白芍总苷抑制小鼠T淋巴细胞体外增殖促进活化诱导细胞死亡

Abstract

目的

研究白芍总苷（TGP）对小鼠T淋巴细胞体外增殖及活化诱导细胞死亡（AICD）的影响，并初探其免疫抑制机制。

方法

利用免疫磁珠分选技术，无菌分离小鼠脾脏T淋巴细胞，按照TGP溶液浓度（0、50、100、200 μg/mL）设为空白组、TGP低中高剂量组，anti-CD3/CD28刺激T淋巴细胞活化及增殖。流式细胞仪检测细胞早期活化标志、细胞活力及CFSE标记的T淋巴细胞增殖；RT-PCR检测Fas/FasL mRNA水平；流式细胞仪检测活化T淋巴细胞表面Fas/FasL蛋白表达量；Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。

结果

（1）与空白组相比，TGP中高剂量组在用药48 h后活细胞数目显著减少，活细胞比例明显下降（P < 0.001）；（2）TGP组给药处理48 h后，T淋巴细胞分裂代数及已分裂比例显著降低，且抑制作用具有药物浓度依赖性（P < 0.001）；（3）TGP处理组T淋巴细胞24 h后Fas mRNA表达量显著上调，并伴随着T淋巴细胞表面Fas蛋白的表达上调及胞内Bcl-2表达下调（P < 0.01）。

结论

TGP显著抑制T淋巴细胞增殖，并可通过上调Fas、下调Bcl-2的表达促进活化诱导的T淋巴细胞死亡（AICD）。

白芍总苷（TGP）是由芍药植物根中提取的一组糖苷类物质，包括芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等，是中药白芍的主要有效成分^[1]。既往研究证实TGP可通过增加Foxp3脱甲基作用增加SLE患者CD4⁺CD25+Foxp3+Treg的比例与数目，辅助治疗系统性红斑狼疮（SLE）^[2-3]；TGP可通过抑制DCs细胞的活化和成熟，影响CIA小鼠Th1和Th17的分化，缓解关节炎症损伤^[4]；TGP可通过降低Th17/Treg比例及IL-17、IL-6、TNF-α的分泌减轻TNBS诱导的大鼠结肠炎模型^[5]；另外文献报道TGP可体外抑制ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖及IL-4、IFN-γ的分泌^[6]。因此说明TGP具有重要的免疫调节作用及治疗自身免疫病的应用前景。

自身免疫病的发生与T淋巴细胞功能异常关系密切，尤其是自身反应性T淋巴细胞，而活化诱导的细胞死亡途径（AICD）在维持免疫耐受及清除自身反应T淋巴细胞的过程中起到至关重要的作用^[7-9]。目前关于TGP对T淋巴细胞AICD作用及细胞增殖的影响尚无报道，其相关的机制研究也不明确。本研究通过分析TGP对T淋巴细胞体外增殖及AICD的影响，进一步阐明其免疫调节机制，为临床用药提供科学依据。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验动物

SPF级C57BL/6雌性小鼠，8~12周龄，购于南方医科大学实验动物中心（2011-0074）。于实验动物中心SPF级动物房检疫1周后封闭饲养。所有小鼠均单笼饲养，饲以普通饲料，自由摄食摄水，所用饲料、垫料、饮用水均经高压灭菌处理。实验环境温度24~26 ℃，湿度60%~80%，每12 h交替照明，均自动调节控制。本研究通过南方医科大学实验动物伦理委员会批准，伦理审查号：2016113。

1.1.2. 药品与试剂

白芍总苷（TGP，商品名称：帕夫林，宁波立华制药有限公司，国药准字H20055058），规格为每片0.4 g（含芍药苷104 mg），以PBS配成所需浓度，4 ℃保存备用。Dynabeads™ Mouse T-Activator CD3/ CD28（ThermoFisher）；抗鼠FITC-CD3、FITC-CD69、APC-Cy7-CD4、PE-Cy7-CD8和anti-CD8 biotin单克隆抗体（BD）；PE-FasL、FITC-Fas（Invitrogen）；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ（BD）；Pan T Cell Isolation Kit Ⅱ及LS column（Miltenyi）；cellTrace^TM cfse cell proliferation kit（Invitrogen）；CountBright Absolute Counting beads（ThermoFisher）；RNA Isolation Kit（QIAGEN）；cDNA Synthesis Kits及SYBR^® Green Supermixes（Bio-rad）；Western抗体：anti-Bcl-2 polyclonal antibody（Bioss）；胎牛血清（Gibco）。

