唾液的诊断应用研究

Abstract

Saliva is secreted by salivary glands and performs a variety of functions, including mouth cleaning and protection, antibacterial activity, and digestion. With the rapid progress in salivaomics, saliva became recognized as a potential pool of biological markers. Being a non-invasive and safe source, saliva is a potential substitute for blood in diagnosis and prognosis of diseases. This review summarizes the latest advancement in saliva-related studies and presents the potential value of saliva in early diagnosis of oral diseases, such as dental caries, periodontal disease, cancer, diabetes, and other systemic disorders. Saliva biomarkers can reveal changes ranging from changes in biochemical index, DNA, RNA, and proteins to the diversification of microbiota structure. By integrating recent data, this paper discusses the clinical significance and application prospect of saliva in early diagnosis of diseases and in translational and precision medicine.

唾液是龈沟液、黏膜渗出液、唾液腺腺泡超渗液的混合体，由口腔腺体分泌产生，具有清洁和保护口腔、抗菌、消化等多种功能。唾液腺渗透性高，周围富集毛细血管，血液和腺泡可进行分子交换，使得血液循环中的生物标志物可渗透到腺泡，最终分泌到唾液中。人的唾液中99%成分是水，有机物主要是唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白及溶菌酶等，无机物有钠、钾、钙、氯和硫氰离子等。唾液使口腔湿润，可清洁口腔，冲洗残留在口腔里的食物残屑；可润滑食物，唾液淀粉酶在胃内可分解食物中的淀粉为麦芽糖；唾液中的溶菌酶和硫氰离子具有杀菌作用；唾液还有排泄功能，如体内碘化钾、铅、汞、狂犬病及脊髓灰质炎病毒和艾滋病病毒等可经唾液排泄或传播。唾液是一个潜在的巨大生物标志物储存库。唾液采集无侵袭性，采集人员不需要严格专业的医学训练，不会出现采集血液时的紧张和疼痛，也可避免采集尿液样本时出现的尴尬情景；唾液采集过程相对安全，可避免病毒的传播，有望成为血液的替代品；唾液中富含DNA、RNA和蛋白质信息以及丰富的微生物和多种代谢产物。这些优势使得学者们开始探索唾液在疾病诊断中的作用。

1. 唾液成分研究

唾液成分复杂，含有大量尿素、氨、尿酸、葡萄糖、胆固醇、脂肪酸、甘油二/三酯、中性脂质、糖脂、氨基酸、类固醇激素和黏蛋白、淀粉酶、凝集素、糖蛋白、溶菌酶、过氧化物酶、乳铁蛋白和分泌型IgA、溶菌酶、髓过氧化物酶、富组蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、黏蛋白G1和G2、防御素等；唾液中含有大量来自于血浆的Na⁺、Cl^–、Ca²⁺、K⁺、HCO₃^–、H₂PO₄^–、F^–、I^–、Mg²⁺等离子成分；同时，唾液中含有大量与口腔及全身系统性疾病相关的700多种微生物。

最新研究显示，唾液成分的变化与机体病理生理状态密切相关，被视为“人体健康状态的窗口”。分析唾液成分变化可有效反映机体生理和病理状态。随着唾液相关研究的进展，学者们提出了唾液组学的概念。唾液组学涵盖了唾液基因组学、转录组学、蛋白质组学、微生物组学、代谢组学和miRNA等领域研究内容，旨在探寻唾液中与疾病相关生物标志物。Wong[1]建立了专业唾液组学数据库（Salivaomics Knowledge Base，SKB），其是目前唯一致力于唾液组学研究的网站，搜集了大量人类唾液生物学、药物蛋白质组学、药物基因组学等研究方面的信息（http://www.skb.edu），并对其进行系统管理。目前利用“唾液组学”技术，在唾液中先后发现了多种与口腔以及机体系统性疾病相关的生物标志物[2]。研究发现，囊性纤维化患者唾液中Ca²⁺、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、前列腺素（prostaglandin，PG）E2等显著升高；干燥综合征患者唾液Na⁺、Cl^–以及IgA、IgG升高，磷酸盐水平降低。唾液中肿瘤标志物是近年来的研究热点，研究发现乳腺癌患者唾液中可检测到c-erbB-2、CA15-3等肿瘤抗原，卵巢癌的唾液标志物为CA125等。此外，心血管疾病、细菌和病毒感染性疾病等均可在唾液中检测到相应的生物标志物。因此，系统研究唾液疾病相关生物标志物不仅具有巨大的理论科学意义，还具有重要的临床应用价值和社会价值。

