半乳糖凝集素-3基因在口腔鳞状细胞癌增殖、侵袭、凋亡中的作用及机制研究

Abstract

Objective

The effect and mechanism of Galectin-3 gene expression on proliferation, invasion, and apoptosis of oral squamous cell carcinoma (OSCC) were investigated.

Methods

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting were used to detect the mRNA and protein of Galectin-3 gene in OSCC. OSCC Tca8113 was divided into control, negative control, and Galectin-3 transfection groups. Western blotting was used to detect the expression of Galectin-3, matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, Cleaved Caspase-3, β-catenin, and Cyclin D1 protein after transfection for 48 h in each group. Cell proliferation was detected by CCK8. Cell invasion ability was detected by using a Transwell chamber. Cell apoptosis was detected by flow cytometry.

Results

The mRNA and protein expression levels of Galectin-3 gene in OSCC were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.01). Galectin-3 protein expression in Tca8113 cells significantly decreased after RNA interference. Cell survival rate and invasion as well as MMP-2, MMP-9, β-catenin, and Cyclin D1 protein expression were significantly lower than the blank group. Apoptosis rate and Cleaved Caspase-3 protein expression were significantly higher than the control group (P<0.01).

Conclusion

Inhibition of Galectin-3 gene expression in OSCC can significantly reduce the proliferation and invasion of cancer cells and induce apoptosis. The mechanism is related to downregulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway.

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）又称口腔鳞癌，是常见的发生于口腔颌面部的恶性肿瘤，约占口腔癌的80%以上。目前以综合治疗为主，但患者的5年生存率仍然很低，因此，寻找有效的治疗OSCC的方法及发病机制具有重要意义。半乳糖凝集素-3（Galectin-3）是半乳糖凝乳素家族中的一员，可与相应的配体结合影响细胞的生长、凋亡、分化、新生血管形成等过程，近些年在肿瘤中的作用受到广泛关注[2]。研究[1]显示，在多种肿瘤中Galectin-3基因呈现高表达，如肝癌、乳腺癌等，其表达加快了肿瘤的进展。有研究[2]指出，Galectin-3在OSCC中也呈现高表达，但其对癌细胞的生物学特性研究尚不清楚。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA引起的能使序列特异性基因发生沉默的现象，是一种新兴的在转录水平阻断基因的技术，具有高效性、特异性等特点，目前已应用于基因功能研究、肿瘤的基因治疗等的研究[3]–[4]中。本研究通过RNA干扰技术沉默OSCC中Galectin-3基因，观察细胞的增殖、侵袭、凋亡变化，并进一步检测其作用机制，为OSCC的防治提供新的靶点。

1. 材料和方法

1.1. 一般资料

收集郑州大学第一附属医院2013年6月–2015年1月OSCC及癌旁组织标本（距离肿瘤边缘2 cm以上）各44例，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，确诊为鳞状细胞癌。其中男性患者28例，女性患者16例，年龄30~77岁，平均年龄为56.5岁。所有患者术前均未行放疗和化疗，且有完整的临床资料。所有样品的采集经过患者和家属的知情同意及医院伦理委员会通过。人OSCC Tca8113购自中国科学院细胞库。

1.2. 主要试剂和仪器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培养基（Gibco公司，美国）；Transwell小室（Millipore公司，美国）；RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）；反转录试剂盒（Takara公司，日本）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、CCK8试剂盒、膜联蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙锭（propidium iodide，PI）试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3）、β-连环蛋白（β-catenin）、细胞周期素D1（Cyclin D1）抗体（Abcam公司，美国）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（Eppendorf公司，德国）；酶标仪、流式细胞仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.3. 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测Galectin-3基因在OSCC中的表达

RNA提取试剂盒提取OSCC及癌旁组织中的总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板实时荧光定量PCR仪对目的基因Galectin-3及内参基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）进行扩增。引物设计参照GenBank中的基因序列，利用Primer premier 6.0引物设计软件设计。引物序列如下，Galectin-3上游引物序列：5′-TACTGAAGGCCGTGGAC-3′，下游引物序列：5′-CCTCGTGGCTCCAGTACA-3′。GAPDH上游引物序列：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′，下游引物序列：5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。引物交由上海生工合成。PCR反应条件为：95 °C 5 min；95 °C 30 s；54 °C 30 s，72 °C 20 s，共40个循环。最后72 °C延伸15 min，4 °C保存。每个样品设置6个重复，根据Ct值利用2^−ΔΔCt法计算Galectin-3的mRNA相对表达量。

