选择性激光烧结多孔钛种植体及其性能研究

Abstract

Objective

This work aims to analyze the mechanical properties and biocompatibility of porous titanium (Ti) implants fabricated by selective laser sintering (SLS) and investigate the promotion of osseointegration by porous titanium implant combined with chitosan (CS)/hydroxyapatite(HA) composite coating.

Methods

Ti6Al4V specimens were prepared, and CS/HA composite coating was fabricated on the surface of a portion of the specimens. The mechanical properties of the samples were observed by scanning electron microscope. MC3T3-E1 cells were cultured in vitro, and their biological properties in vitro were analyzed using live and dead viability cell staining method, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) staining, and alkaline phosphatase (ALP) level detection. The thread implant specimens were implanted in the femoral condyle of rabbits, and biological performance was evaluated in vivo.

Results

Quasi-elastic gradient of porous specimens decreased with increasing porosity, and the quasi-elastic gradient were close to cortical and cancellous bone when the porosities were 30% and 70%. The specimens showed good biocompatibility. Combined with CS/HA coating, the implants promoted the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells and facilitated the entry of bone tissue into pores and good osteogenesis.

Conclusion

The porous titanium implant exhibited favorable mechanical properties and biocompatibility. Combined with CS/HA coating, the implant exhibited bone inducibility, which leads to stable osteogenesis.

目前口腔用钛种植体的弹性模量与颌骨差异较大，植入后可产生应力遮挡效应而导致种植体周骨组织吸收，引起种植体松动脱落[1]。多孔钛种植体因其弹性模量接近人体骨组织，能够有效减轻应力遮挡效应，且适宜尺寸的孔隙结构，有利于骨组织长入，与孔隙结构形成机械嵌合，以提高骨结合的强度[2]。通过3D打印、选择性激光烧结（selective laser sintering，SLS）技术[3]制作的试件精度优良，完成度高，满足多孔钛种植体的制作要求。壳聚糖（chitosan，CS）/羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）涂层生物相容性好，形成的粗糙多孔结构能够增加与骨组织的接触面积，具有骨诱导性[4]，与多孔钛结合有利于形成快速稳定的骨结合。本实验采用3D打印、SLS技术制备不同形状、不同孔隙率的Ti6Al4V试件，分析其机械性能及生物相容性，探讨多孔钛种植体与CS/HA涂层结合后的促骨结合作用，为种植体的改良和研发提供新思路。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

Ti6Al4V粉末颗粒（山东迈尔口腔材料公司），CS（济南海得贝海洋生物工程公司），MC3T3-E1细胞株（ADCC公司，美国），胎牛血清（湖州天杭生物科技有限公司），α-MEM培养基（Hyclone公司，美国），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索莱宝科技有限公司），活/死细胞活力检测试剂盒（上海恒斐生物科技公司）。

1.2. 方法

1.2.1. 设计制作CS/HA复合涂层处理的多孔钛种植体

采用Rhino 3D造型软件（美国Robert McNeel；Assoc.）设计试件的三维模型，内部设置三维方向贯通的内孔，孔径为 400 µm，多孔结构支柱不小于300 µm，按照实验设计调节孔隙率大小。

1）长条形试件（20 mm×6 mm×1 mm）：用于静态机械性能检测，孔隙率分别为0%、30%、40%、50%、60%、70%；2）圆盘形试件（d=20 mm，h=2 mm）：用于体外细胞培养，试件上部为1 mm厚的多孔结构，孔隙率分别为0%、30%、50%，下部为1 mm厚度实心结构；3）柱状螺纹种植体试件（d=4.1 mm，h=8.7 mm）：用于动物体内实验，试件表面均附有梯形螺纹（螺距1 mm，螺深0.3 mm），顶部为弧形，内有六角形内孔，深度为2 mm，中心为直径1.5 mm的实心支柱，外层孔隙率分别为0%、30%、50%。

在氩气环境利用SLS设备烧结医用Ti6Al4V粉末（直径：20~30 µm），按照厚度20~50 µm、1~5 cm³·h⁻¹的速度逐层烧结，完成多孔钛的三维实体结构，试件喷金后在扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）下观察。将部分圆盘状钛试件和柱状螺纹种植体试件置于49%硫酸和19%盐酸混合酸（1∶1）中，60 °C酸蚀1 h后进行CS/HA电化学沉积，喷金后进行SEM观察。

