Abstract
目的
研究腮腺再生过程中的肌上皮细胞（MEC）数量及分布的变化。
方法
54只Wistar大鼠分为8个实验组和1个正常对照组，每组6只。实验组结扎大鼠右侧腮腺主导管，结扎后第14天使其再通，分别于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21天获取腮腺组织标本，应用苏木精-伊红染色观察再生腺体的组织学变化，并采用免疫组织化学染色法定量分析MEC在腮腺再生不同时间点的数量及分布情况，并与正常对照组作比较。
结果
腮腺组织于主导管结扎后第14天明显萎缩，多数腺泡细胞消失，导管样结构明显增多；而MEC数量明显增加，主要分布在导管样结构周围。导管再通后，从第3天开始，腺泡细胞明显增加，导管样结构明显减少，同时MEC数量减少，主要分布在新生腺泡及导管样结构周围，导管再通第3、5天时MEC数量下降最为明显；再通14 d后，腺体结构和MEC的数量及分布基本恢复正常，与正常对照组无明显差异。
结论
MEC的数量和分布在腮腺萎缩后再生的第14天可基本恢复正常，腮腺的再生主要发生在主导管再通后的5 d内。
Keywords: 肌上皮细胞, 腮腺, 萎缩, 再生
Abstract
Objective
To investigate the changes on the number and distribution of myoepithelial cells (MECs) during parotid gland regeneration.
Methods
A total of 54 Wistar rats were divided into eight experimental groups and one normal control group, with six rats in each group. The right parotid ducts of the rats in the experimental groups were ligated for 14 days and then reopened. The parotid tissue specimens were harvested at days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, and 21. The histological changes of the regenerating gland were examined using hematoxylin–eosin staining. Immunohistochemical labeling was also performed to investigate the changes in the number and distribution of MECs at different time points of parotid regeneration. Both the histological and immunohistochemical changes observed in the experimental groups were compared with those in the normal control group.
Results
The parotid gland showed marked atrophy 14 days after ligation. Most acinar cells disappeared, but the number of duct-like structures obviously increased. MECs apparently increased in number and were mainly located at the periphery of the duct-like structures. Three days after duct reopening, the number of acinar cells significantly increased and the duct-like structures significantly reduced. Meanwhile, MECs also decreased in number and were mainly located at the periphery of the newly formed acini and duct-like structures. The number of MECs noticeably decreased 3 and 5 days after duct reopening. At 14 days after duct reopening, the glandular structures and the number and distribution of MECs returned to normal compared with those in the normal control group.
Conclusion
The number and distribution of MECs returned to normal condition after parotid gland atrophy. Parotid regeneration mainly occurred within 5 days after duct reopening.
Keywords: myoepithelial cell, parotid gland, atrophy, regeneration