2. 唾液诊断口腔疾病

2.1. 龋病

龋病是口腔微生态失调引起的细菌性疾病。与龋病发生密切相关的细菌检测，可以作为龋活跃性诊断的重要指标。变异链球菌是公认的龋病相关菌。唾液中变异链球菌和乳酸杆菌数目的增加与龋病患病率的增加密切相关。Samaranayake[3]采用刺激性唾液在选择性培养基中孵育24 h后发现，龋活跃人群的变异链球菌大于1×10⁹ CFU·L⁻¹，乳杆菌大于1×10⁸ CFU·L⁻¹；非龋活跃人群的变异链球菌小于1×10⁸ CFU·L⁻¹，乳杆菌小于1×10⁷ CFU·L⁻¹。唾液菌群的结构和功能均可以作为预测成人龋病发生的标记。Yang等[4]通过宏基因组学手段分析了19个龋活跃个体和26个无龋个体唾液微生物群落后发现，龋病组和无龋组人群的微生物群落构成明显不同，龋病个体唾液中普雷沃菌属丰度较高，且其菌种分布与健康组之间有显著差别。目前尚未发现龋病特异性运算的分类单位（operational taxonomic units，OTU），但发现了147个OTU与龋病相关，可作为评估龋病风险和预后的生物标志物。学者[5]近期发现儿童口腔唾液和菌斑等位点菌群的结构和功能均可反映龋病情况，首次提出了“龋病菌群指数”（microbial indicators of caries，MiC），该指数不仅可作为诊断口腔健康状态的生物学指标，也可在龋病临床症状出现之前，预测龋病发生风险。另外，单独基于普雷沃菌属与基于口腔微生物群落整体构建的模型间疾病预测精准度几乎一致，提示普雷沃菌属在龋病预测中具有重要价值[5]。唾液蛋白质组的特异性变化也可用于鉴别龋病高危人群，如富脯氨酸以及组肽-1和富酪蛋白水平的下降与龋病发生密切相关。唾液的生化特性，如缓冲能力和pH值的变化也可作为评估龋病发生的指标。基于高通量基因芯片和测序技术的唾液基因组、蛋白组和转录组研究有望在不久的将来进一步揭示与龋病发生密切相关的生物标志物。

2.2. 牙周病

牙周病是口腔微生态失调引起的细菌感染性疾病，与全身等因素有着密切关系。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是慢性牙周炎的主要致病菌。近期有学者开发了一种基于唾液P. gingivalis的诊断试剂盒，通过两种特异性单克隆抗体，检测唾液中的P. gingivalis。该试剂盒可检测5×10⁴~5×10⁵个 ·mL⁻¹浓度范围内的P. gingivalis实验室菌株和临床分离株，且可在90 s内得到结果。与逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）结果相比，该试剂盒检测灵敏度达到92%，特异度可达96%，有望成为一种简单、快速、有效的椅旁检测P. gingivalis工具[6]。近期一项研究检测了健康人群、侵袭性牙周炎、慢性牙周炎、牙龈炎患者唾液和龈沟液中肾上腺髓质素和一氧化氮水平，发现侵袭性牙周炎患者唾液中两者水平显著升高，慢性牙周炎、侵袭性牙周炎和牙龈炎患者龈沟液中一氧化氮水平升高，牙周炎患者龈沟液中肾上腺髓质素水平高于牙龈炎组。上述研究结果提示，肾上腺髓质素和一氧化氮在牙周病发病机制中存在一定联系，两者在唾液和龈沟液中的不同水平可能和不同种类及不同严重程度的牙周病相关，有望成为诊断侵袭性牙周炎的潜在手段[7]。与龈沟液相比，唾液中一氧化氮及其终产物水平的检测在牙周病的诊断中更有参考意义[8]。