1.2. 方法

1.2.1. 小鼠T淋巴细胞制备、分组

小鼠麻醉处死后，无菌条件下取出脾脏，置于70 µm/孔的尼龙滤网上研磨并冲洗，离心（300 g×10 min，下同）。去除上清，用ACK裂解红细胞，PBS+2%FBS洗涤两次，过滤，台盼蓝计数活细胞数，细胞重悬至每10⁷/40 µL，孵育Pan T cocktail 10 min（如需获得CD4阳性T细胞，加入anti-CD8 biotin）后洗涤，继续孵育anti-biotin beads 15 min，离心重悬后，通过LS colum分选T淋巴细胞，采用FITCCD3e进行染色鉴定分选出的T淋巴细胞纯度。按照TGP溶液浓度（0、50、100、200 µg/mL）分为空白组、TGP低中高剂量组。

1.2.2. 细胞培养

用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的RPMI 1640培养基重悬T淋巴细胞至1.25×10⁶/mL，将600 µL T淋巴细胞悬液接种至24孔板中，7.5×10⁵/孔，分别加入100 µL不同浓度的TGP溶液，予500 µL anti-CD3/28 beads溶液刺激T淋巴细胞活化增殖，每孔终体积为1200 µL。在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱孵育24、48 h，分别于不同的时间点收集细胞进行检测。

1.2.3. anti-CD3/CD28 beads刺激T细胞活化增殖

Dynabeads^® Mouse T-Activator CD3/CD28按25 µL/ 106 T cells计算：即anti-CD3/CD28 beads试剂375 µL溶于10 mL RPMI 1640完全培养基中，使用前反复吹打混匀，24孔板中每孔加入500 µL混悬液。

1.2.4. T淋巴细胞早期活化标志CD69检测

T淋巴细胞与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养24 h后，收集各孔细胞至流式管中，经1500 r/min离心5 min后倒掉上清，每根管加入100 µL PBS、0.25 µL FITC-CD69、0.1 µL PE-cy7-CD8、0.3 µL APC-cy7-CD4，室温避光孵育10 min，加入2 mL PBS洗涤后重悬至250 µL上机检测。

1.2.5. T淋巴细胞克隆扩增检测

T淋巴细胞与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养48 h后，收集各孔细胞至流式管中，经1500 r/min离心5 min后倒掉上清，每根管加入100 µL PBS、0.1 µL PE- cy7-CD8、0.3 µL APCcy7-CD4，室温避光孵育10 min，加入2 mL PBS洗涤，接着用1×AnnexinV专用buffer 100 µL、1 µL AnnexinV、1 µL 7AAD室温避光孵育10 min，不需要离心，直接再补充150 µL PBS及50 µL CountBright Absolute Counting beads后立即上机检测，计数活细胞数目。按总细胞/总beads=细胞浓度×体积/beads浓度×体积计算。

1.2.6. T淋巴细胞活性检测

T淋巴细胞与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养24或48 h后，收集各孔细胞至流式管中，经1500 r/min离心5 min后倒掉上清，首先进行表面CD4、CD8染色（同上），接着用1×AnnexinV专用buffer 100 µL、1 µLAnnexinV、1 µL 7AAD室温避光孵育10 min，不需要离心，直接再补充150 µL PBS后立即上机检测。

1.2.7. T淋巴细胞分裂增殖检测

将2× 10⁷的T细胞重悬于1 mL PBS+5%FBS的溶液中，加入1 µL CFSE储存液（5 mmoL），迅速转移至37 ℃恒温水浴锅中，避光孵育5 min，每隔1 min摇晃几次。用FBS+2% FBS溶剂洗涤两次后计数。将标记CFSE的T淋巴细胞与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养48 h后，收集各孔细胞至流式管中，经1500 r/min离心5 min后倒掉上清，进行表面CD4、CD8及细胞活性染色，运用流式分析活细胞分裂代数及比例。

