自体牙骨粉与异种牛骨粉修复牙槽骨缺损的对比研究

Abstract

目的

对比拔牙后牙槽窝内填塞自体牙骨粉与异种牛骨粉的成骨效果，为临床应用提供实验依据。

方法

全身麻醉下拔除12只雄性大白兔双侧上颌中切牙，随机分为3组，每组4只。每组动物中有3只为实验组，1只为空白对照组。实验组中选择动物的左侧中切牙牙槽窝植入异种牛骨粉，右侧中切牙牙槽窝中植入自体牙骨粉；空白对照组只拔除牙齿，不植入任何骨粉。4、8、12周后分别处死3组实验动物，通过免疫荧光染色观察新生骨组织矿化程度，通过组织学观察新生骨形成情况。

结果

术后4、8、12周，自体牙骨粉组的矿化沉积率均大于异种牛骨粉组，差异均有统计学意义（P<0.05）；异种牛骨粉组的骨小梁较自体牙骨粉组稀疏、纤细，编织骨较多，板层骨较少，骨增量少于自体牙骨粉组。

结论

作为骨移植材料，自体牙骨粉较异种牛骨粉在成骨方面更具有优势。

拔牙后牙槽嵴在高度和宽度上会逐渐降低和减少，导致牙周手术、种植手术、修复治疗以及正畸治疗难以实施。临床上常常需要用骨移植材料来修复牙槽骨的缺损。骨移植材料的广泛应用扩大了口腔各学科治疗的适应范围[1]，这些骨移植材料的成骨效果也成为研究的热点。

异种牛骨粉由冻干的小牛骨脱有机质制成，具有良好的生物相容性，在形态和化学结构上与矿化的人骨相似[2]。作为骨移植材料之一，异种牛骨粉在临床上应用广泛，并已取得良好的成骨效果[3]，但临床实践中发现，该材料存在不易被机体完全吸收的缺点[4]。

在临床上常出现外伤牙发生牙根吸收并被骨组织替代的现象，这激起了学者们把已拔除的牙制作成骨移植材料的研究热情。牙本质的无机物含量为70%~75%，有机物含量约为20%，与牙槽骨非常相似。牙本质中有机物的90%为Ⅰ型胶原纤维，具有促进骨形成和矿化的特性；10%为非胶原蛋白，可促进骨的钙化。牙本质基质脱矿后牙本质小管暴露，管间和管周牙本质的纤维束变得稀疏，为牙本质基质释放蛋白和生长因子提供通路。基于牙本质的这些特性，学者们研制出一种新型的骨移植材料——自体牙骨粉。

自体牙骨粉的制作流程如下：将拔除的牙齿放入乙醇中消毒后，用过氧化氢消毒1 min，再用灭菌生理盐水冲洗，去除所有龋坏组织、菌斑、牙周软组织及牙髓组织后，使用三用枪吹干并用粉碎器粉碎牙齿，选择合适的过滤器反复过滤4~5次，确定粒度尺寸在450~850 µm之间，检查粉碎牙齿的体积，最大体积不超过3 mL，用漏斗把牙齿颗粒放入牙粉容器后置入全自动真空超声牙齿脱矿加速器中，进行粉碎、脱矿、脱脂、消毒等处理，制成块状和粉状两种类型。

自体牙骨粉是由55%的羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）为主的无机物与45%的有机物所组成。以HA为主的无机物具有将游离的钙及磷酸盐附着于骨的特性；而有机物包括Ⅰ型胶原蛋白，具有成骨和骨诱导的特性[5]。

本实验对自体牙骨粉和异种牛骨粉成骨效果的差异进行研究，将自体牙骨粉与异种牛骨粉分别填塞于兔的上颌拔牙窝内，通过组织学和四环素荧光染色的方法对拔牙窝新生骨情况进行观察并测量，对比这两种骨移植材料的成骨效果，为临床应用提供依据。

1. 材料和方法

1.1. 实验器械及材料

全自动真空超声牙齿脱矿加速器；异种牛骨粉（盖式公司，瑞士）；EXAKT 300PC硬组织切片机（德国EXAKT公司，北京301医院提供）；其他常规试剂为国产分析纯。