吸烟是牙周病的危险因素之一。研究[9]发现吸烟者唾液中超氧化物歧化酶水平与牙周炎临床症状呈正相关关系，提示唾液有望成为早期诊断癌前病变的重要介质。唾液中蛋白质和代谢产物等分子也可能是潜在的牙周病诊断标志物。研究发现可通过唾液中白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-8、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、PGE2和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）浓度对健康人群与牙龈炎和牙周炎患者进行区分[10]。牙周炎患者唾液中总唾液酸量、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、IL-18、尿酸、天冬氨酸转氨酶、降钙素原水平高于正常健康组，并与牙龈指数、探诊深度和附着水平正相关，有望成为诊断牙周病及其治疗预后的新手段[11]–[13]。另外，有学者[14]开发了一种漱口液，可通过检测唾液中嗜中性粒细胞丰度来筛查牙周病，有望实现基础研究成果的椅旁转化应用。

2.3. 口腔癌

恶性肿瘤的发生发展与特异性基因突变相关，血清、唾液和其他体液中的肿瘤特异性DNA标志物可用于口腔和其他部位肿瘤的诊断。62.5%的口腔癌患者存在唾液DNA p53基因突变，在头颈部癌症患者的唾液和癌组织中存在着线粒体DNA质量增加；手术切除肿瘤后，线粒体DNA质量减少。在口腔癌患者的唾液中，肿瘤DNA检出率为100%，其他部位肿瘤患者唾液中肿瘤DNA检出率只有47%~70%；相反，血浆中可检出80%口腔癌患者肿瘤DNA及86%~100%患其他部位肿瘤患者特异性DNA。上述结果提示唾液中来自于口腔的肿瘤DNA丰度较高，而血浆中来自其他部位的肿瘤DNA水平更高，唾液肿瘤DNA有望成为检测口腔癌的潜在标志物[15]。唾液中其他致癌病毒，如人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和人类疱疹病毒（human herpesvirus，HHV）-8 DNA也可作为口腔或身体其他部位癌症风险的评估[16]。Park等[17]检测了50位口腔鳞状细胞癌患者和50位健康者唾液miRNA水平，发现miR-125a和miR-200a两种特异性miRNA在口腔鳞状细胞癌患者唾液中水平明显低于健康者，提示唾液miRNA可为疾病的早期诊断提供依据。

唾液中的蛋白质也可用于肿瘤的检测。唾液防御蛋白-1和肿瘤抗原CA15-3以及肿瘤标志蛋白质，如c-erbB2、CA-125和抗肿瘤P53抗体等水平的升高均可作为口腔和其他部位恶性肿瘤的生物学标志[18]。研究显示，透明质酸酶、鸟苷蛋白和IL-6、IL-8可作为潜在的口腔鳞状细胞癌生物学标志物。在头颈部鳞状细胞癌患者的唾液中，腭/肺/鼻上皮癌关联蛋白（palate/lung/nasal epithelial cancer associated protein，PLUNC）和锌-α2-糖蛋白过表达，且这两种蛋白质可促进肿瘤生长，有望成为头颈部鳞状细胞癌防治的潜在靶点[19]。近期研究发现口腔鳞状细胞癌患者唾液中IL-4、IL-10、IL-13和白细胞介素1受体拮抗剂（interleukin 1 receptor antagonist，IL-1RA）等细胞因子升高，其中IL-10和IL-13显著升高，IL-1RA在低分化鳞状细胞癌中的水平显著高于中度分化和高分化鳞状细胞癌患者[20]。类似研究发现中度和低度分化鳞状细胞癌患者唾液中TNF-α水平显著高于高分化鳞状细胞癌和临床Ⅳ期患者，且鳞状细胞癌的组织学分级与TNF-α水平正相关[21]，提示唾液中细胞因子对于早期检测口腔鳞状细胞癌及对鳞状细胞癌精准医疗进行有效分级具有重要意义。