1.2.2. 静态力学性能检测

利用Instron万能试验机（INSTRON公司，美国）进行三点弯曲试验，恒定变形率为1.8 mm·s ⁻¹，压缩至断裂变形。每组样本获得3例数据，利用SPSS 17.0进行分析。测试结果呈现为应力−应变曲线，多孔材料在弹性变形阶段为非线性关系，由曲线所得的准弹性梯度最接近于固体材料的弹性模量的概念，故在本实验中用准弹性梯度值作为弹性模量，计算弹性变形阶段的准弹性梯度。

1.2.3. MC3T3-E1细胞培养

MC3T3-E1细胞株取自小鼠颅盖骨，具有成骨细胞的各项生物学特性及表型，是常用于体外培养且效果良好的成骨样细胞株。采用完全培养基（10%血清、1%青链霉素混合液，89%α-MEM培养基）在5%CO₂、37 °C恒温培养箱培养MC3T3-E1细胞。待细胞生长至80%~90%时，以每孔5×10⁴的细胞密度分别接种于含/不含CS/HA涂层、不同孔隙率的钛盘上培养，隔天换液。

1.2.4. 活/死细胞染色

MC3T3-E1细胞按照1.2.3分组，在各组钛盘上培养1、3、7 d后进行活/死细胞染色。将含有2 µmol·L⁻¹钙黄绿素-AM和8 µmol·L⁻¹碘化丙啶（propidium indide，PI）的工作液混合后加入到各组钛盘表面，观察标记的细胞，Image-Pro Plus 6.0 软件进行图片合成及数据分析。

1.2.5. 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞增殖活性

MC3T3-E1细胞按照上文1.2.3分组，在各组钛盘上培养2、5 d后，用MTT法检测细胞增殖活性。在每个钛盘上加入1 000 µL无血清的α-MEM培养基及200 µL MTT（5 g·L⁻¹ ）溶液，4 h后加入DMSO使孔内晶体充分溶解后加入96孔板，采用酶标仪在490 nm处测定各孔光密度（optical density，OD）值，计算MTT活性。

1.2.6. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定

MC3T3-E1细胞按照上文1.2.3分组，在各组钛盘上培养7 d，1%Triton-X 100辅以超声裂解后，以BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。根据ALP活性检测试剂盒，采用酶标仪在520 nm处测定OD值，以计算ALP活性。

1.2.7. 动物实验

经山东大学动物伦理委员会批准，选取12只新西兰白兔（雄性，2.7~3.2 kg，14~16周），随机分为两组，每组6只，术前常规喂养7 d。水合氯醛（1~1.2 mL·kg⁻¹）进行全身麻醉，双侧后肢行2 cm切口，暴露双侧股骨髁突外侧，选定植入区域，先锋钻定位，扩孔钻逐级扩大，最终形成直径3.5 mm、深度8.7 mm的骨缺损，使用六角形扳手将0%、30%、50%孔隙率复合CS/HA涂层的螺纹种植体植入双侧股骨（每孔隙率组种植体12枚，共36枚，每只家兔均植入3种不同孔隙率的种植体），生理盐水冲洗后严密缝合。术后3 d给予家兔头孢唑啉钠每天每只20万U预防感染，分别于术后4、12周处死家兔。取双侧种植体及周围1 cm骨组织样本，并进行X线检查。经固定、脱水、包埋后，采用硬组织切片机沿种植体长轴制作30 µm厚硬组织切片，亚甲基蓝-酸性品红染色后置于体视显微镜下观察。并采用Image-Pro Plus 6.0 软件（美国Media Cybernetics图像技术公司）在骨结合界面，测量每个图像中种植体的长度、种植体与骨直接接触长度（含孔隙内壁接触的部分），以计算骨亲和率，即骨亲和率=种植体与骨直接接触长度/种植体的骨内总长度×100%。

2. 结果

2.1. SLS技术制备Ti6Al4V试件

各试件表面结构完整，孔隙清晰，与Rhino 3D造型软件设计一致，形态良好（图1）。

图 1. 模型及试件.

Fig 1 Model and test specimens

A：Rhino 3D造型软件设计的多孔柱状螺纹种植体的三维模型，从左至右依次为实心种植体试件、多孔种植体试件及多孔种植体试件的底面观；B：长条形钛试件，从左至右依次为孔隙率0%、30%、40%、50%、60%、70%组；C：圆盘状钛试件，从左至右依次为孔隙率0%、30%、50%组；D：柱状螺纹种植体试件，从左至右依次为孔隙率0%、30%、50%组。

2.2. Ti6Al4V试件SEM观察结果

采用SEM观察多孔钛试件表面形貌，低倍镜下见实心柱状螺纹种植体表面微粗糙，无明显铸造缺陷，附梯形螺纹，螺距约为1 mm，齿深0.3 mm（图2A）；多孔钛试件可见孔隙均匀分布，贯通良好，孔内壁有部分熔融后的钛粉颗粒附着，呈现微粗糙度（图2B、C）；高倍镜（×1 500）下可见直径为25 µm的未完全熔融钛粉颗粒（图2D）。利用电化学沉积法制备CS/HA涂层后，高倍镜下见涂层均匀，为致密的层片状，裂纹较少，表面分布微孔隙（图2E、2F）。

图 2. Ti6Al4V试件的SEM图像.

