口腔白斑和口腔鳞状细胞癌中微管相关蛋白1轻链3和雷帕霉素靶蛋白的表达及临床意义

Abstract

Objective

This study aimed to investigate the expression and relationship of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and mammalian target of rapamycin (mTOR) in normal oral mucosa, oral leukoplakia (OLK), and oral squamous cell carcinoma (OSCC). This work also analyzed the relationship between expression levels and clinical factors. This study evaluated the clinical value of LC3B and mTOR as indices to determine the carcinogenic potential of OLK.

Methods

Immunohistochemistry was used to detect the expression of LC3B and mTOR in 20 cases of normal oral mucosa, 120 cases of OLK, and 30 cases of OSCC. The clinical data of 120 patients with OLK were analyzed. The relationships between expression levels and clinical factors were investigated.

Results

In normal oral mucosa, OLK and OSCC, the positive rates of LC3B expression were 85.0%, 65.8% and 33.3% (P<0.05), whereas the positive rates of mTOR expression were 20.0%, 48.3% and 76.7% (P<0.05). The expression levels of LC3B and mTOR were correlated and related to clinical typing of OLK (P<0.05).

Conclusion

LC3B and mTOR can be used as molecular biomarkers for early detection of OLK.

口腔癌前病变是多因素导致的具有高癌变潜能的危险性疾病，口腔中以口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）为多见，早期诊断治疗OLK恶变，对预防口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）发生有积极作用。近年来，一种与凋亡相似的生物现象——自噬引起了人们的关注。自噬活性的异常改变与肿瘤的发生、发展密切相关[1]。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是自噬体膜在形成过程中必不可少的基因，其模型LC3B的含量与自噬发生程度呈正相关[2]，用于衡量自噬活性[3]。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）在自噬通路中作为逆向调控者，是负向调节细胞自噬的核心基因。本研究利用免疫组化方法从正启动及负反馈的双方向同时检测LC3B和mTOR在正常口腔黏膜、OLK及OSCC组织中的表达，并结合临床因素进行分析，探讨二者与OLK恶变的关系。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 标本来源

收集2016年12月—2017年11月湘雅口腔医院病理科蜡块，包含OLK组织120例和OSCC组织30例，回顾性分析其中OLK单纯增生及轻、中、重度上皮异常增生各30例的临床资料。另外收集手术切除的正常口腔黏膜20例，常规石蜡包埋。所有患者术前均未进行激素、化疗、放疗，且无自身系统性疾病。研究对象均签署知情同意书，本研究获得了中南大学湘雅口腔医院、湘雅二医院伦理委员会批准。

1.1.2. 试剂

兔抗人LC3B（ab48394）以及mTOR（ab32028）抗体均购自美国Abcam公司，稀释浓度分别为1︰300、1︰400。免疫组化Super Vision试剂盒（SV0002）购自武汉博士德生物技术有限公司，DAB显色剂购自北京嘉美生物科技有限公司。

1.2. 方法

1.2.1. 免疫组化法检测LC3B和mTOR的表达

将石蜡标本3 µm连续切片，烘干，脱蜡、至水，枸橼酸微波抗原修复，3%H₂O₂常温孵育30 min，避免内源性过氧化物酶活性干扰；PBS冲洗，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭，加一抗，4 °C过夜，复温后PBS冲洗，滴加聚合HRP标记抗兔IgG 37 °C孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片。用已知的阳性照片作为阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.2.2. 免疫组化结果判定

两人双盲阅片，随机选取5个视野观察（×400），根据染色强度计分及阳性细胞百分比计分对染色结果进行半定量分析，结果取平均值。LC3B和mTOR均以细胞膜和（或）细胞质染成棕黄色为阳性细胞。染色强度（A）分为：0（无染色），1（淡黄色），2（黄色），3（棕黄色）；阳性细胞的比例（B）评分：1（0~10%），2（10%~50%），3（50%~100%）。最后评分为：A×B。0~3分记为阴性，≥4分记为阳性。

