蛋白激酶D1在调节口腔鳞癌细胞增殖、凋亡及药物敏感性中的作用

Abstract

目的

探讨蛋白激酶D1（PKD1）在人口腔鳞癌细胞SCC-25生长、凋亡及化疗药物敏感性中的作用和机制。

方法

转染control-shRNA和PKD1-shRNA质粒，建立PKD1基因沉默的SCC-25细胞系；CCK-8及流式细胞术检测PKD1基因沉默后细胞的增殖、凋亡及细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性；Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及多药耐药蛋白P-gp的表达变化。

结果

PKD1在口腔肿瘤细胞SCC-25、CAL-27、SACC-83中呈现高表达；PKD1基因沉默后SCC-25细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，细胞生长受到抑制，凋亡增加；多药耐药蛋白P-gp表达下调，紫杉醇半数抑制浓度及耐药指数明显降低。

结论

PKD1通过调控SCC-25细胞内凋亡相关蛋白表达和多药耐药蛋白P-gp表达，调控SCC-25生长、凋亡和对药物敏感性，是口腔鳞癌细胞生物治疗潜在靶点。

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）属丝氨酸/苏氨酸蛋白质家族，根据其结构分成3种亚型：PKD1、PKD2、PKD3[1]–[5]。大量研究[6]–[8]显示：PKD家族参与多种肿瘤细胞生物学行为，包括肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭、转移和肿瘤血管生成等。其中PKD1通过调节肿瘤细胞相关的多种信号通路，包括丝裂原活化的ERK激酶/细胞外信号调节激酶（motigen-activated protein kinase kinase/extracellular regulated protein kinases，MEK/ERK）、核因子κB（nuclear factor-kappa B，NFκB）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）通路[5]–[6],[9]–[11]，参与肿瘤细胞生长、凋亡、代谢等生物学过程。

肿瘤细胞的多药耐药（multi-drug resistance，MDR）是肿瘤化疗成功的一大障碍。MDR是指暴露于一种细胞毒性药物的肿瘤细胞对一系列具有不同结构和靶标的多种药物产生交叉抗性[12]。MDR的细胞机制中，最重要的是通过细胞膜上ATP依赖性外排泵（ATP-binding cassette，ABC）表达增加所介导的细胞内药物外流，如P-gp等[13]–[14]。P-gp是一相对分子质量为170 000的跨膜蛋白，由MDR1基因编码，由2个含有6个疏水跨膜段的部分组成，且含2个ATP结合区域，属ABC转运蛋白家族。虽然P-gp的表达在诊断时可能较低，但在暴露于化疗药物后迅速增加，导致这些肿瘤细胞对化疗药物耐受[15]–[18]。有研究[14],[19]–[22]证实，P-gp作为ATP依赖性的外排泵，降低细胞内药物积累，增加外排，介导肿瘤细胞对多种药理学上无关的抗癌药物和疏水化合药物的抗性，如紫杉醇、阿霉素、表柔比星和长春新碱等。最终导致肿瘤细胞对化疗药物敏感性较低，成为化疗失败的关键因素。有研究[23]–[27]发现，NFκB及丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路参与P-gp表达调节，但目前尚不完全了解由化疗药物激活P-gp过表达的确切的信号传导机制。

1. 材料和方法

1.1. 主要试剂和设备

DME/F-12培养基、DMEM高糖培养基、小牛血清（Gibco公司，美国），Cell Counting Kit-8（CCK-8）（Dojindo公司，日本），紫杉醇及Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（Sigma公司，美国），PKD1抗体、磷酸化PKD1抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体及β-actin抗体（Cell Signaling Technology公司，美国），P-gp抗体（Abcam公司，美国），全蛋白收集试剂盒（南京凯基公司）。人PKD1-shRNA及其对照重组质粒（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。

人SCC-25、CAL-27、SACC-83细胞株均来自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。

1.2. 细胞培养

SCC-25细胞使用DME/F-12（1∶1）培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素），CAL-27、SACC-83细胞使用DMEM高糖培养基（含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素），置于37 °C、5%CO₂的培养箱中培养。

1.3. Western blot检测

使用全蛋白收集试剂盒收集SCC-25、CAL-27、SACC-83细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后，将蛋白样本转移至硝酸纤维素膜上。质量分数为5%的脱脂牛奶室温封闭1 h后，以1∶1 000的PKD-1抗体、P-PKD1抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、P-gp抗体、β-actin抗体4 °C下孵育过夜，次日，使用相应来源的辣根过氧化物酶标记的二抗（1︰5 000）摇床上室温孵育2 h，TBST洗涤3次，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）法显像。