随着高通量测序技术的发展，已经发现微生物在口腔癌发生发展过程中的作用[22]。口腔癌患者唾液微生物机会性致病菌的丰度较健康人群显著增加，不同肿瘤患者唾液微生物组的相似度较健康人群更高[23]。因此，对口腔菌群的检测可能成为鳞状细胞癌筛查的潜在方法。有学者[24]研究了3组口腔鳞状细胞癌患者的唾液微生物，共发现8个门的微生物，主要包括壁厚菌门和杆菌门细菌；微生物的多样性更加丰富，包括860个已知菌种和1 077个不可培养或未归类的菌种。上述研究结果提示，口腔癌的发生伴随着口腔微生物群落结构改变，口腔微生物群落结构在口腔癌的早期诊断中具有潜在意义。

2.4. 舍格伦综合征

舍格伦综合征是一种以口干和眼干为特征的自身免疫性疾病，患者常因口干首次就诊于口腔门诊。随着病情发展，患者唾液流率逐渐降低，唾液成分也发生相应变化，表现为钠和氯离子浓度升高，钙和磷离子浓度基本保持不变。舍格伦综合征患者唾液蛋白组和转录组也呈现出相应变化。研究[25]显示，舍格伦综合征患者唾液蛋白组中有6个显著下调和10个显著上调的蛋白质；唾液中IL-4、IL-5和凝集素水平较正常人群发生显著变化，上述因子在疾病预测方面具有较高准确率。另一项研究[26]发现，19个基因（EPSTI1、IFI44、IFI44L、IFIT1、IFIT2、IFIT3、MX1、OAS1、SAMD9L、PSMB9、STAT1、HERC5、EV12B、CD53、SELL、HLA-DQA1、PTPRC、B2M、TAP2）与舍格伦综合征病理形成过程中的干扰素诱导特性、淋巴细胞渗透作用和抗原呈递等功能密切相关。Hu等[27]在原发性舍格伦综合征患者唾液中发现了组织蛋白酶D、α-烯醇化酶和β2-微球蛋白三种蛋白质标志物以及髓细胞核分化抗原、鸟苷酸连接蛋白-2、IgG-Fc片段低亲和力受体Ⅲb三种mRNA标志物。上述唾液蛋白组和转录组研究结果为舍格伦综合征的早期诊断提供了重要生物学标记。

3. 唾液辅助诊断全身系统性疾病

3.1. 糖尿病

糖尿病是胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。研究发现2型糖尿病患者唾液中α-2-巨球蛋白（α-2-macroglobulin）水平显著升高，血糖控制后其水平下降，提示唾液α-2-巨球蛋白水平检测可用于反映糖尿病患者血糖控制情况[28]。有研究[29]发现，2型糖尿病患者和牙周炎患者唾液中褪黑素水平下降，同时罹患糖尿病和牙周病患者的唾液中褪黑素浓度更低，提示褪黑素在糖尿病和牙周病的发病过程中具有重要作用，可能成为诊断和治疗这两种疾病的关键分子。Barnes等[30]检测了健康人群和糖尿病患者伴有或不伴有牙周病的唾液代谢产物，共检测到475种代谢物。牙周炎不伴有糖尿病患者唾液中细胞能量应急标志物水平、嘌呤降解水平、谷胱甘肽代谢、氧应激相关标志物、氨基酸水平、ω-3/ω-6脂肪酸水平均显著上升。糖尿病患者唾液中葡萄糖和α-羟基丁酸水平上升，碳水化合物、脂类和氧应激相关标志物变化显著。上述代谢标志物可应用于牙周病和糖尿病的诊断、鉴别诊断、治疗和预后评估。还有研究[31]检测了2型糖尿病患者和健康人群唾液、血液中葡萄糖浓度和糖化血红蛋白水平，发现两者间存在正相关关系，提示可通过唾液监测糖尿病患者血糖浓度。