1.3. 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，采用χ²检验分析LC3B及mTOR在不同组织类型及临床因素间的表达，通过Spearman进行相关性分析，P<0.05为有统计学差异。

2. 结果

2.1. LC3B和mTOR在不同组织中的蛋白表达

LC3B阳性表达主要定位于细胞质及细胞核；mTOR阳性表达均位于胞质中（图1）。在正常口腔黏膜、OLK及OSCC中，LC3B阳性表达率分别为85.0%（17/20）、65.8%（79/120）和33.3%（10/30），mTOR阳性表达率为20.0%（4/20）、48.3%（58/120）和76.7%（23/30），差异均有统计学意义（P<0.05，表1）。

图 1. LC3B和mTOR在正常口腔黏膜、OLK和OSCC中的表达 SV超敏两步法 × 400.

Fig 1 Expression of LC3B and mTOR in normal mucosa, OLK and OSCC SV hypersensitive two-step method × 400

上：LC3B；下：mTOR；左：正常口腔黏膜；中：OLK；右：OSCC。

表 1. LC3B和mTOR在不同口腔组织中的表达.

Tab 1 Expression of LC3B and mTOR in different oral tissues

	组织类型		n	LC3B+/%	χ2值	P值	mTOR+/%	χ2值	P值
正常口腔黏膜			20	17/85.0	15.752	0.000#,1	4/20.0	15.867	0.000#,1
OLK	单纯增生		30	25/83.3	5.446	0.020*	11/36.7	2.180	0.140**
	异常增生		90	54/60.0			47/52.2
		轻度异常	30	22/73.3	3.611	0.164Δ	12/40.0	3.295	0.192Δ
		中度异常	30	17/56.7			16/53.3
		重度异常	30	15/50.0			19/63.3
	合计		120	79/65.8		0.0872	58/48.3		0.0182
OSCC			30	10/33.3		0.0013	23/76.7		0.0053

注：^#正常口腔黏膜、OLK与OSCC三组比较，P<0.05；OLK单纯性增生和异常增生比较，*P<0.05，**P>0.05；^ΔOLK轻度、中度与重度异常增生比较，P>0.05；三组间两两比较，¹正常口腔黏膜与OSCC组比较；²正常口腔黏膜与OLK组比较；³OLK组与OSCC组比较。

2.2. LC3B和mTOR在组织中表达的相关性

Spearman相关分析显示，LC3B阳性表达率和mTOR阳性表达率呈负相关（r=−0.970，P<0.05，图2）。说明随组织恶性程度增加，两者变化趋势相反。

图 2. LC3B和mTOR表达类型及相关性.

Fig 2 Expression types and correlation of LC3B and mTOR

+为阳性表达；−为阴性表达。

2.3. OLK组中LC3B和mTOR表达与临床因素的相关性

LC3B、mTOR的表达与临床因素的关系见表2。LC3B和mTOR的表达在患者年龄、性别、病变部位及吸烟史的差异均无统计学意义（P>0.05），在临床类型的差异有统计学意义（P<0.05）（说明LC3B和mTOR的表达与OLK的临床分型相关。

表 2. LC3B、mTOR的表达与临床因素的关系.

Tab 2 Correlation of LC3B and mTOR expression with clinical factors

临床因素		n	LC3B		P值	mTOR		P值
			阳性	阴性		阳性	阴性
年龄/岁	＜50	38	26	12	0.684	17	21	0.591
	≥50	82	53	29		41	41
性别	男	100	69	31	0.102	51	49	0.191
	女	20	10	10		7	13
病变部位	舌或口底	92	60	32	0.796	44	48	0.840
	其他	28	19	9		14	14
吸烟史	有	97	64	33	0.945	46	51	0.682
	无	23	15	8		12	11
临床类型	均质型	97	69	28	0.012	42	55	0.023
	非均质型	23	10	13		16	7

