Abstract
目的
通过建立人免疫重建重症联合免疫缺陷（SCID）荷瘤鼠嵌合模型来探讨4-1BBL-B7-H3基因在非特异性抗肿瘤免疫中的作用。
方法
将40只SCID鼠随机分为5组，A组（对照组）行免疫重建加注射Tca8113细胞；B组（Ad4-1BBL-B7-H3组）行免疫重建加注射含有人4-1BBL-B7-H3基因腺病毒转染的Tca8113细胞；C组（空载组）行免疫重建加注射含有空载体腺病毒转染的Tca8113细胞；D组（非免疫重建组）不给予小鼠免疫重建，注射Tca8113细胞；E组（非肿瘤组）行免疫重建加注射PBS。每周定期测量肿瘤体积；酶联免疫吸附法检测人IgG蛋白含量；流式细胞仪检测外周血中人CD3+、CD56+淋巴细胞比例；免疫组织化学法观察自然杀伤细胞2族成员D（NKG2D）和Toll样受体2（TLR2）在肿瘤中的表达；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测4-1BBL-B7-H3 mRNA的表达，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测主要组织相容性复合体1类相关分子（M1C）A、B及TLR2的表达。
结果
1）B组小鼠肿瘤体积最小（P<0.05）；2）A、B、C、E组小鼠外周血中检测到人IgG、CD3+、CD56+淋巴细胞，B组淋巴细胞比例高于A、C和E组（P<0.05）；3）B组NKG2D和TLR2的表达较其余各组明显增强；4）人4-1BBL-B7-H3基因在B组小鼠肿瘤中稳定表达；5）B组M1CA、M1CB和TLR2的表达高于A、C、D组（P<0.05）。
结论
4-1BBL-B7-H3基因在肿瘤组织中的高表达能成功诱导人CD3+、CD56+细胞增殖，直接或间接活化TLR2，上调NKG2D及其配体M1CA、M1CB的表达，从而产生有效的抗肿瘤免疫应答。
Keywords: 4-1BBL-B7-H3基因, 重症联合免疫缺陷鼠, 口腔鳞癌细胞株, 抗肿瘤免疫
Abstract
Objective
The non-specific antitumor immunity effect of 4-1BBL-B7-H3 gene was investigated by establishing an oral squamous cell carcinoma human peripheral blood lymphocyte-severe combined immunodeficient (SCID) mice chimeric model.
Methods
Forty mice were randomly divided into five groups. All groups, except the non-immune reconstitution group (group D), had reconstructed human partial immune system. The control group (group A) was injected with Tca8113 cells. The Ad4-1BBL-B7-H3 group (group B) was injected with Tca8113 cells transfected by adenovirus containing 4-1BBL-B7-H3 gene. The empty vector group (group C) was injected with Tca8113 cells transfected by adenovirus containing an empty vector. The non-immune reconstitution group (group D) was injected with Tca8113 cells. The non-tumor group (group E) was injected with PBS. The tumor volumes in each group were measured weekly. Human IgG in blood was obtained through the tail vein and was determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Human CD3+ and D56+ lymphocytes were assessed by flow cytometry. Model animals were killed on the ninth week. Differences in the expression of the natural killer group 2 member D (NKG2D) and toll-like receptor 2 (TLR2) in tumor tissues of each group were observed by immunohistochemical method. 4-1BBL-B7-H3 gene expression in mice tumor tissues was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) and the expressions of major histocompatibility complex 1 class related molecule (M1C) A, M1CB, and TLR2 were detected by real-time quantitative PCR.
Results
The tumor volumes of group B were remarkably lower than those in the other groups (P<0.05). Human IgG and CD3+ and CD56+ lymphocytes were detected in the peripheral blood of immune-reconstituted mice. These lymphocytes were remarkably higher in group B than those in groups A, C, and E (P<0.05). Higher NKG2D and TLR2 expression were observed in group B tumor than those in the other groups. The stable expression of 4-1BBL-B7-H3 gene in group B was proven. The expression of M1CA, M1CB, and TLR2 were significantly higher in the group B tumor than those in groups A, C, and D (P<0.05).
Conclusion
The high 4-1BBL-B7-H3 gene expression in tumor tissues could successfully induce the proliferation of CD3+ and CD56+ lymphocytes. This expression can also directly or indirectly activate TLR2 and up-regulate the expression of NKG2D and its ligands (M1CA and M1CB), which result in an effective antitumor immune response.