Fig 2 The SEM images from the Ti6Al4V test specimens

A：实心柱状螺纹种植体 × 50；B：多孔钛试件表面微粗糙度 × 50；C：多孔钛试件表面微粗糙度 × 100；D：未完全熔融的钛粉颗粒 × 1 500；E：HA/CS涂层 × 1 000；F：HA/CS 涂层 × 2 500。

2.3. 机械性能检测

利用三点弯曲法对多孔钛试件进行机械性能检测，结果表明：多孔钛试件的准弹性梯度相对于实心钛试件减小（P<0.05）；且随孔隙率的增大而减小，不同孔隙率组间差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。当孔隙率为30%和70%时，其准弹性梯度分别与人体下颌骨皮质骨[5]和松质骨[6]的弹性模量相接近。

图 3. 多孔钛试件准弹性梯度.

Fig 3 Quasi-elastic gradient of porous specimens

2.4. 活/死细胞染色结果

活/死细胞染色结果表明在各组钛试件表面，MC3T3-E细胞均具有高活性，活细胞比率均高于85%，各组间无显著性差异（P>0.05）。培养1 d时细胞多附着在实心钛盘表面及多孔钛盘的支柱上，孔内壁细胞较少；3 d时，多孔钛盘孔内细胞增殖迅速，附着于孔内壁，细胞开始相互接触；7 d时，实心钛盘表面细胞密度达到90%以上，多孔钛盘支柱上细胞密集出现接触抑制（图4）。以上的结果表明，MC3T3-E1细胞在多孔钛试件表面生长活性良好。

图 4. 活/死细胞染色 钙黄绿素-AM/PI × 40.

Fig 4 Live/dead cell viability assay calcein-AM/PI × 40

从上至下依次为培养1、3、7 d；从左至右孔隙率为0%、30%、50%。

2.5. ALP活性检测结果

ALP活性检测结果表明，无论有无CS/HA涂层，多孔组钛盘表面细胞ALP水平显著高于实心组（P<0.05）；经过CS/HA涂层处理后，孔隙率30%钛盘表面细胞ALP水平高于孔隙率50%钛盘（P<0.05），CS/HA涂层处理后钛盘表面细胞ALP水平较同孔隙率无表面处理组显著升高（P<0.05）（图5）。

图 5. ALP水平检测.

Fig 5 ALP levels detection

2.6. MTT染色实验

2、5 d时CS/HA涂层处理组钛盘表面细胞MTT值高于无表面处理组（P<0.05），相同处理方式多孔组较实心组相比MTT值显著增高（P<0.05）（图6）。

图 6. MTT染色结果.

Fig 6 MTT staining results

A1、B1、C1分别为培养2 d，0%、30%、50%孔隙率；A2、B2、C2分别为培养5 d，0%、30%、50%孔隙率。

2.7. 硬组织切片结果

硬组织切片结果见图7。

图 7. 硬组织切片结果 亚甲基蓝-酸性品红染色.

Fig 7 Hard tissue slicing results methylene blue-acid fuchsin staining

A~C：培养4 d，× 40；D、F：培养4 d，× 200；E：培养4 d，× 100；G~I：培养12 d，× 40；J、L：培养12 d，× 200；K：培养12 d，× 100。从左至右孔隙率为0%、30%、50%。

植入4周后可见新生骨覆盖实心柱状种植体颈部的螺纹，高倍镜下见成骨细胞围绕种植体呈密集排列，可见较细长、红染的新生骨小梁；多孔柱状种植体外表面可见紧贴种植体的新生骨，新生骨小梁由基骨向种植体表面生长，孔隙内部有红染深亮的新骨，且与内孔紧密相连，分布较为离散，另可见大量核深染的成骨细胞，成骨作用活跃（图7）。在12周时，实心柱状种植体周新生骨面积增加，骨小梁变粗；多孔组柱状种植体外表面可见新骨向中间区域延伸，同时孔内新骨面积增加，呈相连趋势；且近表面孔隙已出现片状新骨，高倍镜下见近表面孔隙被新生骨组织所充满，骨小梁细密，成骨活跃（图7）。

新骨呈亮红色，旧骨则呈轻度粉红色。骨亲和率结果见图8，相同时间下，孔隙率增大，骨亲和率随之增大；相同孔隙率种植体，12周时骨亲和率明显高于4周（P<0.05)。

图 8. 骨亲和率.