3. 讨论

OSCC在全球最常见癌症中排名第六[4]，是口腔颌面部最频发的恶性肿瘤，预后差。OLK是世界卫生组织公认的口腔癌前病变之一，其癌变率为0.9%~19.8%[5]。组织学上常伴有上皮异常增生，有研究[6]表明，OLK的异常增生程度直接决定了其癌变潜能，危害性大。因此，研究癌前病变成为预防癌症发生发展的关注焦点。目前已有研究[7]证明自噬可通过促进细胞死亡而导致癌变，近年来由于其在细胞稳态中的显著作用，尤其是在癌症的发病机制及治疗中的作用而备受关注。

然而，自噬在恶性肿瘤发生、发展中的角色及其作用相当复杂，目前的研究[8]–[9]报道仍存在争议，一方面倾向于自噬扮演原癌基因角色，使迅速生长的恶性肿瘤在缺血、缺氧的环境中得以存活，从而保护肿瘤细胞。另一方面认为自噬抑制肿瘤发生，即发挥抑癌基因作用，该部分研究结果发现，自噬可清除肿瘤细胞内折叠异常的蛋白和功能异常的细胞器，抑制细胞应激反应，保持基因组稳定性，以诱导细胞衰老的方式抑制癌症发生[10]–[11]。也有报道认为自噬作用具有波动性，即在恶性肿瘤发生前期，自噬受抑导致致癌物质产生增多，染色体的不稳定性增加，作为原癌基因存在，促进细胞恶性转化[12]，随着恶性程度增加，肿瘤细胞自噬过表达发生Ⅱ型程序性死亡，癌细胞被消灭，发挥抑癌作用。与之相反的观点则认为早期细胞自噬功能缺失或下调，可以抑制肿瘤发生和生长，即发挥抑癌作用；晚期对于肿瘤细胞起原癌基因作用，保护其在缺血缺氧等恶劣条件下生存[13]。无论哪种论点，均不能诠释自噬在肿瘤恶变进程中的角色与作用，诚然，自噬对恶性肿瘤的影响似双刃剑，横向观察存在正向和负向调节，纵向亦有正、负调节间的变换，这种复杂如网状的体系，值得研究者更深一步去探究。

LC3B为LC3表达产物LC3A与磷脂酰乙醇胺结合形成的膜型，其含量与自噬发生程度正相关，被认为是判定自噬活性的特异性灵敏标志分子[14]。本研究中，在黏膜组织由正常—OLK—OSCC的恶变进程中，LC3B阳性率逐渐下降，这与其他研究[15]–[16]结果一致，认为自噬与OLK组织恶变有关。在口腔癌前病变中，自噬可能阻碍其向恶性发展，发挥抑癌作用，随着病变程度增大，自噬缺陷明显，细胞内环境稳定性降低，癌变率增加，从而促进恶变。然而，其他研究[17]–[18]结果与本研究相反，他们发现癌组织中LC3B表达增加，自噬水平高于正常组织。

PI3K/AKT/mTOR通路是研究最多的一种癌前及致癌途径，该通路的过度激活与许多关键的癌症行为有关[19]。其中的关键基因mTOR能感受诸多信号的作用，为自噬功能的中心调控者，逆向调控自噬诱导及自噬体形成。本研究发现在OLK恶变进程中，mTOR阳性率上升，说明由mTOR介导的PI3K/AKT/mTOR通路的激活普遍存在，从而抑制细胞凋亡，加快细胞周期，自噬活性减弱，与在头颈部鳞癌中的研究[20]–[21]结果一致。尽管现有的大多数研究倾向mTOR在癌变过程中表达增加，而时艳辉[22]发现其乳腺癌进展过程中表达降低。

以往报道中，单独检测LC3B这一指标发现其表达升高，然而并不能明确是自噬水平的提高，或是自噬之后的步骤被抑制，导致自噬泡含量升高，因此单独检测LC3B说服性不足。本研究联合检测发现LC3B表达缺失mTOR过表达，共同提示随组织恶性度增加自噬水平降低。近年来联合检测上述蛋白也被应用于其他医学领域，张晶等[23]在宫颈病变中的研究结果与本实验一致，发现癌变进程中LC3B低表达，mTOR高表达，证实自噬水平降低。而吴淑华等[24]研究大肠癌的结果显示LC3B表达升高，mTOR表达降低。更有与本实验结果完全相反的情况，时艳辉[22]在对乳腺癌的研究中，发现LC3B与mTOR均呈现低表达。对于这些不同结果，可能的原因，一方面，自噬对于不同类型的肿瘤所起作用可能不同，另一方面，即使同类型，发展到不同阶段，处于不同部位，作用也可能不尽相同。而现有报道的一致性在于均发现癌变进程中LC3B与mTOR的表达呈负相关。那么，是否可以推测，即使在肿瘤发生发展过程中，自噬的角色以及蛋白表达呈现多样性，但其中仍遵循某种规律或是制约关系，推进恶变进程。

