双生子儿童口腔微生物群组结构分析

Abstract

Objective

To analyze the differences between the oral microbiota of monozygotic and dizygotic twins by polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE).

Methods

A total of 20 pairs of twin children were included in this study, in which 10 pairs were monozygotic (MZ) twins, and 10 pairs were dizygotic (DZ) twins. Of the 20 pairs, 10 pairs of twins had primary dentition, and 10 pairs had mixed dentition; 17 children had caries, and 23 children had no caries. Genomic DNA was extracted from saliva samples. The 16s rRNA was amplified and analyzed by PCR-DGGE. The PCR-DGGE band number and Shannon index were calculated.

Results

Cluster analysis showed high similarity in the oral bacterial community seen in co-twins. However, no significant difference was seen between MZ and DZ twins. In the primary dentition, the PCR-DGGE band number and Shannon index of children with caries (11.00±1.56, 1.05±0.36) were lower than those of children without caries (14.00±2.74, 1.44±0.37) (P<0.05). In mixed dentition, the PCR-DGGE band number and Shannon index of children with caries (11.88±4.05, 1.18±0.36) were lower than those of children without caries (14.31±5.71, 1.28±0.47), but the differences were not statistically significant (P>0.05).

Conclusion

Environmental factors may have a stronger effect on the constitution of oral microbiota in children compared with genetic factors. Children without caries may have a richer microbial diversity compared with children with caries.

口腔菌群微生物平衡对维持口腔健康具有非常重要的意义。微生物菌群的失衡与口腔感染性疾病，如龋病及牙周病等的发生均息息相关。目前对口腔微生物构成的影响因素并不十分清楚。研究[1]–[2]表明，遗传及环境因素对口腔微生物的构成均有较大影响，而这其中哪种因素的影响更大，目前尚无定论。

双生子研究是一种经典的流行病学研究方法，主要通过对双生子群体的研究，即比较同卵双生子和异卵双生子性状的相似性来判断遗传和环境哪种对于疾病或性状更为主要的一种方法。同卵双生子（monozygotic twins）具有基本相同的遗传物质，表型特征极为相似。同卵双生子之间的差异可以排除遗传因素的作用，可用以研究不同环境因素对表型的影响。异卵双生子（dizygotic twins）具有50%相同的遗传物质，其在特点上无异于两次不同妊娠的同胞，但双生子同胞之间具有相同的年龄，进行比较时可以避免年龄的混杂，同时也可以排除不同子宫环境对胎儿发育及疾病所带来的影响。通过比较同卵及异卵双生子性状的差异，可以分析遗传和环境两个方面对个体性状的影响。本研究拟通过双生子法，以聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分析双生子儿童口腔微生物群组结构构成的差异，从而观察遗传及环境因素对人口腔微生物群组结构构成的影响。

1. 材料和方法

1.1. 试验对象

随机选取2011年8月—2012年3月于四川大学华西口腔医院儿童口腔科就诊的双生子儿童20对，年龄3~11岁，根据WHO口腔健康调查基本方法第三版龋病诊断标准，记录龋失补牙面（dmfs/DMFS）指数。其中有龋者17人，无龋者23人。

所有入选双生子儿童为共同生活背景，无全身系统性疾病史，3个月内无全身使用抗生素史，未使用激素类药物及免疫抑制剂，1周内口腔局部未使用抗生素。儿童及其法定监护人知情同意。

根据儿童牙列情况分为乳牙列组以及混合牙列组。乳牙列组双生子共10对，年龄3~6岁，其中无龋（caries free）儿童13人，有龋（caries）儿童7人，dmfs指数为2.29±1.38。混合牙列组双生子共10对，年龄6~11岁，其中无龋儿童10人，有龋儿童10人，dmfs/DMFS指数为7.20±4.42。

1.2. 卵形鉴定

用无菌棉签采集儿童口腔黏膜样本，鉴定双生子儿童卵形。采用16个多态标记（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型对所有双生子进行卵形鉴定。20对双生子中，同卵双生子10对，异卵双生子10对；乳牙列组中同卵双生子3对，异卵双生子7对；混合牙列组中同卵双生子7对，异卵双生子3对。