1.2. 动物模型及实验分组

3月龄健康雄性大白兔12只，体重3~4 kg，由大连医科大学动物实验中心提供并饲养。将12只动物编号为1~12号，随机分为3组（A、B、C组），每组4只。每组动物中的3只为实验组，1只为空白对照组。实验组选择动物的左侧中切牙牙槽窝中植入异种牛骨粉，右侧中切牙牙槽窝中植入自体牙骨粉；空白对照组只拔除牙齿，不植入任何骨粉。

1 mL·kg⁻¹戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉动物，常规消毒后拔除兔上颌双侧中切牙，植入相应骨粉后，采用褥式加间断缝合。术后实验动物自由活动，连续3 d肌肉注射庆大霉素16万U预防感染。4、8、12周后分别处死A、B、C组实验动物，分离上颌骨，制作标本，进行观察。

1.3. 检测指标

1.3.1. 大体观察

观察实验区牙槽嵴和黏膜组织变化情况以及术区愈合情况。

1.3.2. 免疫学观察

通过免疫荧光标记技术研究植骨愈合过程中新生骨组织矿化过程以及骨形成情况。本研究采用四环素作为染色剂，实验动物处死前13、14 d和3、4 d分别注射四环素荧光染色剂，制作切片后测量两条荧光标记的黄色条带之间的距离，通过条带距离可以计算出骨矿化沉积率。新生骨矿化沉积率=荧光标记距离（µm）/天数（d）×100%。

1.3.3. 组织学观察

对于带荧光标记的骨组织、陶瓷材料等进行牙槽骨缺损修复实验的标本，因其材料的特殊性，不脱钙骨组织磨片是较好的研究方法。本实验采用Goldner's三色染色法，主要观察骨组织及类骨质的形成情况。取3组标本经甲醛溶液固定，70%~100%乙醇梯度脱水，氯仿透明，取出组织块用德国EXAKT 300PC硬组织切片机将组织切取200 µm切片，用德国EXAKT 400磨片机，以320、800、1 200目砂纸将切片磨至40 µm，最后以4 000目砂纸抛光，经染色后，新生骨呈浅蓝色，类骨质呈桔红色，观察骨质形成情况。

1.4. 统计学分析

采用SPSS 17.0软件包进行数据分析，统计方法采用配对样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. 大体观察

术后5 d，实验动物饮食饮水正常，术后2周，术区黏膜色泽正常，伤口已愈合。

2.2. 免疫学观察

实验动物处死前第3、4天和第13、14天分别注射四环素荧光染色剂，荧光染色标记的切片图见图1。使用Image-Pro Plus 6.0软件测量图1中两条黄色条带之间的距离，计算骨矿化沉积率。不同组的条带间距和骨矿化沉积率见表1，术后4、8、12周，自体牙骨粉组的骨矿化沉积率高于异种牛骨粉组和空白对照组（P<0.05）。

图 1. 3组材料的荧光染色标记 免疫荧光染色 × 10.

Fig 1 Fluorescent staining markers of three groups immunofluorescence staining × 10

上、中、下分别为异种牛骨粉组、自体牙骨粉组、空白对照组；左、中、右分别为术后4、8、12周。

表 1. 不同组的条带间距和骨矿化沉积率.

Tab 1 The band spacing and bone mineralization deposition rate in different groups

组别	4周		8周		12周
	条带间距/µm	矿化沉积率/%	条带间距/µm	矿化沉积率/%	条带间距/µm	矿化沉积率/%
空白对照	23.62±2.16	236.2±21.6	28.96±6.57	289.6±65.7	34.55±6.98	345.5±69.8
异种牛骨粉	33.88±1.43	338.8±14.2	38.98±3.15	389.8±31.5	44.01±5.62	440.0±56.1
自体牙骨粉	49.34±4.69*Δ	493.3±46.8*Δ	57.93±7.44*Δ	579.2±74.3*Δ	65.12±7.63*Δ	651.2±76.3*Δ

