提供便利和营养支持，从代谢角度证明了唾液糖蛋白在牙菌斑生物膜形成中的重要作用。

近年来，关于牙周致病菌CAZymes的研究逐渐兴起。福赛斯坦纳菌（Tannerella forsythia，T. forsythia）可通过唾液酸酶代谢牙周袋内丰富的唾液酸糖蛋白，对其致病毒力有重要意义。Honma等[34]在T. forsythia的唾液酸转运系统研究中发现，当敲除定位于唾液酸利用基因簇的内膜转运体基因后，突变株的唾液酸摄取能力、在唾液酸中生物膜形成能力、在KB上皮细胞培养中生存能力均下降。这提示唾液酸在龈下菌斑生物膜形成及上皮细胞感染中起到重要作用。Roy等[35]在T. forsythia代谢唾液酸糖蛋白的研究中发现，NanH依赖性唾液酸酶能作用于唾液酸黏蛋白并释放唾液酸；而使用唾液酸酶抑制剂后，T. forsythia在唾液酸黏蛋白及人全唾液中的生长均下降。因此认为，NanH依赖性唾液酸酶对T. forsythia的生物膜形成及黏附等毒力因子具有重要作用，并提示唾液酸酶抑制剂用于牙周炎治疗的可能性。

然而, 目前关于口腔微生物CAZymes的研究多集中于牙周致病菌，CAZymes在龋病、根尖周病等常见口腔疾病中的作用及机制尚待进一步研究。

4. 展望

当前CAZymes的作用机制已较明确，且随着技术的发展，CAZymes的新成员不断被发现。目前关于肠道微生物及其CAZymes与人体生理病理过程的关系已有一定的研究，口腔领域也已开始CAZymes的相关研究，但机体其他组织或器官CAZymes的研究仍处于起步阶段。人体微生物相关的代谢及非代谢类疾病与CAZymes的关系、口腔及其他组织和器官微生物独有的CAZymes及关键微生物复杂多糖代谢机制、CAZymes及其抑制剂的体内研究等方面尚存大量空白，值得进一步深入研究。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81771099，81700964）；四川省科技厅重点研发项目（2018SZ0121）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81771099, 81700964); Key Research and Development Projects of Science and Technology Department of Sichuan Province (2018SZ0121).