1.2.8. RT-PCR检测

通过免疫磁珠阴性分选获得CD4⁺ T细胞，将7.5×10⁵ CD4⁺ T淋巴细胞接种于24孔板，分别加空白或TGP处理，24 h后收集细胞，使用RNA Isolation Kit提取总RNA，检测纯度后按照cDNA Synthesis Kits进行逆转录，以GAPDH为内参，检测Fas和FasL mRNA相对表达量。引物序列：（GAPDH）Forward 5'-TCGGTGTGAACGGATTTGGC-3'，Reverse 5'-CCT TGACTGTGCCGTTGAATTTG-3'；（FasL）forward5'-GCAGAAGGAACTGGCAGAAC-3′，Reverse5'-TTAAATGGGCCACACTCCTC-3'；（Fas）forward 5'-ATGCACACTCTGCGATGAAG-3'，Reverse 5'-CAGTGTTCACAGCCAGGAGA-3'。

1.2.9. 流式细胞仪检测Fas\FasL蛋白表达

T淋巴细胞与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养24 h后，收集各孔细胞至流式管中，经1500 r/min离心5 min后倒掉上清，每根管加入100 µL PBS、0.1 µL PE-cy7-CD8、0.3 µLAPC-cy7-CD4、0.5 µL FITC-Fas、2.5 µL PE-FasL进行染色，温避光放置10 min，加入2 mL PBS洗涤后重悬至250 µL上机检测。

1.2.10. Western blot法分析Bcl-2表达

使用免疫磁珠分选CD4⁺T淋巴细胞，与TGP溶液、anti-CD3/CD28 beads共培养24 h后，收集各组细胞，提取各组细胞总蛋白并定量，98 ℃下变性5 min，12%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离含等量蛋白质样品，湿法转印至PVDF膜；用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液室温封闭1 h；然后将膜片与抗鼠β-actin抗体（1:1000，Bioss）、抗鼠Bcl-2抗体（1: 1000，Bioss）在4 ℃孵育过夜；室温下TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗工作液，室温下摇床孵育1 h，使用TBST洗涤3次，5 min/次；ECL发光试剂盒显影，采用Image J软件分析分析条带。

1.2.11. 数据分析及统计学处理

全部流式细胞学数据均由采用FlowJo（V10.5.3，美国BD公司）进行分析，GraphPad prism7.0（GraphPad Software，美国）进行作图及统计处理，计量资料以均数±标准差表示，组间采用非配对t检验进行比较，P <0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. TGP对小鼠T淋巴细胞早期活化的影响

T淋巴细胞占C57BL/6小鼠脾脏细胞比例约30%左右，经免疫磁珠分选后纯度达95%以上（图 1A）。流式细胞术检测TGP处理24 h后T淋巴细胞早期活化标志CD69表达发现，各组间CD69阳性CD4或CD8 T淋巴细胞比例均大于95%，且空白组与TGP处理组间CD69比例无明显差异（图 1B，C）。

1.

纯化小鼠脾脏T淋巴细胞并刺激细胞活化

Purification and activation of mouse T cells. A: Mouse T cells were purified from the spleen cells by MACS negative selection; B, C: Percentage of CD69-positive cells after stimulation of the cells with anti-CD3/CD28 for 24 h.

2.2. TGP对小鼠T淋巴细胞克隆扩增的影响

TGP处理48 h后，通过流式技术计数各组间存活（即AnnexinV阴性7AAD阴性）CD4或CD8 T淋巴细胞数目发现，随着TGP浓度的增加，存活的CD4或CD8 T淋巴细胞数目较空白组（0 μg/mL）显著降低，且药物浓度越高，降幅越明显，差异具有统计学意义（图 2，P <0.05）。

2.

白芍总苷对小鼠T细胞克隆扩增的影响

Effects of TGP on clonal expansion of mouse T cells. A, B: Mouse T cells were stimulated with anti-CD3/CD28 and treated with TGP. After incubation for 48 h, AnnexinV-7AAD- (live) CD4- and CD8-positive T cells were counted (^***P < 0.001, ^****P < 0.0001 vs 0 μg/mL).