注：*自体牙骨粉组与异种牛骨粉组比较，P<0.05；^Δ与空白组比较，P<0.01。

2.3. 组织学观察

Goldner's三色法染色见图2，异种牛骨粉组和自体牙骨粉组均可见淡蓝色的新生骨组织形成，且有深染的成骨细胞；自体牙骨粉周围新生骨以板层骨为主，部分骨小梁成熟，而异种牛骨粉组新生骨主要为编织骨，板层骨较少，且骨小梁稀疏、纤细。由图2可见，时间越长，骨粉逐渐吸收并形成新骨，自体牙骨粉组的新骨形成速率明显高于异种牛骨粉组。

图 2. 3组材料的成骨情况 Goldner's三色法染色 × 10.

Fig 2 Osteogenesis of three groups Goldner's triple-stain technique × 10

上、中、下分别为异种牛骨粉组、自体牙骨粉组、空白对照组；左、中、右分别为术后4、8、12周。

3. 讨论

早在1967年，Yeomans等[6]即成功地从兔和人的脱矿牙本质基质（demineralized dentin matrix，DDM）中提取出骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP），并证明BMP可以促进骨的形成。2012年，Kim等[7]用DDM来修复小猪头颅的骨缺损，第4周时DDM周围出现新骨形成，5~12周时牙本质中的非胶原蛋白促进骨钙化，充分证明了DDM作为骨移植材料的可行性，进而学者们将DDM应用于临床来修复骨缺损。自体牙骨粉是在DDM的基础上进行加工和改进，去除拔除牙齿的软组织和杂质，使用自体牙骨粉制备系统对处理后的牙齿进行脱脂、脱矿、消毒后制备成块状和粉状两种类型[8]。本实验于兔上颌拔牙窝内填塞自体牙骨粉和异种牛骨粉，并应用免疫学的方法对成骨量进行分析，以对比两种骨移植材料的成骨效果。

成骨过程一般为骨祖细胞在生长因子的作用下分化成成骨细胞，成骨细胞在一定环境下产生类骨质，并包埋于类骨质中产生骨细胞，类骨质经钙化形成骨基质，骨细胞与骨基质结合形成骨组织。本研究经Goldner's三色法染色对成骨各阶段进行对比后发现，随着时间的变化，自体牙骨粉组和异种牛骨粉组的骨粉均与新生骨发生融合，且被新骨代替，但异种牛骨粉组的骨粉残余较多（图2）。Bessho等[9]发现，自体牙骨粉可以在无胸腺鼠的背部肌肉组织中成骨。牙本质中的BMP与骨的BMP均可促进软骨和骨的形成，刺激未分化的间充质干细胞分化成软骨组织，此时，牙本质中的非胶原蛋白如骨钙蛋白、骨钙化素、唾液蛋白促进骨的钙化，使软骨组织钙化成骨组织。

本研究采用荧光标记技术，此技术是研究植骨愈合过程中新生骨组织矿化过程以及骨形成的常用方法。荧光染色剂应具备以下条件：1）有效剂量对骨盐代谢无影响；2）与骨结合后，经紫外线照射能发出稳定的荧光；3）在骨矿化期，注入体内后能迅速与钙结合，沉积在新骨中[10]。本研究采用四环素作为染色剂。四环素是亲钙剂，无毒性，能与新生骨基质中的钙离子结合，并随新骨沉积，且这种亲钙剂可以长期存在，这是因为亲钙剂与新生骨的基质和钙三者之间能发生密切而复杂地结合，但对骨的形成和代谢无明显影响。如图1所示，经测量自体牙骨粉组的矿化沉积率均大于异种牛骨粉组，该结果说明，自体牙骨粉在成骨方面更具有优势。Reis-Filho等[11]建立鼠上颌双侧第二磨牙拔牙模型，研究脱矿牙本质基质作为骨移植材料的效果，并且评估成骨时血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达。VEGF是骨形成过程中的重要生长因子，在成骨细胞和血管内皮细胞之间起到重要的连接作用。实验结果发现，在7、14 d实验组的骨增量明显大于仅填入血凝块的对照组，且在7、14 d时VEGF的表达明显增加。该研究发现VEGF可刺激内皮细胞的细胞外基质退化和迁移，且VEGF还可作为血管渗透因子促进血管形成。Boden等[12]在成牙质细胞及血管内皮细胞中发现了LIM矿化蛋白1（LIM mineralization protein-1，LMP-1），证实LMP-1在成骨细胞的分化、成熟及骨形成方面具有重要的调节作用。Ike等[13]发现，根部的牙本质基质可以作为rhBMP-2的载体循环利用，诱导牙周区域的新骨形成。Murata等[14]发现，自体牙骨粉不仅不会抑制BMP的活性，还能使BMP更好地释放，并配合其他生长因子，协同促进骨形成。Lee[15]发现，在成骨细胞分化过程中，有增殖的MG-63细胞黏附在部分牙本质基质表面，证实了MG-63细胞和自体牙骨粉之间有良好的生物相容性。由这些研究可以看出，自体牙骨粉在骨诱导方面有着很好的作用。