Keywords: 4-1BBL-B7-H3 gene, severe combined immunodeficient mice, oral squamous cell carcinoma line, antitumor immunity
口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部常见的肿瘤，给患者生命和生活质量带来严重影响。近年来，人们越来越关注于肿瘤的免疫治疗[1]。4-1BBL和B7-H3是获得性免疫的共刺激分子[2]，B7-H3-TLT-2共刺激信号主要在T细胞活化的前期起作用，促进T细胞增殖并维持其短期的存活；4-1BB/4-1BBL信号主要在T细胞反应后期维持T细胞的生存及免疫记忆应答中起重要作用。本课题前期研究已构建了表达4-1BBL或B7-H3单基因口腔癌细胞瘤苗和共表达4-1BBL-B7-H3双基因口腔癌细胞瘤苗，体内外实验均表明：4-1BBL和B7-H3联合可以增强肿瘤免疫原性从而延长抗瘤免疫的作用，同时二者还有交叉促进作用；4-1BBL可以提高B7-H3的共刺激性且延长细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）的活性；在刺激肿瘤特异性CTL细胞增殖作用中4-1BBL的优化功能需要B7-H3的交互作用，这一交互作用被阻断，则CTL细胞上的4-1BBL的表达会下降且CTL细胞的活性也减低；表达4-1BBL-B7-H3基因的口腔癌细胞瘤苗也能增加T细胞的非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-1限制性细胞毒作用[3]。本课题希望进一步深入探讨的是4-1BBL-B7-H3基因修饰瘤苗是否能够调节T细胞特殊亚群自然杀伤T细胞（natural killer T，NKT）（如CD3+、CD56+）和γδT细胞[如Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）]、NK细胞表面活化受体自然杀伤细胞2族成员D（natural killer group 2 member D，NKG2D）及其配体主要组织相容性复合体1类相关分子（major histocompatibility complex 1 class related molecule，M1C）A、B的表达，从而调节其所执行的非特异性抗瘤免疫功能。重症联合免疫缺陷（severe combined immunodeficienct，SCID）鼠是一种T、B细胞严重联合免疫缺陷小鼠，排斥反应小，有利于肿瘤和肿瘤免疫的研究。本研究通过腹腔注射人外周血淋巴细胞（human peripheral blood lymphocyte，PBL）、皮下注射口腔鳞癌细胞建立人免疫重建荷口腔鳞癌SCID小鼠嵌合模型，来观察4-1BBL-B7-H3基因在抗肿瘤免疫中的抑瘤作用并初步探讨其机制，以期为临床治疗提供参考。
1. 材料和方法
1.1. 实验动物
SCID鼠4~5周龄，40只，雌、雄各半，18~25 g，购自中国医学科学院实验动物所。无特定病原体无菌条件下饲养SCID鼠，温度25 °C，相对湿度40%~70％，光照12/24 h，换气量每小时8~10次体积。笼具、饲料、水、垫料均高压消毒，每3 d无菌条件下更换一次，饲养在无菌层流柜中。每天对饲养盒外环境消毒。本实验获得了北京大学深圳医院实验室实验动物伦理委员会的批准。
1.2. 细胞及主要试剂
人口腔鳞癌Tca8113细胞株由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室提供；载有绿色荧光蛋白及人4-1BBL-B7-H3基因的腺病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。ELISA试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司），逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）试剂盒（广州瑞真生物技术有限公司），FITC-PE标记的流式抗体人CD3+、CD56+NKT及NKG2D、TLR2抗体（Abcam香港有限公司），胎牛血清、RPMI 1640培养基和淋巴细胞分离液（深圳欣海凌生物科技有限公司）。
1.3. 实验分组及设计
将40只SCID鼠随机分入A~E共5组中，每组8只，4雌4雄。A组（对照组）：免疫重建加注射Tca8113细胞；B组（Ad4-1BBL-B7-H3组）：免疫重建加注射含有人4-1BBL-B7-H3基因腺病毒转染的Tca8113细胞；C组（空载组）：免疫重建加注射含有空载体腺病毒转染的Tca8113细胞；D组（非免疫重建组）：不给予小鼠免疫重建，注射Tca8113细胞；E组（非肿瘤组）：免疫重建加注射PBS。