放射治疗、舍格伦综合征以及涎腺炎导致的涎腺萎缩是临床上常见且亟待解决的难题。研究涎腺对萎缩和再生的反应有可能为涎腺的放射防护设计或为涎腺萎缩的治疗找到有效的途径[1]。有学者[2]认为，肌上皮细胞（myoepithelial cell，MEC）可能是导致唾液腺多种疾病的潜能祖细胞之一；在继发性舍格伦综合征患者唾液腺炎症病变过程中，MEC亦可作为靶细胞被淋巴细胞浸润破坏，并最终导致腺泡和导管上皮丧失[3]。目前关于MEC在腮腺萎缩后再生过程中变化方面的研究较少，本实验通过结扎大鼠腮腺主导管14 d后使其再通，建立腮腺萎缩后再生的动物模型，观察MEC在该过程中的数量及分布的变化情况。
1. 材料和方法
1.1. 实验对象
选用无特定病原体动物（specified pathogen free，SPF）级成年雄性Wistar大鼠54只为研究对象，质量（260±15） g，购于山东大学实验动物中心（批号：鲁动质字D20021024）。将大鼠随机分为8个实验组和1个正常对照组，每组6只，常规饲养。
1.2. 实验方法
将实验组的大鼠使用质量分数为3%水合氯醛（10 mL·kg−1）行腹腔内注射麻醉，于右耳前下方切开皮肤，显露右侧腮腺主导管，用3—0丝线将直径0.8 mm医用钢丝与主导管捆绑双重结扎。主导管结扎后第14天，再次麻醉大鼠，取出医用钢丝使主导管再通，分别于再通后第0、1、3、5、7、10、14、21天各处死1组大鼠，切取右侧腮腺，放入质量分数4%的多聚甲醛固定液中固定。正常对照组仅手术显露主导管但不结扎。
1.3. 观察方法
1.3.1. 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察
将各组腮腺组织样本固定24 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后浸蜡、包埋，制成4 µm厚切片，进行HE染色，置于光学显微镜下观察腮腺的组织学变化。
1.3.2. 免疫组织化学染色观察
采用特异性肌动蛋白α-SMA单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），应用SABC法对腮腺标本进行免疫组织化学染色，抗体稀释度为1∶200，DAB显色，苏木精轻度复染，观察MEC的阳性表达情况。
1.3.3. MEC计数
将免疫组织化学切片置于OLYMPUS BX51型显微镜下（Olympus公司，日本）观察，每张切片随机选择5个视野拍照，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计数MEC的数目。
1.4. 统计学处理
实验所得数据采用SPSS 16.0软件包进行方差分析，检验水准为双侧α=0.05。
2. 结果
2.1. HE观察结果
实验动物的HE观察结果见图1。正常对照组：腮腺腺小叶中有密集的腺泡细胞及散在的导管系统（闰管、纹管及排泄管），腺泡细胞大小均匀，排列紧凑（图1A）。实验组：导管结扎14 d组（即再通0 d组），腮腺实质内绝大多数腺泡萎缩消失，仅在腺小叶边缘可见少数散在且体积明显减小的腺泡细胞，导管样结构明显增多，占据腺小叶的大部，并伴有大量炎症细胞浸润（图1B）；再通1 d组与再通0 d组相比，腺小叶结构未见明显变化；再通3 d组可见体积较小的新生腺泡出现在腺小叶边缘（图1C）；再通5 d组可见除腺小叶边缘外，腺小叶中央新生腺泡数量也明显增多，导管样结构明显减少；再通7 d组，成熟的腺泡细胞已占据大部分腺小叶，腺泡形态基本恢复正常，但腺泡排列仍较正常对照组稀疏（图1D）；再通10 d组，成熟腺泡进一步增多，导管系统进一步减少；再通14 d组及再通21 d组，腺小叶的结构与正常对照组相近，没有发现明显差异。
图 1. 正常对照组及实验组腮腺的组织学变化 HE × 400.
Fig 1 Histological changes of parotid glands for control and experimental group HE × 400
A：正常对照组；B：再通0 d组；C：再通3 d组；D：再通7 d组。
2.2. 免疫组织化学观察结果
正常对照组：呈阳性表达的MEC主要分布在闰管及腺泡周围，形态呈星形或梭形，纹管周围亦可见少量MEC（图2A）；再通0 d组与正常对照组比较，MEC数目明显增多，主要分布在大量导管样结构周围，此时导管样结构呈典型的双套层结构，大量MEC位于外层，形态呈梭形或星形（图2B）； 再通1 d组与再通0 d组对比，MEC数目及分布未见明显改变；再通3 d组，随着新生腺泡的出现，MEC数目明显减少，大多分布在导管样结构及新生腺泡周围（图2C）；再通5 d组，新生腺泡逐渐增多，导管样结构明显减少，MEC数目进一步明显减少；再通7 d组，新生腺泡已占据大部分腺小叶，导管样结构明显减少，MEC数目减少变缓，主要分布在体积较小的新生腺泡及导管系统表面（图2D）；再通10 d组，MEC数量进一步减少；再通14 d组及21 d组，腺小叶结构基本恢复正常，MEC数目及分布也基本恢复正常，与正常对照组未见明显差别。
图 2. 正常对照组及实验组腮腺MEC的阳性表达 SABC × 400.
Fig 2 MEC positive expression in parotid glands for control and experimental group SABC × 400
A：正常对照组；B：再通0 d组；C：再通3 d组；D：再通7 d组。
2.3. MEC计数结果
各组动物的MEC计数结果见表1：与正常对照组相比，再通0、1、3、5、7、10 d组的MEC数量均有明显差异（P<0.05），再通14 d及21 d组无明显差异（P>0.05）；再通3、5 d时MEC数量下降最为明显，再通7 d开始，MEC数量下降明显放缓。
表 1. 腮腺再生过程中不同时间点的MEC计数.