自体牙骨粉不仅具有骨诱导的特性，在骨传导方面也起着重要的作用。自体牙骨粉包含HA及其他钙磷矿物质，与人的骨组织相似；然而，在牙齿的不同部位，HA的结晶度和含量是不同的，牙冠部的HA含量和钙磷比要高于牙根部。Kim等[16]对自体牙骨粉的牙冠、自体牙骨粉的牙根、同种异体骨粉、异种牛骨粉等进行比较，结果发现，自体牙骨粉的牙根部与自体的皮质骨在理化性质方面最相似，且根部的自体牙骨粉骨传导能力更强。Priya等[17]发现，低晶度的HA具有良好的骨传导性和生物降解能力。Nampo等[18]用自体牙骨粉修复牙槽骨缺损时发现，在自体牙骨粉表面存在一种牙本质特异性的非胶原蛋白，证明了自体牙骨粉与骨传导有密切的关系。

Murata等[14]通过使用自体牙本质作为骨移植材料来增加骨量并用于上颌窦提升术。还有学者[19]发现，自体牙骨粉移植没有异常的细胞毒性反应与过敏反应，且避免了自体骨移植时供骨区域损伤和取骨量受限的问题，以及使用其他骨移植材料的排斥反应，且获得的骨粉量较大。Lee等[20]用组织形态测定的方法来评估在上颌窦提升术使用不同的骨移植材料的效果，结果显示：自体牙骨粉组的新骨形成率为52.5%±10.7%，而异种牛骨粉组为51.0%±18.3%，差异有统计学意义（P<0.05），说明自体牙骨粉具有良好的成骨作用。有研究[21]–[22]认为，异种牛骨粉在促进新骨形成方面并不是很有效，而被认为是一种半永久性的支架材料。本研究结果显示，自体牙骨粉在成骨方面明显强于异种牛骨粉。

在种植术中会出现骨开窗和骨开裂等并发症，因此需用骨移植材料来引导骨再生。Kim等[23]研究发现，自体牙骨粉引导骨再生术后3~6个月，自体牙骨粉逐渐被吸收，并被46%~74%的新骨所替代。Kim等[24]还发现，自体牙骨粉在引导骨再生术中形成大量的板层骨，并且具有良好的骨诱导和骨传导的特性。

临床上有些无牙颌患者，或自身没有需拔除牙齿的患者，无法用自体牙骨粉来修复牙槽骨缺损，能否利用临床上废弃的牙齿经过处理后来修复这些患者的牙槽骨缺损还有待进一步研究；但作为骨移植材料，自体牙骨粉较异种牛骨粉在成骨方面更具优势，且自体牙骨粉具有良好的骨诱导和骨传导的特性，因此自体牙骨粉将会成为骨移植材料中较好的选择。

Funding Statement

[基金项目] 辽宁省自然科学基金（2015020300）

Supported by: Liaoning Natural Science Foundation (2015020300)