2.3. TGP对活化小鼠T淋巴细胞死亡的影响

TGP处理48 h后，通过AnnexinV/7AAD染色检测T淋巴细胞存活情况发现，100 μg/mL和200 μg/mL TGP组CD4或CD8 T淋巴细胞活细胞比例明显降低，与空白组（0 μg/mL）比较具有统计学差异（图 3，P <0.05），而50 μg/mL TGP组对活化诱导的CD4 T淋巴细胞死亡无显著影响（图 3，P>0.05），甚至对活化诱导的CD8 T淋巴细胞死亡有一定抑制作用（图 3，P <0.05）。

3.

白芍总苷对活化诱导T淋巴细胞死亡的影响

Effect of TGP on activation-induced T cell death at 48 h. A: Mouse T cells were stimulated with anti-CD3/ CD28 and treated with TGP for 48 h, followed by staining with Annexin V and 7-AAD; B: Percentages of Annexin V 7AAD- (live) CD4- and CD8-positive T cells (^*P < 0.05, ^****P < 0.0001 vs 0 μg/mL).

2.4. TGP对小鼠T淋巴细胞增殖的影响

利用活细胞染料CFSE标记T淋巴细胞，予antiCD3/CD28刺激其增殖，48 h后运用流式技术检测活细胞增殖情况发现，与空白组（0 μg/mL）相比，TGP各处理组CD4或CD8 T淋巴细胞分裂代数和已分裂细胞比例显著降低，且药物浓度越高，细胞分裂代数越少、已分裂细胞比例越低，差异具有统计学意义（图 4，P <0.05）。

4.

白芍总苷对小鼠T细胞增殖的影响

Effect of TGP treatment for 24 h on T cell proliferation. A: CFSE dilution in activated CD4- and CD8-positive T cells; B: Percentage of divided T cells at 48 h. ^*P < 0.05, ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001 vs 0 μg/mL.

2.5. TGP促进活化T淋巴细胞表达Fas

RT-PCR结果提示，100 μg/mL TGP处理CD4⁺ T淋巴细胞后，Fas和FasL mRNA水平较空白组（0 μg/mL）升高，其中Fas升高更明显（图 5A，P <0.05）。进一步检测T淋巴细胞表面Fas/FasL蛋白表达量，发现经TGP处理后，CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞表面Fas表达量明显升高，与空白组均有显著性差异（图 5B~D，P <0.05），而FasL表达量变化不明显，甚至高浓度时FasL表达量轻微降低（图 5D，P <0.05）。

5.

TGP通过促进Fas表达加速T细胞AICD

TGP accelerates activation-induced cell death (AICD) by increasing the expression of Fas. A: Fas and FasL mRNA expressions detected by RT-PCR in control and 100 μg/mL TGP-treated cells; B, C: Detection of Fas or FasL expression by flow cytometry; D: Percentage of CD4 or CD8 positivity in Fas- and FasL-positive T cells. ^***P < 0.001, ^****P < 0.0001 vs 0 μg/mL.

2.6. TGP下调Bcl-2在活化T淋巴细胞中的表达

Bcl-2是Fas的下游信号通路中的重要调控分子之一（图 6C），且Bcl-2与细胞凋亡密切相关。Western blot结果显示：与空白对照组相比，中剂量和高剂量TGP处理组Bcl-2的表达量显著下调，且TGP药物浓度越高，Bcl-2表达量越低，差异具有统计学意义（图 6A，B，P <0.05）。

6.

TGP对活化T淋巴细胞Bcl-2表达的影响

Effects of TGP on expression of Bcl-2 in activated mouse T cells. A, B: Bcl-2 protein expression was detected by Western blotting; C: Schematic illustration of the action of TGP on Fas and Bcl-2 pathway. ^*P < 0.05 vs 0 μg/mL group.