3.2. 心血管疾病

心血管疾病是一系列涉及循环系统的疾病，包括动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病等。Kosaka等[32]纳入了608名日本男性和女性（平均年龄65.4岁）探究唾液炎性细胞因子和动脉粥样硬化、牙周病之间的关系，发现唾液中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等炎性细胞因子水平在牙周病和动脉粥样硬化中均升高，是筛查和诊断这两种疾病的潜在生物标志物。Miller等[33]发现唾液中C反应蛋白是最能预测急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的标志物，与心电图联用，预测AMI的敏感度为80%，特异度达100%，提示唾液标志物与心电图联用在诊断AMI方面具有潜在前景，当患者被怀疑患有AMI时，唾液相关检测可提供许多信息。心血管疾病患者唾液中α-2-HS-糖蛋白水平增高，提示分析唾液中多肽可为早期诊断心血管疾病提供潜在分子手段[34]。

3.3. 病毒感染

通过鉴定唾液中病毒DNA、RNA、抗原、抗体，可检测病毒感染。在蛋白组学水平，通过检测唾液中抗病毒抗体可确定相关病毒感染，如甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、HIV-1、麻疹病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒和流行性腮腺炎病毒等。一种名为OraQuickÂ^® HCV的快速抗体检测法可通过检测唾液，快速筛查丙肝病毒感染[35]。此外，通过唾液检测登革病毒RNA和非结构蛋白1抗原（non-structural protein 1 antigen）是一种诊断登革病毒感染的有效方法[36]。Nefzi等[37]发现对于HHV-6和人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），唾液检测比血液检测更加灵敏。

3.4. 胰腺癌

胰腺癌发病率低但致死率高，在西方国家每年新发生的癌症总数中仅占3%，但致死率却排在第4位[38]。因此，亟需在胰腺癌早期做出诊断和分类，使患者获得最佳治疗时机。在啮齿类动物的胰腺癌模型上，一种类似外泌体（exosome）的囊泡可携带、传递和转运肿瘤特异性生物标志物到唾液中[39]。研究发现胰腺癌患者的唾液中KRAS、MBD3L2、ACRV1和DPM1 4种mRNA可以有效区分胰腺炎患者与健康人群[40]。hsa-miR-210和let-7c在胰腺炎患者唾液中过表达；hsa-miR-21、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、miR-29c和hsa-miR-216在胰腺癌患者唾液中表达上调，其中hsa-miR-23a和hsa-miR-23b在早期胰腺癌患者唾液中过表达[41]；miR-3679-5p和miR-940可用于有效检测可切除胰腺癌[42]。唾液转录谱分析结果可用于区分胰腺癌患者和慢性胰腺炎患者及正常人，灵敏度达90%，特异度达95%[43]。

口腔微生物和牙周炎与胰腺癌发生密切相关。学者发现牙周炎与胰腺癌高危因素正相关，牙周炎患者患胰腺癌的概率比正常人高64%[44]。相对于健康人群，胰腺癌患者口腔中有31种细菌数量增加，25种细菌数量减少，其中长奈瑟菌和缓症链球菌在胰腺癌诊断中具有较高的灵敏性和特异性[45]。

3.5. 乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。ATP6AP1是一种ATP酶，在骨髓、血液、神经等正常组织内表达，也存在于头颈部肿瘤、肺癌、肾上腺肿瘤等中，但在乳腺癌中的分布最高。ATP6AP1自身抗体是在癌症患者中自发形成的一种特异性抗体，在癌症的早期可被检出，有助于乳腺癌的早期诊断[46]。Arif等[46]拟设计一种检测装置，通过检测唾液中的ATP6AP1自身抗体来筛查乳腺癌，以做出早期诊断和相应治疗。Zhang等[47]分析了唾液中潜在乳腺癌转录组和蛋白组生物标志物，在唾液中发现了8种mRNA和1种蛋白质生物标志物可用于检测乳腺癌，灵敏度为83%，特异度为97%。近期一项研究[48]发现乳腺癌患者唾液血管内皮生长因子、表皮生长因子、癌胚抗原水平显著上升。另有研究[49]发现乳腺癌患者唾液和血清中CA15-3抗原和c-erB-2肿瘤标志物水平上升，且两者在唾液和血清中的水平正相关。因此，唾液中潜在生物标志物在乳腺癌早期诊断方面具有潜在前景。