1.4. 制备肿瘤细胞
Tca8113细胞株解冻复苏，37 °C、5％CO2条件下于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。取对数生长期贴壁生长的细胞，经0.25％胰蛋白酶消化后，用PBS缓冲液洗涤3次，计数后配制成1×1010·L−1的Tca8113肿瘤细胞悬液备用。B、C组再分别将含人4-1BBL-B7-H3基因腺病毒和含空载体的腺病毒转染Tca8113肿瘤细胞，制备成瘤苗备用。
1.5. 分离及培养人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）
取健康志愿者外周血，采用Ficoll密度梯度离心法分离得到PBMC，培养在含10％灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液中2 h后，除去贴壁细胞，在培养基中添加人CD3+单克隆抗体（1 g·mL−1）以及人重组白细胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rIL-2）200 U·mL−1，继续培养3 d后收集。
1.6. 建立人口腔鳞癌PBL-SCID小鼠嵌合模型
先采集鼠血200 µL，经酶联免疫吸附法测定IgG小于5 µg·mL−1者进行实验，排除免疫渗漏。调整人外周血单核细胞浓度为6.0×107·mL−1。根据分组，A、B、C、E组SCID小鼠腹腔注射0.5 mLPBMC，D组腹腔注射0.5 mL PBS；1 d后将事先制备好处于对数生长期的Tca8113细胞注入A、B、C、D组SCID小鼠背部皮下，每只鼠5×106个细胞（0.2 mL）。E组小鼠背部皮下注入PBS。然后注射rIL-2，每次2 000 U，每周2次，连续注射3周。
1.7. 检测及鉴定
每周定期观察小鼠的生物学行为，并测量肿瘤体积，通过游标卡尺测量瘤体最长径（a）和最短径（b），按体积（V）=0.5×ab2的公式计算肿瘤体积。
免疫重建后第3、5、7周分别取尾静脉血，每次100 µL，酶联免疫吸附法检测人IgG蛋白含量。
第8周通过摘眼球取血，各提取2份，分离出PBMC，分别加入FITC-PE标记的人CD3+、CD56+的双抗，于4 °C反应30 min，溶血素溶血5 min，PBS洗涤3次，流式细胞仪检测淋巴细胞比例。
第9周颈椎脱臼法杀死小鼠，观察并记录肿瘤外观特点。倒置荧光显微镜下观察各组肿瘤细胞转染腺病毒载体是否成功及肿瘤组织冰冻切片中人4-1BBL-B7-H3的表达。免疫组织化学法观察各组小鼠肿瘤中NKG2D和TLR2的表达情况。
取各组原位肿瘤50 mg研磨后，加Trizol提取总RNA。1）RT-PCR法检测人4-1BB-B7-H3 mRNA的表达，由于人4-1BBL-B7-H3完整的引物难以设计，故分别检测4-1BBL mRNA和B7-H3 mRNA在肿瘤组织中的表达情况。RT-PCR引物如下。4-1BBL上游引物：5′-CGGGCTCCGTTTCACTTGCG-3′；下游引物：5′-AGTCCGGCTGGGATTTCG-3′，扩增片段长271 bp。B7-H3上游引物：5′-CGCACGGCTCTGTCACCATCA-3′；下游引物：5′-TCAGAGGCTGCAGGGCTGTCTTG-3′，扩增片段长591 bp。2）RT-qPCR法检测各组肿瘤组织中M1CA、M1CB、TLR2的mRNA表达。RT-qPCR引物如下。GAPDH上游引物：5′-CATGAGAAGTATGACAACAG-3′；下游引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。M1CA上游引物：5′-CTGTCCTGGGATGGATCTGT-3′；下游引物：5′-TTTCCGTTCCCTGTCAAGTC-3′；M1CB上游引物：5′-GTTCGGGAATGGAGAAGTCA-3′；下游引物：5′-TGTGACGTTCATAGCCAAGG-3′，TLR2上游引物：5′-CCTGGGCAGTCTTGAACATT-3′；下游引物：5′-TTCCCACTCTCAGGATTTGC-3′。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。具体操作参照RT-PCR、RT-qPCR试剂盒说明进行。
1.8. 统计分析
采用SPSS 13.0软件包进行分析。组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 人口腔鳞癌PBL-SCID小鼠嵌合模型构建成功
A、B、C、E组小鼠免疫重建2周后均可检测到人IgG，D组未检测到人IgG，表明嵌合模型免疫重建成功。第3、5、7周人IgG含量检测结果见表1。
表 1. SCID小鼠外周血中人IgG含量.
