壳聚糖复合材料在骨组织工程中的研究进展

Abstract

骨组织工程是利用生物学和工程学方法研制能修复或替代人类骨组织材料的科学领域。支架是组织工程的关键要素，为细胞和组织生长提供结构支持和黏附位点。支架可以由金属、聚合物和陶瓷生物材料制成，其中聚合物支架由于其生物相容性、生物可降解性和机械稳定性而被广泛应用。而壳聚糖（CS）作为甲壳素衍生的天然聚合物，过去20年在骨组织工程中发挥了重要作用。近年来，CS复合材料在骨组织工程领域的应用受到相当大的关注，因为它具有更小的异物反应，优良的抗菌性、可塑性，适合细胞向内生长和骨传导。本文将讨论常见的几种CS复合材料在骨组织工程中的生物相容性及体内外促成骨研究。

甲壳素又名甲壳质，是一种氨基多糖聚合物，系统名为（1,4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，其广泛存在于低等动物如虾、蟹等的甲壳，蟋蟀等昆虫的甲皮，丽文蛤、牡砺的贝壳中以及一些低等植物如真菌、藻类的细胞壁中，也可源于有机酸类、抗生素和酶的酿造副产物。它是世界上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。壳聚糖（chitosan，CS）是甲壳素脱乙酞基的产物，是由β-（1→4）-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-（1→4）-2-氨基-D-葡萄糖单元键组成的共聚物，属天然含氨基的均态直链多糖，含有游离氨基，反应活性和溶解性能均比甲壳素强[1]。CS拥有良好的生物相容性、生物降解性、多孔结构、骨传导性和内在抗菌性，其支架材料在生物医学领域得到广泛应用。然而CS支架的机械性能比正常骨组织差，不能支撑承载骨植入物。此外，CS支架本身不具有骨传导作用。为了改善CS支架材料机械性能较差，骨传导作用较弱等问题，众多学者开始着手于研发CS复合材料[1]–[2]。本文将讨论常见的几种CS复合材料在骨组织工程中的应用。

1. CS复合羟磷灰石（hydroxyapatite，HAP）

HAP与骨组织化学性质相似，其已被证明可以刺激骨诱导，同时整合到骨组织中，不会引起免疫反应。与天然或合成聚合物复合后仍能在生理环境中维持良好的生物相容性。研究[3]发现CS/HAP共混物形成的可塑材料或可注射剂比纯HAP粉末或颗粒更容易应用，一定程度上弥补了CS材料机械强度较低的缺陷。

Dhivya等[4]使用溶胶凝胶法分别制成了Zn-CS/β-甘油磷酸（glycerophosphate，GP）及Zn-CS/纳米羟磷灰石（nanohydroxyapatite，nHAP）/β-GP复合物水凝胶，两种水凝胶的比较结果显示，nHAP的出现能够增强水凝胶的溶胀性能、蛋白质吸附作用和外源性生物矿化，促进成骨细胞分化，加快鼠胫骨骨缺损的骨形成。Ai等[5]通过溶胶的方法将HAP的微粉和纳米粉分别加入淀粉CS水凝胶（比重为0.38）中，扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）结果显示：纳米尺寸的HAP颗粒能在聚合物分子中均匀分布，而微米尺寸的颗粒则不能。应力应变曲线实验结果提示纳米颗粒的拉伸系数随着HAP填料比重的增加，升高更显著。由于纳米粒子在聚合物基质中均匀分布，它的强度要高于微米粒子。溶胀实验表明包含HAP粉末的复合物的溶胀百分比随着HAP的比重增加而减少，但是纳米颗粒的溶胀百分数要更小一些，这归功于纳米粒子的均一分布特性和其对水分子渗透的屏障膜作用。Tylman等[6]用电解法制备了CS-HAP支架。结果显示HAP更加均一地分散在聚合物基质中，支架的平均孔隙度为85%~96%，且与CS溶液中HAP的浓度有关。当HAP含量增加时，支架的平均孔隙度下降。HAP的浓度直接影响电极上获得的支架的量。另外，HAP的加入增加了材料的骨传导性，缩短了骨组织的再生时间。Chen等[7]用溶胶法分别合成CS/β-GP水凝胶和CS/β-GP/HAP水凝胶，继而检测这两种水凝胶对体外环境中牙髓间充质干细胞的增殖及成骨分化的影响。结果发现，CS/β-GP/HAP水凝胶的孔隙更加紧密、均一、连续，直径在10~20 µm。HAP颗粒均一地铺在水凝胶表面，这得益于HAP加强了水凝胶材料的稳定性能。此外，HAP也被证实具有加速骨形成，促进牙髓间充质干细胞成骨分化的作用。Gao等[8]将重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）和地塞米松负载到HAP纳米粒子上，再将粒子加入到可注射CS/β-GP水凝胶中，结果显示nHAP能够均一地分散在水凝胶基质中，而且药物的加入促进了间充质干细胞的增殖和成骨分化。