1.4. 细胞培养及转染

Tca8113细胞在37 °C、5%CO₂、95%饱和湿度的恒温培养箱中用含有10%FBS的RPMI1640细胞培养液传代培养。转染分为空白组（细胞未做任何处理）、阴性对照组（细胞转染无义siRNA序列）和Galectin-3转染组（细胞中转染Galectin-3的靶向siRNA序列）。转染前1 d以每毫升5×10⁵个细胞密度每孔中将生长至对数期的细胞2 mL接种至6孔细胞培养板中，细胞生长融合度在60%~70%时进行转染。按照Lipofectamine(tm)2000转染说明进行操作。

1.5. 蛋白质印迹（Western blotting）

提取OSCC和癌旁组织及上述转染48 h的3组细胞中的总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，每泳道30 µg蛋白样品用10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gele-lectrophoresis，SDS-PAGE）分离，电泳后转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉溶液封闭过夜，一抗孵育（Galectin-3、MMP-2、MMP-9、Cleaved Caspase-3、β-catenin、Cyclin D1抗体均按照1︰500稀释，GAPDH按照1︰1 000稀释），4 °C过夜，洗膜后加入1︰5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，增强型化学法（electrochemiluminescence，ECL）显色，显影，定影。

1.6. CCK8检测细胞增殖

将各组Tca8113细胞以浓度为每毫升1×10⁴个每孔100 µL接种至96孔细胞培养板中，每孔设置3个复孔，培养24 h进行同步化处理，分别于转染后48 h在每孔细胞中加入CCK8溶液10 µL，培养板置于培养箱内孵育2 h，酶标仪检测570 nm光密度（optical density，OD）值，实验重复3次。计算细胞增殖率。细胞增殖率=（转染组细胞OD /对照组细胞OD）×100%。

1.7. Transwell小室检测细胞侵袭

无血清RPMI1640培养基将4 °C融化后的Matrigel以1︰2比例稀释，取60 µL稀释后的胶均匀地铺在Transwell小室上层，37 °C、30 min使Matrigel聚合成胶，以每孔1×10⁴个将转染48 h的各组细胞接种于Transwell小室的上层，下室中加入含有10%FBS的RPMI1640细胞培养基，培养18 h，弃掉上室液体，用棉签擦掉上室未穿过的细胞，苏木精染色，封片。显微镜下拍照，随机选取6个不同的视野（×200），观察并记录穿膜的细胞数，求均值，实验重复3次。

1.8. 流式细胞术检测细胞凋亡

收集转染48 h的上述3组细胞，加入预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞，胰蛋白酶消化细胞，将细胞密度调整为每毫升1×10⁶个，根据细胞凋亡试剂盒的操作说明检测各组细胞的凋亡情况。

1.9. 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，各组间差异比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. Galectin-3基因在OSCC中的表达

以癌旁组织作为对照，RT-PCR和Western blot-ting分别检测Galectin-3基因在OSCC中的mRNA及蛋白表达（图1）。由图1可见，Galectin-3基因在癌旁组织及OSCC中的mRNA表达分别为0.880±0.165、4.949±0.221，蛋白表达分别为0.105±0.010、0.542±0.043， OSCC中Galectin-3 mRNA及蛋白表达均显著高于癌旁组织（t_mRNA=25.554，P_mRNA=0.000；t_蛋白=17.145，P_蛋白=0.000）。

图 1. Galectin-3基因在OSCC中的表达.

Fig 1 Expression of Galectin-3 gene in OSCC

上：Western blotting检测结果；下：RT-PCR检测结果。

2.2. 转染效果检测

各组细胞转染48 h后，Western blotting检测Galectin-3的蛋白表达，结果显示，空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组Galectin-3的蛋白表达分别为0.602±0.053、0.611±0.056、0.122±0.018，阴性对照组Galectin-3的蛋白表达与空白组差异无统计学意义（t=0.202，P=0.850），而Galectin-3转染组Galectin-3蛋白表达显著低于空白组（t=14.853，P=0.000）（图2）。

图 2. 转染效果检测.