1.3. 唾液样本采集

进食后2 h取样，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加样枪从受试者口底采集，采集量为5 mL。采集的唾液放入离心管内，冰浴下2 h内放入−80 °C冰箱冻存。

1.4. DNA提取

将临床采集的唾液样本在室温下解冻，将唾液样本混合，2 600×g离心10 min，沉淀样本中的残渣及真核细胞，取上清，14 000×g离心5 min，弃上清，收集细菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以获得原始唾液细菌谱。利用QIAamp DNA Micro Kit提取全基因组DNA，提取产物使用Pigogreen荧光定量法测定浓度，A₂₆₀/A₂₈₀测定DNA纯度。

1.5. 16s rRNA基因扩增及PCR-DGGE分析

使用通用引物bal 1（5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3′）、bal 2（5′-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3′）扩增DNA样本16s rRNA基因，扩增产物长度约300 bp。PCR反应体系：PCR master mix预混液25 µL，25 mmol·L⁻¹引物各1 µL，100 ng纯化基因组DNA，加去离子水补足50 µL。循环条件：起始步骤94 °C变性3 min；94 °C变性1 min，56 °C退火1 min，72 °C延长2 min，30个循环；72 °C延长5 min。取PCR扩增产物5 µL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，0.5 µg·mL⁻¹溴化乙锭染色后置长波紫外光下观察。

以8%的聚丙烯酰胺凝胶形成40%（含2.8 mol·L⁻¹尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L⁻¹尿素及24%甲酰胺）的线性浓度梯度。每个加样孔中加入约300 ng的PCR产物。将凝胶浸没于装有1×TAE缓冲液（40 mmol·L⁻¹ Tris base，40 mmol·L⁻¹冰醋酸，1 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸）的电泳槽中，使用Bio-Rad Dcode系统恒定60 V电压，58 °C下电泳17 h。电泳完成后，TAE缓冲液漂洗凝胶，含0.5 µg·mL⁻¹溴化乙锭的1×TAE缓冲液染色15 min后用1×TAE漂洗15 min洗去多余染料。使用Molecular Imager Gel Documentation system获取并记录PCR-DGGE凝胶的数码图像[3]。

1.6. 数据分析

使用Quantity one软件标记PCR-DGGE图谱条带，并使用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）构建系统发育树，得到相似性矩阵（similarity matrix）。使用Quantity one软件导出实验数据后，计算多样性指数（Shannon index）及PCR-DGGE条带数。

采用SPSS 16.0软件进行统计分析。数据服从正态分布者采用独立样本t检验，不服从者采用独立样本t′检验。

2. 结果

2.1. PCR-DGGE图谱分析

乳牙列组PCR-DGGE图谱见图1。泳道2~6、8、11为有龋者，7、9、10、12~21为无龋者。

图 1. 乳牙列组PCR-DGGE图谱.

Fig 1 The PCR-DGGE profile of the twins in the primary dentition

1：Marker；2-3、4-5、6-7、8-9、10-11、12-13、14-15、16-17、18-19、20-21分别为对应双生子。

混合牙列组PCR-DGGE图谱见图2。泳道9~13、16~20为有龋者，1~8、14、15为无龋者。

图 2. 混合牙列组PCR-DGGE图谱.

Fig 2 The PCR-DGGE profile of the twins in the mixed dentition

1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20分别为对应双生子。

2.2. UPGMA系统发育树

乳牙列组UPGMA系统发育树见图3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19为异卵双生子，8-9、12-13、20-21为同卵双生子。除6-7这对双生子外，其余9对双生子之间均出现明显聚类（90%），但同卵双生子和异卵双生子间无统计学差异（P>0.05）。

图 3. 乳牙列组UPGMA系统发育树.

Fig 3 The UPGMA analysis of the children in primary dentition

1：Marker；2-3、4-5、6-7、8-9、10-11、12-13、14-15、16-17、18-19、20-21分别为对应双生子。

混合牙列组UPGMA系统发育树见图4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20为同卵双生子，5-6、15-16、17-18为异卵双生子。6对双生子之间有明显聚类（60%），但同卵双生子和异卵双生子之间无统计学差异（P>0.05）。

图 4. 混合牙列组UPGMA系统发育树.