1.4. 构建PKD1基因沉默SCC-25细胞株

将处于对数生长期的SCC-25细胞按密度为每孔1×10⁵个接种于24孔板，过夜培养后换用血清培养液饥饿培养4 h。采用Lipofectamine2000介导法将PKD1 shRNA和control shRNA按操作说明书转染SCC-25细胞。细胞分为未转染组（Wild）、对照组（control-sh）和转染组（PKD1-sh）。质粒载体与脂质体质量比为1∶3.5，转染12 h后换用含10%小牛血清的培养液培养，24 h后用含0.5 µg·mL⁻¹嘌呤霉素的培养液进行筛选，维持嘌呤霉素浓度筛选2周后，使用1.3中Western blot操作方法鉴定基因沉默效率。

1.5. SCC-25细胞生长及凋亡检测

取处于对数生长期的3组细胞，按密度为每孔1×10³个接种于96孔板，每组设置3个复孔，分别培养1、2、3、4、5 d，按照操作说明使用CCK-8试剂，用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光密度（optical density，OD）值，绘制细胞的生长曲线。

取处于对数生长期的3组细胞按密度为每孔2×10⁵个接种于6孔板，培养72 h后，用胰酶消化收集悬浮和贴壁细胞，PBS洗涤，按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书处理细胞，流式细胞仪上机检测各组凋亡细胞比例。Western blot检测Bax、Bcl-2表达情况。

1.6. SCC-25对紫杉醇的敏感性检测

取处于对数生长期的3组细胞，按密度为每孔1×10³个接种于96孔板，每组设置3个复孔。37 °C、5%CO₂过夜培养，待细胞贴壁后分别加入相应浓度的紫杉醇，继续培养72 h，采用CCK-8法检测细胞生长情况。根据细胞存活率，应用线性回归分析计算半数抑制浓度IC50。根据IC50计算细胞的耐药指数（RI）。细胞存活率=（实验组−空白组）/（对照组−空白组）×100%，RI=实验组IC50/对照组IC50。用Western blot法检测P-gp表达情况。

1.7. 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05则认为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. PKD1在口腔鳞癌和腺癌细胞中的表达和磷酸化活化情况

采用Western blot检测了口腔鳞癌细胞株SCC-25、Cal-27和SACC-83中PKD1表达和磷酸化活化情况，结果显示，PKD1在SCC-25、SACC-83及Cal-27细胞中均不同程度表达和磷酸化活化（图1）。

图 1. 口腔肿瘤细胞中PKD1表达和磷酸化活化情况.

Fig 1 The expression and phosphorylation of PKD1 in human cancer cell lines

左：PKD1表达及磷酸化分析；中：p-PKD1定量分析；右：PKD1定量分析。

2.2. 构建PKD1基因稳定沉默SCC-25细胞株

control shRNA和PKD1-shRNA质粒转染SCC-25细胞后，嘌呤霉素筛选抗性细胞，用Western blot检测PKD1表达及其磷酸化水平，鉴定基因沉默效率。结果显示：与未转染细胞和对照组质粒转染细胞相比，转染组PKD1表达及其磷酸化水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。说明成功构建了稳定的PKD1基因沉默的SCC-25细胞系（图2）。

图 2. 构建PKD1基因沉默SCC-25细胞株.

Fig 2 Generation of stable PKD1 knockdown SCC-25 cell line

左：PKD1表达及磷酸化分析；中：p-PKD1定量分析；右：PKD1定量分析。

2.3. PKD1基因沉默抑制SCC-25细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡

采用RNA干扰技术，沉默SCC-25细胞内PKD1基因后，CCK-8检测结果显示（图3A）：随着培养时间的增加，转染组较未转染组和对照组OD值明显降低。同时，流式细胞仪检测凋亡（Annexin V⁺PI⁺）结果显示：实验组、未转染组和对照组凋亡率分别为（27.12%+13.01%）、（4.61%+2.96%）、（7.71%+3.78%）（图3B、C），转染组凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。

图 3. PKD1基因沉默抑制SCC-25细胞生长并促进其凋亡.

Fig 3 PKD1 knockdown inhibited proliferation and induced apoptosis of SCC-25 cells

A：SCC-25细胞的生长曲线；B：SCC-25细胞的凋亡百分比；C：SCC-25细胞的凋亡率；D：SCC-25细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达；E：SCC-25细胞Bax表达定量分析；F：SCC-25细胞Bcl-2表达定量分析；G：SCC-25细胞Bax/Bcl-2的比例。a：未转染组；b：对照组；c：转染组。

2.4. PKD1基因沉默抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加Bax/Bcl-2比例

采用RNA干扰技术，沉默SCC-25细胞内PKD1基因后，Western blot检测结果显示：PKD1 shRNA转染后促凋亡蛋白Bax的表达无明显变化；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降，Bax/Bcl-2的比例显著上升（图3D~G），差异有统计学意义（P<0.01）。

2.5. 沉默SCC-25中PKD1基因，增强肿瘤细胞对紫杉醇的药物敏感性

用不同浓度（40、80、120、160、200 nmol·L⁻¹）的紫杉醇处理PKD1基因沉默后的SCC-25，用CCK-8试剂盒评估细胞活力，并计算半数抑制浓度IC50和耐药指数RI（图4）。未转染组、对照组和转染组的IC50分别为（79.43±0.190）、（81±0.298）、（63±0.577） nmol·L⁻¹，与未转染组和对照组相比，转染组IC50显著降低（P<0.05）。此外，与对照组相比，转染组SCC-25细胞的RI也显著降低（分别为1.03±0.006与0.79±0.007），差异有统计学意义（P<0.05）。

图 4. PKD1沉默加强紫杉醇对SCC-25的杀伤作用.