Fig 2 Transfection effect detection

上：Western blotting检测各组细胞Galectin-3蛋白的表达；下：Galectin-3蛋白的相对表达量。A、B、C分别为空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组。

2.3. 抑制Galectin-3表达降低Tca8113细胞增殖

空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组细胞存活率分别为（98.12±3.65）%、（93.18±3.98）%、（62.13±5.41）%，阴性对照组细胞存活率与空白组差异无统计学意义（t=1.584，P=0.188），而Galectin-3转染组细胞存活率显著低于空白组（t=9.552，P=0.001）（图3）。

图 3. 抑制Galectin-3表达对Tca8113细胞增殖的影响.

Fig 3 The effect of inhibiting of Galectin-3 expression on the proliferation of Tca8113 cells

2.4. 抑制Galectin-3表达降低Tca8113细胞侵袭能力

Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力，Western blotting检测侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达，结果显示，空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组相对侵袭细胞分别为1.00±0.07、0.94±0.08、0.47±0.06，MMP-2的蛋白表达分别为0.511±0.042、0.514±0.043、0.139±0.021，MMP-9的蛋白表达分别为0.322±0.034、0.315±0.032、0.095±0.010，阴性对照组相对侵袭细胞以及MMP-2、MMP-9蛋白表达与空白组差异无统计学意义（t_侵袭=0.978，P_侵袭=0.384；t_MMP-2=0.086，P_MMP-2=0.935；t_MMP-9=0.260，P_MMP-9=0.808），而Galectin-3转染组相对侵袭细胞及MMP-2、MMP-9蛋白表达均显著低于空白组（t_侵袭=9.957，P_侵袭=0.001；t_MMP-2=13.721，P_MMP-2=0.000；t_MMP-9=11.094，P_MMP-9=0.000）（图4、5）。

图 4. Transwell小室检测抑制Galectin-3表达对Tca8113细胞侵袭能力的影响 HE × 200.

Fig 4 Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of Tca8113 cells after Galectin-3 expression was inhibited HE × 200

左：空白组；中：阴性对照组；右：Galectin-3转染组。

图 5. 抑制Galectin-3表达对Tca8113细胞侵袭能力的影响.

Fig 5 The effect of inhibiting of Galectin-3 expression on invasion of Tca8113 cells

左：Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力；中：Western blotting检测MMP-2、MMP-9蛋白表达；右：MMP-2、MMP-9的蛋白相对表达量。A、B、C分别为空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组。

2.5. 抑制Galectin-3表达诱导Tca8113细胞凋亡

空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组细胞凋亡率分别为（2.11±0.56）%、（2.16±0.60）%、（17.83±1.23）%，阴性对照组细胞凋亡率与空白组差异无统计学意义（t=0.106，P=0.921），而Galectin-3转染组细胞凋亡率显著高于空白组（t=20.147，P=0.000）（图6）。

图 6. 抑制Galectin-3表达对Tca8113细胞凋亡的影响.

Fig 6 The effect of inhibiting of Galectin-3 expression on the apoptosis of Tca8113 cells

左：流式细胞仪检测结果；右：各组细胞凋亡率。A、B、C分别为空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组。

2.6. 抑制Galectin-3表达对Cleaved Caspase-3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的影响

Western blotting检测各组细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3及Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达（图7）。

图 7. 抑制Galectin-3表达对Cleaved Caspase-3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的影响.

Fig 7 The effect of inhibiting of Galectin-3 expression on Cleaved Caspase-3, β-catenin and Cyclin D1 protein expression