Tab 1 The amount of human IgG in peripheral blood of SCID
| 组别 | 人IgG含量 |
||
| 第3周 | 第5周 | 第7周 | |
| A | 31.25±3.91 | 143.86±21.33 | 398.01±10.42 |
| B | 48.29±6.35 | 205.26±12.10 | 382.98±16.71 |
| C | 41.37±20.56 | 192.89±15.01 | 391.27±3.68 |
| D | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| E | 39.38±2.21 | 156.33±12.45 | 390.02±8.69 |
µg·mL−1, x±s
倒置荧光显微镜下，B、C组均可见大量绿色荧光（图1），A、D组均未见绿色荧光，表明Tca8113细胞成功转染腺病毒载体。
图 1. B（左）、C（右）组可见大量绿色荧光 倒置荧光显微镜 × 40.
Fig 1 Multiplicity green fluorescence were observed of group B and group C inverted fluorescence microscope × 40
2.2. SCID小鼠肿瘤生长情况
A、B、C、D组的小鼠成瘤率均为100%，成瘤潜伏期为（13.68±1.55）、（16.92±1.68）、（13.90±1.27）、（10.16±1.36）d；统计分析表明，B组较其他3组成瘤潜伏期延长（P<0.05），A组与C组无统计学差异（P=0.069），D组较其他3组成瘤潜伏期缩短（P<0.05）。A、B、C、D组的肿瘤大小见图2。统计分析表明，D组最大（P<0.05），B组最小（P<0.05），A组与C组间无统计学差异（P=0.068）。
图 2. 各组SCID小鼠肿瘤生长曲线.
Fig 2 Tumor growth curve of SCID in each group
2.3. 流式细胞仪检测小鼠体内淋巴细胞
第8周A、B、C、E组小鼠外周血中均能检测到人CD3+、CD56+淋巴细胞，B组淋巴细胞比例高于A、C和E组（P<0.05）（表2）。
表 2. SCID小鼠外周血中人CD3+、CD56+淋巴细胞比例.
Tab 2 The ratio of CD3+, CD56+ lymphocytes in peripheral blood of SCID
| 组别 | CD3+ | CD56+ |
| A | 13.98±1.52 | 9.58±1.35 |
| B | 28.56±1.83 | 24.36±0.78 |
| C | 14.32±0.61 | 11.02±1.43 |
| D | 0.00 | 0.00 |
| E | 14.01±0.96 | 10.88±1.62 |
%, x±s
2.4. SCID鼠生物学特性及肿瘤外观特点
除D组小鼠出现不同程度的消瘦及行为异常，2只小鼠分别于第6周和第7周死亡外，其余各组小鼠均未出现明显的行为异常。9周处死小鼠后，解剖可见肿瘤组织表面光滑，呈淡红色，无明显包膜，活动度中等，未见出血坏死灶，B组小鼠肿瘤体积较其余3组小，无明显的器官转移。
2.5. 倒置荧光显微镜观察
2.5.1. 人4-1BBL-B7-H3在肿瘤组织中的表达
9周处死小鼠后，B组肿瘤组织冰冻切片在倒置荧光显微镜下发出大量绿色荧光（图3），其余3组均未见绿色荧光。
图 3. B组小鼠肿瘤组织人4-1BBL-B7-H3蛋白的表达 倒置荧光显微镜 × 40.
Fig 3 Expression of human 4-1BBL-B7-H3 protein in tumor tissue of group B inverted fluorescence microscope × 40
2.5.2. NKG2D和TLR2在肿瘤中的表达
各组小鼠肿瘤组织中NKG2D和TLR2的表达情况见图4和5。从图中可见，B组NKG2D和TLR2的表达较其余各组明显增强。
图 4. 各组小鼠肿瘤组织中NKG2D的表达 免疫组织化学 × 40.
Fig 4 Expression of NKG2D in tumor tissue of each group immunohistochemistry × 40
从左到右依次为A、B、C、D组。
图 5. 各组小鼠肿瘤组织中TLR2的表达 免疫组织化学 × 40.
Fig 5 Expression of TLR2 in tumor tissue of each group immunohistochemistry × 40
从左到右依次为A、B、C、D组。
2.6. RT-qPCR法检测肿瘤中M1CA、M1CB和TLR2的表达
RT-qPCR法检测表明，与A、C和D组相比较，B组小鼠肿瘤中M1CA表达显著增高（PA=0.000 3，PC<0.000 1，PD=0.000 1），M1CB表达显著增高（PA=0.000 3，PC=0.003 1，PD<0.000 1)，TLR2表达显著增高（PA=0.001 4，PC=0.001 8，PD=0.000 8）（图6）。
图 6. RT-qPCR检测各组M1CA、M1CB和TLR2的表达.