3.6. 肺癌

肺癌发病率高，严重危害人类健康。研究发现表皮生长因子受体突变是非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）的特异性标志物。电场诱导释放和检测技术可利用多通道电化学传感器直接检测体液中的EGFR突变，是一种检测NSCLC患者唾液中EGFR突变有效、准确、廉价、便捷的方法。此外，Xiao等[50]以二维凝胶电泳结合质谱在肺癌患者的唾液中检测到了16种差异性表达蛋白质，可有效区分肺癌患者和健康人群，为肺癌的早期诊断和治疗预后提供了潜在标志物。

3.7. 前列腺癌

miR-141和miR-21是两个肿瘤标志物，前者在前列腺癌进展期过表达，后者在癌症早期过表达。学者[51]利用纳米氧化石墨烯（nanographene oxide）技术同时检测唾液中miR-141和miR-21的表达，其有望成为一种早期诊断前列腺癌的非侵袭性手段。

3.8. 其他疾病

在胃溃疡和慢性胃炎患者唾液中，可通过细菌DNA检测发现幽门螺杆菌感染[52]–[53]。通过检测唾液中的咖啡因清除率，发现唾液作为诊断慢性肝病和评估患者剩余肝功能的有效手段[54]。慢性肾衰竭患者唾液中一氧化氮水平较健康人群升高，经透析治疗后，唾液中IgA、IgG和C反应蛋白水平上升，提示唾液中IgA、IgG、C反应蛋白和一氧化氮水平在肾病监测中可发挥重要作用[55]。学者[56]发现唾液中检测到的白血病融合转录本与患者骨髓中一致，提示唾液可以成为检测白血病融合转录本的可靠和便捷手段。唾液中海藻糖是一个潜在的阿尔兹海默病（Alzheimer's disease）生物标志物，是一种基于细胞的晶体管生物传感器，有望成为该病的潜在筛查手段。Wilson病是一种罕见的遗传性铜代谢障碍疾病，表现为肝脏、神经和精神症状。学者[57]对32个Wilson病患者唾液蛋白组进行了定性和定量分析，发现多免疫球蛋白受体、α-防御素2和4水平增高。唾液蛋白组反映了患者疾病病理的氧应激和炎症状态，可提供疾病恶化的重要线索。唾液皮质醇水平是心理压力的常规生物标志物，唾液中3个已被验证的标志物具有早期诊断特异性皮炎的潜能。

4. 亟待解决的问题

唾液样本易于采集、储存方便、DNA质量高，在流行病学研究中是血液的良好替代品，具有很高的研究价值。唾液组学研究对于寻找疾病分子标志物和药物靶标具有重要意义，对于疾病的早期诊疗具有难以估量的前景。目前唾液在疾病诊断中的研究与应用尚处于早期探索阶段，相关数据较零散，亟待克服诸多障碍，建立唾液分子检测平台，规范系列研究实施及评估标准，将我国巨大的患者资源转化为促进临床诊疗技术进步的战略资源，建立系统的唾液组学知识网络，寻找更加精准的疾病预警标志物，深入认识口腔及全身健康的关联，为实现口腔与全身疾病的精准医疗提供准确、无痛和便捷的平台，最终将基础研究成果转化为临床椅旁检测技术，为推动实现全民口腔健康做出更大的贡献。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81430011，1371135，81200782）；四川大学优秀青年学者基金（2082604184224）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81430011, 1371135, 81200782); Outstanding Young Scholars of Sichuan University (2082604184224).