Fig 4 The UPGMA analysis of the children in mixed dentition

1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12、13-14、15-16、17-18、19-20为对应双生子。

在乳牙列组中，同卵双生子的相似性为75.70±1.70，异卵双生子的相似性为71.83±6.69，两者间无统计学差异（P=0.21）；混合牙列组中，同卵双生子的相似性为58.53±10.37，异卵双生子的相似性为57.87±21.51，两者间无统计学差异（P=0.86）。这说明在乳牙列及混合牙列同卵及异卵双生子中，口腔微生物组成的相似性无明显差异，遗传因素对口腔菌群微生物构成的作用可能小于环境因素。

2.3. 口腔微生物多样性分析

双生子儿童口腔微生物PCR-DGGE条带数及多样性指数分析见表1。乳牙列组中，有龋儿童的PCR-DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，且两者间均具有统计学差异（P<0.05）。混合牙列组中，有龋儿童的PCR-DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，但两者间均无统计学差异（P>0.05）。

表 1. 双生子儿童口腔微生物PCR-DGGE图谱条带数及多样性指数分析.

Tab 1 The comparison of PCR-DGGE band and Shannon index of twins

项目	乳牙列组			混合牙列组
	有龋	无龋	P值	有龋	无龋	P值
PCR-DGGE条带数	11.00±1.56	14.00±2.74	0.03	11.88±4.05	14.31±5.71	0.84
多样性指数	1.05±0.36	1.44±0.37	0.04	1.18±0.36	1.28±0.47	0.59

3. 讨论

PCR-DGGE是一种非培养指纹图谱方法，通过PCR-DGGE方法可以在同一块胶上观察不同的细菌种类。利用细菌16S rRNA基因进行PCR特异性扩增结合DGGE分析已成为研究微生物群落多样性的常规方法。本研究发现乳牙列组有龋儿童中，唾液细菌的多样性较低，而无龋儿童唾液细菌的多样性较高。在混合牙列双生子中，虽然无龋与有龋儿童的细菌多样性无统计学差异，但仍能看出患龋后微生物多样性减少的趋势。推测其可能的原因是：有龋儿童口腔内可能有更高比例的产酸菌及耐酸菌[4]–[5]，且其口腔微环境可能更适合致龋菌的生存，所以致龋菌的比例升高，从而导致细菌整体丰度下降[6]–[7]。

在本研究中，通过PCR-DGGE聚类分析可以发现，大多数双生子出现明显聚类，其中，乳牙列双生子中有9对出现明显聚类（90%），混合牙列双生子中有6对出现明显聚类（60%），这证明在大部分双生子之间，口腔菌群微生物构成的相似性非常高。但同时可以看到，无论是乳牙列还是混合牙列，同卵双生子和异卵双生子之间的口腔菌群相似性均没有明显差异，说明在口腔微生物菌群构成中，环境因素（共同生活等）的影响可能更大于遗传因素。同时，乳牙列儿童双生子的口腔菌群构成相似程度（90%）与混合牙列双生子的菌群构成相似程度（60%）不同，这与其他学者[8]的研究结果相吻合。

Corby等[9]的研究显示，遗传因素对唾液中的细菌定植有显著影响。其他学者[10]的研究也证实遗传因素对人及动物模型中唾液变异链球菌的定植及龋易感性均有明显影响。本研究结果也显示，有龋儿童及无龋儿童唾液微生物的种类有所不同，有龋儿童的唾液微生物种类减少。在同卵及异卵双生子中，均发现有较高的口腔微生物菌群相似性，而这种相似性在同卵双生子及异卵双生子之间没有发现差异。混合牙列双生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列双生子，可以由此推测，在口腔微生物菌群构成中，环境的作用可能大于遗传的作用。

Funding Statement

[基金项目] 国家国际科技合作专项基金资助项目（2011DFA30940）；国家科技部“973计划”前期研究专项课题基金资助项目（2011CB512108）；四川省科技支撑计划基金资助项目（2013xz0024）