另外，有学者专门比较了不同培养条件下HAP对CS水凝胶性能的影响。Beşkardeş等[9]采用微波照射和气体发泡技术成功生产出了壳聚糖基的超大孔水凝胶。凝胶和起泡能在很短时间内通过微波照射同时发生。HAP的加入增加了该支架的溶胀和机械性能。静态和动态细胞培养研究都表明这种CS-HAP超大孔水凝胶复合材料在骨组织工程领域有良好的应用前景。Beşkardeş等[10]还观察了体外灌注式动态共培养的人类间充质干细胞来源的成骨细胞和thp-1人类急性单核细胞白血病系来源的破骨细胞在CS-HAP超大孔水凝胶中的表现。与静态培养的细胞相比，水凝胶支架表面有更好的细胞黏附，支架中的物质转移增强，且灌注培养本身也对成骨细胞及破骨细胞的分化具有机械刺激作用。Li等[11]研究发现紫外线交联的注射性CS水凝胶复合高含量HAP后能明显加速骨形成。

向聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）中加入CS-GP温敏水凝胶作为孔隙形成媒介，加入骨诱导型nHAP/庆大霉素作为载体，以改善PMMA的低生物活性、低硬度、高聚合温度的不良性能。结果发现，加入的nHAP不仅不损害材料的机械性能，还能够显著提高材料的矿化能力[12]。Wang等[13]复合PMMA/CS-聚乙烯醇/nHAP/银离子温敏注射性水凝胶用以改善PMMA性能，同样证明了nHAP的促骨水泥矿化的能力。Nguyen等[14]通过体外试验证实，负载双磷酸钙、HAP、三磷酸钙纳米颗粒的水凝胶具有优良的生物相容性和机械性能，促间充质干细胞增殖及黏附作用，有望应用于骨组织工程中。Huang等[15]发现一种新的原位骨形成修复材料：CS/nHAP/胶原溶液，其能在体温条件下快速形成稳定的水凝胶，且表现出天然骨的特点。