比较LC3B与mTOR在正常口腔黏膜、OLK、OSCC组中的表达发现，二者的表达均具显著性差异（P<0.05），各组间比较，LC3B、mTOR在正常口腔黏膜组与OLK组间相差不大，其余各组间比较均具有统计学意义（P<0.05）。推测自噬活性降低这一事件普遍发生在OLK向鳞癌转化的过程中，在正常口腔黏膜及OLK组织中自噬水平改变不明显。进一步分析，在OLK组中，单纯性增生与异常增生组间仅LC3B表达存在差异，结果有统计学意义（P<0.05），而在OLK异常增生组，轻、中、重度比较差异均无统计学意义（P>0.05），但3组的阳性率存在趋势性改变，因而不能完全否认其表达差异性，可能受本实验样本量小或诊断准确性等因素的限制，未表现出明显性差异。因而考虑OLK在单纯增生向异常增生转化过程中已发生自噬活性的改变，自噬水平降低在OLK中属于早发事件，提醒临床医生应重点加强对早期OLK的监测。

随口腔黏膜恶性度增加，LC3B缺失率与mTOR阳性率呈显著性正相关（r=0.975，P<0.05），失活表达（LC3B−、mTOR+）频率增加。共同失活率在正常组织（0%）、OLK（23%）、OSCC（43%）中呈递增趋势，却始终低于单独失活率，说明二者均与口腔癌变进程相关，可能有协同作用，是否有叠加作用，本研究结果还不足以证明。上述发现在国内外对于口腔OLK恶变研究中未曾有报道。

在OLK组中，分析各临床因素对LC3B和mTOR表达的影响，可见在年龄、性别、发病部位及吸烟史方面均无统计学意义（P>0.05），而在临床类型上差异性显著（P<0.05），可见非均质型OLK更易出现LC3B表达的缺失及mTOR的过表达，自噬水平降低的发生率更高，恶性程度也随之增大，这与以往的研究结果一致。由于上皮异常增生常见于非均质型OLK中，两者皆与OLK恶变有关，临床医生遇到此类患者应给予高度重视。值得注意的是，对于无统计学意义的临床因素，在曾经的报道中也被认为与OLK发病有关，可能受样本量的限制，本研究中未显现出阳性结果，但并不能完全认为与OLK恶变毫无联系，在临床上也应适当进行考虑。

综上，LC3B、mTOR与OLK恶变密切相关，LC3B表达下调，mTOR表达上调，共同提示自噬水平降低，组织恶性程度增加，二者表达有相关性，考虑为协同作用。临床上，LC3B与mTOR可作为早期监测口腔OLK恶变程度的诊断指标，对于病理表现异常增生或是临床上非均质型OLK应警惕，联合检测2种蛋白，若见LC3B表达下调，mTOR表达上调这一危险信号，预示其恶变倾向增加；而对于病理为单纯增生或者临床上均质型OLK，联合检测若见上述危险信号，更应引起重视，考虑其可能已开始向恶变方向进展。本研究尚存在局限性，一方面由于是回顾性研究，各临床参数分布不均，会发生各种偏倚；另一方面，纳入研究的样本量相对较小，也可能导致结果与实际存在偏差，但已满足研究与检验的基本要求。本研究的优点在于从正、负调节双向证明自噬活性改变，更具有说服力。对于未来，期待设计严谨、样本量充足的前瞻性研究，深入阐明自噬与OLK恶变间的关系，为临床工作提供参考。