Fig 4 PKD1 knockdown increased the anti-tumor effects of paclitaxel in SCC-25 cells

左：3组SCC-25细胞紫杉醇作用下的剂量-反应曲线；中：半数抑制浓度IC50；右：耐药指数RI。

2.6. PKD1基因沉默后，抑制SCC-25细胞中P-gp的表达

采用RNA干扰技术，沉默SCC-25细胞内PKD1基因后，Western blot检测结果显示：SCC-25细胞P-gp表达量显著降低（图5），差异具有统计学意义（P<0.05）。说明PKD1可以调节P-gp的表达。

图 5. PKD1沉默抑制P-gp的表达.

Fig 5 PKD1 knockdown inhibited the expression of P-gp

上：SCC-25细胞P-gp表达；下：SCC-25细胞P-gp定量分析。

3. 讨论

目前，紫杉醇作为一种有效的化疗药物，已被添加到头颈部鳞状细胞癌晚期的化疗方案中，而MDR仍是头颈肿瘤化疗的一大障碍[28]。

PKD1是蛋白激酶D家族成员之一，在静息状态下，PKD1存在于细胞的细胞质中，并在特定刺激下激活后被募集到多个细胞区室，如质膜、细胞核或高尔基体等[3]。PKD1的这种细胞内移动性使其能够充当不同亚细胞区室之间的通信者，从而涉及多种生物过程，包括膜运输、信号转导、细胞黏附、迁移、存活、增殖、分化和凋亡等[29]。大量研究显示：PKD在肿瘤生长、凋亡、能量代谢、侵袭和转移中发挥重要作用，是肿瘤治疗潜在靶点，阐明其作用机制是目前研究的重点。

在本研究中，笔者分析了PKD1在多种口腔肿瘤细胞中的表达和磷酸化状态，结果提示PKD1在肿瘤细胞中的表达和磷酸化活化是一种常态。PKD1基因沉默后，SCC25细胞生长抑制、细胞凋亡增加。目前，已经有研究显示：PKC在人胰腺癌细胞肿瘤细胞的有丝分裂中发挥着重要作用[30]，而PKD1作为PKC的下游分子，可能介导了PKC在肿瘤细胞增殖中的作用，进而影响了肿瘤细胞的生长。同时，对Bax和Bcl-2进行了检测。凋亡相关蛋白主要分为两类，一类是具有抗凋亡作用的蛋白，如Bcl-2、BclxL等，另外一类是具有促凋亡作用的蛋白，如Bax、Bak等。当促凋亡分子活跃而抑制Bcl-2等抗凋亡分子时，胞浆中Bax等被激活并定位于线粒体膜上，促使线粒体膜电位降低而改变膜的通透性，促进凋亡物质的释放，激活细胞内源性凋亡途径，导致细胞凋亡[31]。检测结果显示Bcl-2的表达降低，Bax/Bcl-2的比率增加，说明了PKD1的基因沉默抑制抗凋亡蛋白表达，从而促进了SCC25细胞的凋亡。

此外，研究还发现PKD1沉默增加了紫杉醇治疗后的细胞凋亡，并且有效地降低了P-gp的表达。这一结果表明敲除PKD1后ABC蛋白介导的外排泵活性明显受到抑制，增加了对诸如紫杉醇的抗癌药物的化学敏感性。已有研究[32]发现，MEK/ERK途径及PKC路径等信号转导通路均可被激活继而影响肿瘤细胞对紫杉醇、阿霉素等化疗药物抗性，而PKD1不仅作为PKC的下游分子，而且现已在多种细胞类型中观察到PKD1的活化也与PKC和MAPK/MEK/ERK信号传导途径相关，包括成纤维细胞、肠和肾上皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞和成骨细胞以及各种癌细胞[33]，因而可能由PKD1介导了PKC及MEK/ERK通路在肿瘤细胞耐药中的作用。进而说明了PKD1可能用作逆转口腔鳞癌细胞耐药的治疗靶点。

综上所述，本研究结果发现PKD1是逆转多药耐药的新的靶标，PKD1的沉默不仅抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡进程，同时显著增加了肿瘤细胞对化疗药物紫杉醇的药物敏感性。这为治疗口腔鳞癌患者的化疗用药提供新的理论依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81372892）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81372892).