2. CS复合胶原

Ⅰ型胶原是最丰富的细胞外基质蛋白，具有良好的促细胞黏附及增殖作用和强大的机械性能。其上有多种细胞特异性结合位点，对细胞功能有重要的调控作用。CS是一种多糖，没有特异性的结合位点用以黏附细胞。Wang等[16]研究了CS、Ⅰ型胶原复合物包裹人类骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的复合材料在骨组织工程中的应用。结果显示，与单纯CS水凝胶材料相比，包含胶原的材料结合得更紧密，硬度也更高。除此之外，包埋于单纯CS材料中的人BMSC在培养基中只维持了3周的最初形态，随后DNA内容物大量下降（提示材料上的细胞在逐渐凋亡），而Ⅰ型胶原的加入能够显著增加细胞铺展，使人BMSC细胞变成纺锤状细胞，增殖速度加快。然而材料中较高的胶原含量并不会导致凝胶中DNA含量的增加，也就是说这些材料上的细胞数量是相似的，但是细胞浓度却随着胶原浓度的增加而增加，分析其原因可能是胶原的增加导致凝胶浓缩，材料整体体积下降。另一研究[17]中，在体内pH及温度作用下将人BMSC包埋于CS/胶原水凝胶中，利用β-GP启动凝胶过程，进一步探究乙二醛修饰的水凝胶对支架及细胞性质的改建作用。结果发现，这种水凝胶复合材料能作为细胞输送工具，加快骨缺损的修复，并且CS胶原的比例能够影响细胞功能，包括细胞黏附、铺展、增殖和成骨分化。单纯的CS基质不能促进细胞增殖，CS比例过高甚至会引起细胞的大量凋亡。胶原结合位点降低有可能导致细胞铺展范围下降。50/50比例的CS/胶原材料用1.0 mmol·L⁻¹的乙二醛作用30 min后能在标准刺激条件下达到更好地促进人BMSC成骨分化的作用。

Moreira等[18]研究表明加入了胶原和生物活性玻璃的CS水凝胶的形态学和流变学的性质显著改善，其中水凝胶结构的改变（孔隙大小和材料间充分的相互关联）主要是受加入的胶原的影响。胶凝作用的流变学分析显示：胶原和生物玻璃的加入增加了基质硬度。加入2%生物活性玻璃纳米粒子的水凝胶的硬度比单纯CS水凝胶硬度增加约39%，而30%胶原的加入能使硬度进一步增加95%。体外细胞学实验显示复合胶原的CS水凝胶对人类骨肉瘤SAOS细胞和人类胚胎肾细胞系HEK 293T细胞没有毒性，是很好的注射性组织工程支架。Arakawa等[19]报道了包含胶原的光交联CS水凝胶复合物促骨再生的应用，胶原的加入能增大材料的压缩模量，减慢凝胶代谢速率，增强细胞黏附铺展增殖及BMSC成骨分化。

3. CS复合GP

生物可吸收性CS/GP复合物膜是在中性pH条件下通过溶液-凝胶转换形成，主要用于骨组织工程领域。Cui等[20]检测了该材料的结构、形态学特点及拉伸强度。傅氏转换红外线光谱分析仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）和X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析表明，CS和GP之间存在着化学连接。SEM分析显示单纯的CS膜表面光滑平坦，而CS/GP复合物表面粗糙多孔，且是一种全层孔隙状结构。孔隙大小和膜的厚度与GP的浓度成正比，这可能是因为GP浓度越大，材料的疏水作用和静电作用就越强。也就是说，这种CS/GP复合物生物膜比单纯的CS生物膜更利于细胞黏附生长及营养物质渗透。然而，CS基质中加入了GP后，拉伸强度下降；复合物膜的拉伸强度与基质中的GP浓度成反比。GP的成骨生物活性和中性温和的制备步骤（能允许生物活性因子掺入）使得CS/GP复合物膜成为骨再生良好的引导者，而不单纯是一种被动的屏障膜。

GP盐浓度较低时，带正电的CS链之间过大的静电斥力使得链与链之间不能通过疏水作用和氢键结合作用形成物理凝胶。所以，用于中和CS链正电荷密度的GP盐浓度有一个最低限度。Huang等[21]使用NaHCO₃作为缓冲液去中和CS水溶液，可将GP最低浓度从400 mmol·L⁻¹降低到135 mmol·L⁻¹。NaHCO₃并不与疏水的（-CH3）和亲氢键结合基团（-OH，-NH，-C=O）反应，而与CS溶液中的酸反应，代替部分GP中和CS溶液。CS/GP/NaHCO₃溶液在体温条件下15 min就能转换成水凝胶。同时，CS溶液中的HCl与NaHCO₃反应，释放CO₂，在CS水凝胶表面制造气泡。此外，本研究中，CCK-8结果及SEM检测显示CS/GP水凝胶抑制BMSC细胞活性和增殖，而CS/GP/NaHCO₃水凝胶能够促进细胞黏附及增殖，表明CS/GP/NaHCO₃比CS/GP水凝胶有更好的细胞相容性。这可能是由于CS/GP水凝胶中GP盐的浓度是CS/GP/NaHCO₃的2倍，培养基中过高的GP浓度会对细胞产生有害的离子作用。总之，适当降低GP浓度能够改善CS/GP水凝胶的细胞相容性。