Fig 6 Expression of M1CA, M1CB and TLR2 of each group by RT-qPCR
从左到右依次为M1CA、M1CB和TLR2。
2.7. RT-PCR法检测人4-1BBL/B7-H3 mRNA在肿瘤中的表达
RT-PCR法检测到人4-1BBL/B7-H3 mRNA在B组小鼠肿瘤组织内表达（图7），其余3组肿瘤组织中未见PCR产物。PCR产物电泳结果表明，4-1BBL扩增产物的大小约271 bp，B7-H3扩增产物的大小约951 bp，与预期大小一致。表明人4-1BBL-B7-H3腺病毒载体转染成功，在肿瘤组织中稳定表达。
图 7. RT-PCR法检测B组小鼠肿瘤组织中4-1BBL/B7-H3 mRNA 的表达.
Fig 7 Expression of human 4-1BBL/B7-H3 mRNA in tumor tissues of group B detected by RT-PCR
3. 讨论
NKT、γδT细胞是比较特殊的T细胞亚群，均具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合体限制性杀瘤优点[4]–[6]。NK细胞活化受体NKG2D可感应内环境变化，在各种危险信号如病毒或细菌感染、恶性转化或高剂量照射等情况下，NKG2D及其配体（如人M1CA蛋白）等诱导表达，发挥NK样细胞毒作用，在抗肿瘤免疫、获得性免疫应答及免疫调节中发挥重要作用。
4-1BBL可以不依赖于抗原，直接促进记忆T细胞的增殖[7]–[10]。B7-H3与4-1BBL同属于活化T细胞的共刺激分子，在多种组织细胞中广泛表达[11]–[13]，对免疫发挥正调节作用。许多肿瘤细胞呈弱免疫原性或无免疫原性以及表面缺乏人4-1BBL、B7-H3等共刺激分子表达，是肿瘤免疫逃逸的原因之一[1]。
SCID小鼠是1983年Bosma首次报道的一种以细胞和体液严重联合免疫缺陷为特征的近交系小鼠。研究[14]表明，SCID小鼠比裸鼠更适合人类肿瘤生长、转移，是目前研究肿瘤免疫比较理想的动物模型[15]–[16]。本实验成功构建了人口腔鳞癌PBL-SCID小鼠嵌合模型，实验过程中非免疫重建组2只小鼠死亡，可能系肿瘤发展较快所致，对实验结果几乎不造成影响。免疫重建组小鼠外周血中检测到IgG蛋白和人CD3+、CD56+T淋巴细胞，而非免疫重建组未检测到，表明嵌合模型免疫重建成功。在此基础上，于小鼠背部皮下注射口腔鳞癌细胞株Tca8113较好地模拟了人口腔鳞癌的发生发展过程。从实验结果来看：Ad4-1BBL-B7-H3组肿瘤组织冰冻切片在倒置荧光显微镜下发出大量绿色荧光，且RT-PCR法检测到人4-1BBL/B7-H3mRNA在肿瘤中表达，表明4-1BBL-B7-H3在小鼠肿瘤组织中稳定表达。免疫组织化学观察到Ad4-1BBL-B7-H3组肿瘤组织中NKG2D和TLR2表达明显增强，RT-qPCR法检测到肿瘤中M1CA、M1CB和TLR2的表达显著增高，而小鼠肿瘤体积较其余3组小，表明4-1BBL-B7-H3双基因修饰瘤苗可能与T细胞特殊亚群NKT和γδT细胞的相应配体结合，通过促进CD3+、CD56+细胞增殖，直接或间接地活化TLR2，诱导NKG2D及其配体M1CA、M1CB的表达，促进非特异性抗肿瘤免疫。4-1BBL-B7-H3双基因修饰瘤苗的成功应用将为恶性肿瘤的治疗提供高效、特异的免疫活性细胞和具有广谱抗瘤活性的天然免疫细胞，对放化疗效果差的口腔鳞癌患者开辟一条新的治疗途径。
Funding Statement
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（30973339）；广东省自然科学基金资助项目（S2012010010382）；广东省科技厅国际合作基金资助项目（2010B050100007）；深圳市基础研究基金资助项目（JC201105201030A）；深圳市国际合作基金资助项目（ZYA201106100080A）
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