上：Western blotting检测结果；下：蛋白的相对表达量。A、B、C分别为空白组、阴性对照组、Galectin-3转染组。

空白组、阴性对照组、Galectin-3转染Cleaved Caspase-3蛋白表达分别为0.031±0.009、0.029±0.008、0.147±0.018，β-catenin蛋白表达分别为0.483±0.039、0.475±0.041、0.098±0.011，Cyclin D1蛋白表达分别为0.267±0.026、0.260±0.025、0.122±0.017，阴性对照组Cleaved Caspase-3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与空白组差异无统计学意义（t_{Cleaved Caspase-3}=0.288，P_{Cleaved Caspase-3}=0.788；t_β-catenin=0.245，P_β-catenin=0.819；t_{Cyclin D1}=0.336，P_{Cyclin D1}=0.754），而Galectin-3转染组Cleaved Caspase-3蛋白表达高于空白组（t_{Cleaved Caspase-3}=9.984，P_{Cleaved Caspase-3}=0.001），β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于空白组（t_β-catenin=16.456，P_β-catenin=0.000；t_{Cyclin D1}=8.085，P_{Cyclin D1}=0.001）。

3. 讨论

目前，OSCC的治疗仍处于探索阶段，常用的治疗方法难以彻底根除，且近些年的统计结果显示该病的发生有年轻化的趋势[5]。因此，深入探究该病的发病机制以及揭示其生物学特性对于临床治疗和预后有重要意义。半乳糖凝集素（Galectin）是生物体内一种能特异地识别半乳糖配体而发挥作用的糖蛋白，Galectin-3是半乳糖凝集素家族中研究最多的一员。Galectin-3定位于人类染色体14q21~22，在正常细胞及肿瘤细胞的细胞膜、细胞质中广泛存在，参与前体mRNA的剪切及细胞的增殖、凋亡、侵袭、黏附等的调节，与肿瘤的发生也存在密切联系[6]。研究[7]发现，在多种肿瘤中Galectin-3呈现高表达，其表达影响肿瘤进展、转移、浸润、复发等过程。也有研究[8]指出，在胃癌、膀胱癌等肿瘤细胞中抑制Galectin-3的表达后细胞的增殖能力降低，凋亡增加。目前Galectin-3对OSCC的生物学特性的影响还不清楚。

本研究中通过RNA干扰技术沉默OSCC中Galectin-3基因的表达，结果显示，细胞的增殖及侵袭能力显著降低，凋亡显著增加。Cleaved Caspase-3蛋白显著上调表达，MMP-2和MMP-9蛋白显著下调表达。恶性肿瘤的侵袭是由多步骤、多阶段控制的复杂过程，在侵袭过程中，细胞外的基质降解是侵袭的关键，MMPs是重要的蛋白水解酶家族，可使细胞外的基质及基膜中的大多数蛋白质降解，正常情况下在组织中以平衡状态存在，而在肿瘤中平衡被打破，表达增强，降解细胞外的基质，进而增强细胞的转移、侵袭能力[9]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族最重要的两种蛋白水解酶，在多种肿瘤细胞中均可检测到其表达的升高[10]。研究[11]显示，在OSCC中MMP-2和MMP-9也呈现高表达，抑制其表达可降低癌细胞的侵袭能力。Caspase家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Caspase-3是Caspase家族的关键酶和效应蛋白，当细胞凋亡启动后才被激活，活化的Caspase-3将使凋亡进入不可逆阶段，也被称为“凋亡执行者”，目前Caspase-3可作为检测多种肿瘤细胞凋亡的指标[12]。

Wnt/β-catenin信号通路是一条经典的Wnt信号通路，在进化上相对保守，由Wnt蛋白、核内转录因子、跨膜受体胞质蛋白和下游的靶基因组成，在肿瘤中的作用受到广泛关注[13]。研究[14]显示，肝癌、OSCC中Wnt/β-catenin信号通路处于异常激活状态，而抑制其表达后可显著降低癌细胞的发生及发展，激活反之。β-catenin是Wnt信号通路的核心原件，当有Wnt信号刺激时，可以导致β-catenin的大量聚集并进入细胞核，最终激活和启动下游的cyclin D1、c-myc基因的表达，从而影响肿瘤的发生发展。本研究结果显示，抑制OSCC中Galectin-3基因表达后β-catenin、Cyclin D1蛋白均显著下调表达。

综上所述，本研究利用RNA干扰技术抑制OSCC中Galectin-3基因表达，发现能通过下调Wnt/β-catenin信号通路降低癌细胞的增殖及侵袭能力，促进细胞的凋亡。通过本研究证明Galectin-3在OSCC的发生及发展中发挥作用，为该病的分子诊断及靶向治疗提供了一定的理论依据和新的方向。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（8140100298）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (8140100298)