4. CS复合金属元素（硅、锶、钛）

Lin等[22]通过UV聚合制备高强度聚（丙烯酸）-CS-二氧化硅水凝胶，纳米二氧化硅作为无机填料形成聚（丙烯酸）和CS之间的互穿网络。结果显示该水凝胶拥有良好的生物安全性。掺入生长因子和成骨细胞的水凝胶支架材料能够促进细胞迁移，进而用作骨缺损的替代材料。Zazakowny等[23]将TiO₂纳米颗粒引入到CS/水凝胶基质中以改善其机械性能及生物活性，并对其物理化学、机械和生物学性质进行了评估。结果发现，混合材料的表面比对应的水凝胶基质更亲水。体外细胞培养研究表明，材料具有生物相容性，能成功诱导磷灰石样结构形成。硫酸钙作为骨代用品，具有生物降解性、生物相容性，现已长期用于骨组织修复，但硫酸钙的高降解速率可能阻碍骨愈合。通过掺杂锶离子可改善硫酸钙的骨传导性能。Chen等[24]的研究开发了一种新型复合骨替代物，其由CS和锶掺杂的α-硫酸钙半水合物组成。该材料能够保证锶离子的持续释放，且具有最小的细胞毒性和抑制细菌生长的能力，有望用作骨科手术中的骨替代物。Tian等[25]将不同浓度的锶离子（Sr²⁺）负载到钛表面上制备成负载雷奈酸锶的壳聚糖钛膜，期望利用Sr²⁺增强骨愈合作用。XRD和FTIR观察表明，只有少数的雷奈酸锶通过氢键或共轭作用与CS发生化学反应。初始3 d内Sr²⁺释放浓度爆发至70%~85%，随后缓慢释放。低浓度（2或20 mmol·L⁻¹）条件下，Sr²⁺负载的CS膜促进原代成骨细胞增殖，高浓度（40、80 mmol·L⁻¹）条件下，其抑制原代成骨细胞生长。这些结果表明，钛表面雷奈酸锶负载的CS膜以剂量依赖的方式促进成骨细胞增殖和分化。

5. 其他

近年来，学者又开始尝试开发多种新型CS复合材料。Douglas等[26]将一种具有高氧亲和力的液态疏水全氟化合物加入到富含CS、β-GP和碱性磷酸酶的热敏注射水凝胶中。研究表明，全氟化合物浓度对该热敏水凝胶的物理化学性质（即凝胶速度、射线阻射性和均匀性）有显著影响。水凝胶胶体化速度随着全氟化合物浓度的增加而增加。碱性磷酸酶介导的和非碱性磷酸酶介导的组织矿化不受全氟化合物的不利影响，且该水凝胶能够促进人脂肪组织来源的间充质干细胞的生长。所以，可以认为加入氧化全氟化合物能够提高水凝胶作为骨再生材料的适用性。