Tab 1 Numbers of MEC during each step of duct reopening
| 组别 | MEC数量 |
| 正常对照 | 550.40±80.465 |
| 再通0 d | 1 584.30±180.426* |
| 再通1 d | 1 504.62±205.847* |
| 再通3 d | 1 242.55±272.810* |
| 再通5 d | 891.25±312.467* |
| 再通7 d | 765.50±245.214* |
| 再通10 d | 688.64±166.376* |
| 再通14 d | 611.26±154.379 |
| 再通21 d | 584.50±138.589 |
注：*与正常对照组相比，P<0.05。
x±s
3. 讨论
本实验按照潘光华等[4]的实验方法，将医用钢丝捆绑结扎于大鼠腮腺主导管，14 d后取出钢丝使导管再通，成功制造了腮腺萎缩后再生的动物模型。本实验观察到，主导管结扎后14 d，腺泡细胞几乎全部消失，取而代之的是腺体内出现了大量的导管样结构，腺实质大量炎症细胞浸润，仅在腺小叶边缘残留少量的腺泡细胞。通过免疫组织化学染色方法，观察到MEC的数量明显增多，几乎全部分布于导管样结构的周围，呈双套层样结构，形态呈梭形或星形。这与赵腾达等[5]的观察结果是一致的。
主导管结扎后腺体萎缩的机理目前仍然不明确。大部分学者[6]–[7]认为，这是由于细胞自身的凋亡造成的；但Fujita-Yoshigaki等[8]发现，涎腺萎缩过程中，腺泡细胞可通过Src-p38MAPs信号传导通路快速转变为导管样细胞。还有学者[9]通过分子生物学研究发现，在涎腺萎缩过程中，导管细胞因过表达抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病（B-cell lymphoma/leukemia，Bcl）基因未发生凋亡，而腺泡细胞由于表达Bcl相关X蛋白Bax而促进其自身的凋亡。
Burgess等[10]指出，在腺体萎缩过程中，MEC能在一定程度上抑制腺体的萎缩。MEC内含有肌动蛋白，能够发生收缩，促进腺泡及导管的分泌[11]。大量研究发现，MEC在正常状况下增殖率很低，当腺体受到损伤时则出现快速增殖。Walker等[12]发现，在正常唾液腺内很少观察到MEC，但随着腺体进行性萎缩，MEC阳性表达明显，并最终完全围绕在导管样结构周围。本研究中，主导管结扎14 d后，腺泡细胞大量消失，而MEC数量不减反增，说明MEC在抑制腺体萎缩方面发挥了重要作用。笔者推测出现这种现象的原因在于，当导管发生阻塞时，导管内的压力增加，腺泡细胞不再需要MEC促进分泌，为了抵抗导管阻塞带来的压力，MEC大量增殖，并围绕在导管周围；同时由于腺体萎缩，单位视野中MEC数量相对增多。关于大量增生的MEC的来源，目前存在两种观点：一是导管细胞作为潜能细胞大量分化为MEC，二是原来位于腺泡周围的MEC发生了移行。至于具体原因还需要进一步研究。
本实验观察到，主导管再通第1天至第5天时，导管样结构明显减少，体积较小的新生腺泡细胞自腺小叶边缘开始大量增殖；究其来源，大部分学者[13]认为是由闰管储备细胞分化而来，笔者认为，腺小叶周围残余的腺泡细胞主动增殖分化也是其大量增殖的原因之一。此阶段MEC数量减少最为明显，且主要分布在新生腺泡周围，故笔者推测，腮腺的再生主要发生在主导管再通后的5 d内。再通第7天，随着腺体的再生恢复，MEC数量减少的程度不如前期明显，形态也逐渐恢复正常，主要分布在体积较小的新生腺泡及残存的导管样组织周围。再通14 d时，镜下观察到的腺实质内各解剖结构及MEC已基本恢复正常。
综上所述，本研究通过建立腮腺萎缩后再通的动物模型，成功观察到腮腺萎缩后再生过程中MEC及腺小叶中各结构的组织学变化，为研究腮腺导管阻塞后再通的变化提供理论依据，并为进一步研究腮腺萎缩的治疗打下基础。
Funding Statement
[基金项目] 山东省医药卫生科技发展计划基金资助项目（2011HW-004）
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