Fig 8 The bone affinity rate

3. 讨论

SLS[3]是3D打印技术的一种，具有高精度的特点。本实验采用的 MLabcusing R3D打印机，精度可高达到0.05 mm，所制作的试件与3D数字模型偏差小，孔隙大小相似，贯通良好，内部结构精细；但部分孔隙内壁存在球状均匀钛微珠颗粒，这些小球状颗粒可能是烧结过程中未熔化的金属粉末颗粒和球化效应[7]引起的。本实验中钛种植体通过酸蚀处理后，表面附着球形颗粒大幅度减少。CS具有抗氧化和促进伤口愈合的作用[8]，与HA结合可兼有良好的柔韧性和硬度，该复合涂层能够促进体内成骨作用[4]，并且具有巨大的比表面积和高表面活性，可以作为药物的载体[9]，如加载庆大霉素可有效减少早期种植体周围炎的发生。利用电化学沉积法制备CS/HA涂层，与多孔钛结合可形成多层次粗糙度，涂层深入孔隙内壁并完整保留，以促进体内新骨形成，并可赋予抗菌性能。

本实验采用长条形试件进行准弹性梯度检测，结果表明多孔钛试件较实心钛试件准弹性梯度明显降低，并随孔隙率增大而降低，与三维有限元分析结果相近[10]。并且，当孔隙率为30%和70%时，其准弹性梯度分别接近人体皮质骨（12.6~21 GPa）和松质骨（0.5~3.5 GPa）的弹性模量[5]–[6]，可有效减轻应力遮挡效应。

种植体生物相容性、表面结构与性能被认为是影响骨结合的关键因素[11]。SLS制作的多孔钛试件生物相容性好，活/死细胞染色及MTT检测表明相比于二维平面结构，成骨细胞在多孔表面增殖更快。ALP水平检测结果表明成骨细胞在多孔结构中分化成熟水平较实心结构高，且30%孔隙率组高于50%孔隙率组，并且当孔隙率为30%时，其准弹性梯度接近人体皮质骨的弹性模量[5]，因此，30%孔隙率的多孔钛种植体弹性模量与人下颌骨皮质骨相近，即能改善应力遮挡效应，又能有效地促成骨细胞分化，在种植体表面改性方面具有很大潜力。且经CS/HA涂层处理后，同孔隙率组增殖活性、分化水平均显著增强，提示CS/HA涂层与多孔钛结合后，能够促进成骨细胞的增殖与分化，并且在孔隙内部发挥作用。

种植体-骨界面的骨结合情况是口腔种植学研究的重要内容。多孔钛种植体表面由于孔隙结构的存在而呈凹凸状，骨组织长入孔隙后与相应孔隙共同组成类似机械锁和的结构，该结构能够减小种植体与周围骨组织之间的微动程度，从而提高早期稳定性，使种植体处于相对稳定的状态，不易产生滑动移位；同时有利于成骨细胞以及相关蛋白的附着[12]。本实验将孔隙率为0%、30%、50%多孔钛种植体植入兔双侧股骨髁部，亚甲基蓝-酸性品红染色观察发现新生骨组织紧密贴附于种植体表面生长，未见骨吸收、萎缩、炎症等异常情况出现，表现为多孔钛种植体与CS/HA涂层结合，具有良好的生物相容性。多孔钛种植体内部孔隙有新生骨组织长入，高倍镜下可见大量的深蓝色成骨细胞及骨小梁结构；较致密实心种植体而言，多孔钛种植体交互贯通的孔隙结构有利于骨组织长入，与种植体形成机械嵌合。同时，多孔钛复合CS/HA涂层种植体具有良好的骨亲和率，且随着孔隙率增大、植入时间的延长而增大。体内实验与体外实验结果相印证，从宏观层面证明，复合CS/HA涂层的多孔钛种植体在动物体内促进成骨作用优于致密钛种植体组，有利于骨结合的形成。

综上所述，本实验对SLS制备的多孔钛种植体进行机械性能及生物学性能的研究，并与CS/HA涂层结合，结果显示试件准弹性梯度随孔隙率增大而减小，孔隙率为30%和70%时，与皮质骨和松质骨接近；试件具有良好的生物相容性，结合CS/HA涂层可以促进MC3T3-E1细胞增殖、分化，有利于骨组织长入孔隙，形成良好的骨结合，其中的机制还有待进一步研究。

Funding Statement

[基金项目] 山东省自然科学基金（ZR2014HM053）

Supported by: The National Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2014HM053)