具有免疫调节作用的半纤维素木聚糖与CS结合形成复合水凝胶可用于改善骨折愈合。与常规纯CS水凝胶相比，这种室温下为液体，生理温度下热响应为凝胶的可注射型水凝胶减轻了宿主动物的排斥反应。Bush等[27]将复合水凝胶置于皮下模型中，1周内复合水凝胶即被宿主组织代替，比CS水凝胶早得多。小鼠中的胫骨骨折模型显示，该复合物在不到4周的时间内就能促进骨折愈合。这些结果表明，木聚糖/CS复合水凝胶是合适的骨移植替代物，能够帮助修复大的骨缺损。Luca等[28]通过鼠的异位肌袋骨形成实验及兔子的半径15 mm的骨缺损修复实验比较了负载rhBMP-2的CS水凝胶和包含磷酸三钙的rhBMP-2/CS水凝胶的骨形成能力。结果发现，含有磷酸三钙的实验组矿化骨的形成明显高于其他组。然而，该实验组的骨缺损处由于材料复合物渗漏，8周后表现为不完全的骨再生。这表明该骨缺损修复的替代材料性能仍需改进。Ran等[29]通过使用新型原位沉淀法合成了CS-蚕丝素蛋白/HAP水凝胶。通过原位诱导蚕丝素蛋白在CS/HAP水凝胶中的构象转变，控制最终组合物的弹性模量和断裂强度。该复合材料的弹性模量范围为250~400 MPa，断裂强度范围为45~100 MPa。体外细胞培养表明CS-蚕丝素蛋白/HAP水凝胶上培养的MC3T3-E1细胞具有黏附、增殖和分化潜能，因此可认为该复合材料能够作为细胞培养和骨重建植入的理想支架。

综上所述，本文主要概述了CS分别与HAP、胶原、GP、金属元素等结合形成的复合支架材料在骨组织工程中的应用。学者们在研究CS支架多种复合方式的基础上，还进一步探究了支架的不同制备方法以及药物负载作用等。研究较多的CS复合支架制备方法有冻干法[30]、3D打印、静电纺丝[31]、盐浸法等[32]。近来，越来越多学者[33]–[35]将研究重点放在通过计算机辅助的逐层沉积方法精确制造骨组织工程支架材料的3D打印技术上。Demirtaş等[36]首次成功将CS复合材料溶液与细胞混合打印。与藻酸盐复合打印支架相比，CS打印支架的成骨效果更优。鉴于藻酸盐是应用最广泛的3D打印支架材料，CS在3D打印技术中的适用性和实用性也就得到了明确的证实。虽然3D打印技术制作的CS复合支架具有优良的机械性能、抗菌性能、骨传导性能[37]–[38]，能够在短时间内制作高精度的复杂结构[39]，但打印过程中细胞所受的高剪切应力及后续粗糙的打印步骤常导致细胞存活率大大降低，打印支架中的细胞负载仍然面临许多挑战[40]。Perez等[41]通过3D打印技术研制了一种含CS的核/壳结构的新型支架材料。支架的核心部分（由细胞相容性材料组成）用于负载细胞，外壳材料（高黏度）作为保护鞘，为整个支架提供机械强度。支架的设计同时保证了打印精度及负载细胞的活性，且支架的核心部分和壳部分均可负载生长因子，释放速率取决于核心部分组成及壳体厚度。当核和壳分别装载不同的生长因子时，能够实现生长因子的双重释放[41]。此外，目前的研究中，学者已将rhBMP-2及其衍生的合成寡肽[42]–[44]、基质细胞衍生因子-1α[45]等生长因子成功负载于CS支架材料中，实现药物的可控释放。

虽然本文已经对大量文献进行了综述，但在将材料用于临床试验之前，仍需进行进一步的研究，以开发具有生物安全性、最佳机械强度、新生骨组织能力的有效支架。CS复合支架为细胞的加载提供了合适的基础，包裹细胞的支架材料的构建将是未来更好的研究方向；而且，将生物活性药物分子和新开发的技术纳入支架制备过程，也能大大提升CS复合支架在骨组织工程领域的应用潜能[46]–[47]。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81570983）；高技术产业发展基金（2014G075）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81570983); High Technology Industrial Development (2014G075)