3. 讨论

在本研究中，我们发现TGP低、中、高剂量组均能显著抑制anti-CD3/CD28诱导的T淋巴细胞体外克隆扩增，表现为共培养48 h后，存活T淋巴细胞绝对计数显著降低，且抑制作用与TGP浓度呈正相关，而T淋巴细胞克隆扩增是细胞增殖和细胞死亡的综合结果^[10]。首先，我们利用AnnexinV/7AAD染色观察TGP处理后细胞存活情况，研究结果显示，与空白组相比，中、高剂量TGP均可显著促进T淋巴细胞AICD作用。

AICD即活化诱导的细胞死亡，是T淋巴细胞程序性死亡的主要类型之一，是指当活化T淋巴细胞再次接受相同抗原刺激时，会自发程序性凋亡，对于维持自身耐受，清除自身反应性T淋巴细胞具有重要意义，该过程主要由Fas-FasL信号通路介导^[11-13]。Fas分子也被称为“死亡分子”，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族成员，而Fas几乎不表达于初始T淋巴细胞，但在T淋巴细胞活化后表达量升高^[14-15]。当Fas与FasL结合后，将启动一系列凋亡信号的跨膜传递，首先Fas分子的胞内段修饰后与胞内的连接蛋白分子FADD结合，通过形成由Fas /FADD/ procaspase-8死亡诱导信号复合物活化直接活化caspase酶家族或通过Bcl-2等介导的线粒体凋亡途径，诱发细胞凋亡^[16-17]。动物实验证实Fas基因突变将导致T淋巴细胞或B淋巴细胞无法启动由Fas/FasL介导的死亡信号传导，不能形成负反馈调节，进而导致自身反应性T淋巴细胞增多形成病理性T淋巴细胞，引起淋巴结和脾脏肿大，可呈现SLE样的全身反应^[18-19]。Bcl-2是Fas的下游信号调控的关节环节之一，与细胞抗凋亡关系密切，而既往实验研究也证实敲低Bcl-2表达可显著促进jurkat T细胞AICD，而过表达Bcl-2的可抑制T淋巴细胞死亡^[20-22]。本研究中，TGP中浓度处理CD4⁺T细胞24 h后，检测到Fas、FasL mRNA水平较空白组均有升高，其中Fas mRNA升高更明显。我们也通过流式技术证实，中、高浓度TGP处理后，活化T淋巴细胞表面Fas表达量显著升高，而FasL表达量变化不明显，进一步研究发现Fas的下游调控分子Bcl-2在TGP处理后表达量明显下调。根据以上结果，我们推测TGP可能是通过上调活化T淋巴细胞表面Fas的表达、下调Bcl-2蛋白的表达发挥促进AICD的作用，从而加速活化T淋巴细胞死亡。

T淋巴细胞增殖也是T淋巴细胞克隆扩增的关节环节之一。本研究发现，TGP具有明显的抑制T淋巴细胞增殖的作用。利用活细胞染料羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记T淋巴细胞，根据其每分裂一代荧光强度减半的特性，结合流式细胞术，分析T淋巴细胞的增殖能力^[23-24]。结果提示，TGP药物干预48 h后，CD4⁺或CD8⁺ T淋巴细胞分裂代数和已分裂细胞比例明显降低，即使是低浓度TGP也表现出明显的抑制增殖作用，而在高浓度时，T淋巴细胞增殖几乎完全受到抑制。正常情况下，机体T淋巴细胞增殖保持稳态平衡，而病理性增殖可导致疾病的发生发展^[25-26]。除恶性血液疾病T淋巴细胞增殖失去控制外，常见自身免疫性疾病患者体内均存在自身反应性T淋巴细胞增殖异常，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、移植物抗宿主病等^[27-30]。因此，本实验不仅揭示了TGP能够通过抑制T淋巴细胞增殖发挥免疫调节作用，还证实了TGP具有治疗T淋巴细胞异常增殖疾病的潜能。

综上，本研究证实白芍总苷（TGP）能够通过促进Fas、抑制Bcl-2表达促进活化T淋巴细胞AICD作用，并且可以显著抑制T淋巴细胞增殖，为TGP更好的应用于临床提供了实验依据。

Biography

熊传锋，在读硕士研究生，E-mail: xcffimmu@163.com

Funding Statement

国家自然科学基金（81774038）；广东省自然科学基金（2015A030313300）；广东省科技计划项目（2014A020221073）；广东省中医药局项目（20181168）；广州市科技计划项目（201607010224）

Supported by National Natural Science Foundation of China (81774038)