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. 2020 Mar 13;18:eAO5022. doi: 10.31744/einstein_journal/2020AO5022
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Reduction of oxidative stress improves insulin signaling in cardiac tissue of obese mice

Matheus Scarpatto Rodrigues 1, Bruno Luiz da Silva Pieri 1, Gustavo de Bem Silveira 1, Rubya Pereira Zaccaron 1, Ligia Milanez Venturini 1, Vitor Hugo Comin 1, Karine Damian Luiz 1, Paulo Cesar Lock Silveira 1
PMCID: PMC7069732  PMID: 32215468

ABSTRACT

Objective

To evaluate the effects of oxidative stress on insulin signaling in cardiac tissue of obese mice.

Methods

Thirty Swiss mice were equally divided (n=10) into three groups: Control Group, Obese Group, and Obese Group Treated with N-acetylcysteine. After obesity and insulin resistance were established, the obese mice were treated with N-acetylcysteine at a dose of 50mg/kg daily for 15 days via oral gavage.

Results

Higher blood glucose levels and nitrite and carbonyl contents, and lower protein levels of glutathione peroxidase and phosphorylated protein kinase B were observed in the obese group when compared with their respective control. On the other hand, treatment with N-acetylcysteine was effective in reducing blood glucose levels and nitrite and carbonyl contents, and significantly increased protein levels of glutathione peroxidase and phosphorylated protein kinase B compared to the Obese Group.

Conclusion

Obesity and/or a high-lipid diet may result in oxidative stress and insulin resistance in the heart tissue of obese mice, and the use of N-acetylcysteine as a methodological and therapeutic strategy suggested there is a relation between them.

Keywords: Obesity, Insulin resistance, Oxidative stress, Myocardium, Mice

INTRODUCTION

Obesity is a worldwide and multiethnic public health problem, which affects men and women of all age groups and social classes. ( 1 , 2 ) Epidemiological data reinforce the prevalence of this condition in the world population. According to a survey by the World Health Organization (WHO) from 2016, over 1.9 billion adults suffered from excessive weight, 650 million of whom were obese. ( 3 ) Obesity causes important pathophysiological alterations, such as type 2 diabetes mellitus , insulin resistance, ( 4 ) and cardiovascular diseases and their associated clinical complications. ( 5 )

Several strategies have been used to experimentally study obesity, especially the model of induction through a high fat diet (hyperlipid diet). ( 6 , 7 ) Mice that underwent such diet presented significant cardiac problems, such as myocardial fibrosis, cardiomyocyte hypertrophy, and a decreased contractile capacity of the heart. ( 8 ) Obese mice presented deficits in glucose uptake and a reduction of insulin sensitivity in the myocardium. ( 9 )

There may be several mechanisms involved in the occurrence of insulin resistance in the heart, and an elevated oxidative stress may be one of them. Animals treated with the hyperlipidic diet present an overproduction of reactive oxygen species (ROS) in the liver and adipose tissue. ( 10 ) The myocardium of mice that are obese due to a high fat diet present an increase in oxidative stress. ( 11 ) However, the studies are not conclusive and warrant further investigation.

Strategically, the use of a classic antioxidant could better demonstrate the relation between oxidative stress and insulin action and be very valuable. Therefore, N-acetylcysteine (NAC), a non-enzymatic antioxidant derived from the amino acid cysteine, with the chemical formula C 5 H 9 NO 3 S and molecular weight of 163.2kDa, ( 12 ) is a substance that, due to its antioxidant action, can be experimentally used to better demonstrate this relation.

N-acetylcysteine is a compound often employed in clinical practice as a mucolytic agent to treat paracetamol overdoses and prevent free radical generation by toxic substances. ( 13 ) Its antioxidant activity is related mainly to the reduction of the extracellular amino acid cystine into the intracellular amino acid cysteine, and to the donation of thiol groups to reduced glutathione. ( 14 ) Moreover, NAC can promote the direct neutralization of ROS as the radical hydroxyl and hypochlorous acid, thus preventing the occurrence of oxidative stress and its possible consequences over insulin resistance. ( 15 )

OBJECTIVE

To analyze the increase of oxidative stress and insulin resistance in the myocardium of mice that are obese from a high fat diet. When such an increase is confirmed, the objective is to analyze if the use of N-acetylcysteine shows a causal relation between such mechanisms.

METHODS

Ethnic aspects and animal characterization

This study used thirty 45-day-old male Swiss mice from the Animal Research Lab at UNESC. The mice were initially divided into two groups: 10 animals fed with the standard diet for rodents (Control Group) and the remaining 20 animals fed a high-fat diet, after obesity and insulin resistance were proven, were subdivided into two other experimental groups: Obese Group (n=10) and Obese Group Treated with N-acetylcysteine (n=10). All animals were kept in a 12-hour light/dark cycle, an environment with 70% humidity and temperature between 20°C and 22°C, in polyurethane cages with metallic covers (one animal per box) and fed during 12 weeks with standard feed (carbohydrate: 70%; protein: 20%; fat: 10%; total of 3.8kcal/g) or high-fat feed (carbohydrate: 38.5%; protein: 15%; fat: 46.5%; total of 5.4kcal/g) and water ad libitum.

This study was evaluated and approved by the Animal Ethics Committee (AEC) of the Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), protocol 042/2016-2. All experiments strictly abided by the ethical principles of experimentation with animals.

Treating the animals with the antioxidant N-acetylcysteine

After obesity and insulin resistance had been induced, the animals who had previously received the high-fat diet were subdivided into two groups: Group OB, obese mice who were given the high-fat diet (n=10); and Group OB + NAC, obese mice treated with NAC for 15 days (n=10). It is worth mentioning that the animals in the latter group only received the antioxidant therapy after obesity and insulin resistance had been duly confirmed through evaluations conducted after three months of the animals being exposed to the high fat diet. N-acetylcysteine was administered once a day though oral gavage (50mg/kg) for 15 days. The study was conducted in February and March 2017. The full duration of the experimental protocol (experimental period) was 14 weeks and 1 day. After 24 hours of the last administration of NAC, the animals were euthanized, and the heart was extracted so that the biochemical techniques could be performed.

Fasting blood glucose

The test was done at the end of the experimental period. Food was removed 6 hours prior to the test. Blood glucose was measured using a glucometer and results were expressed as mg/dL.

Insulin tolerance test

The insulin tolerance test was conducted before the antioxidant administration and after the experimental period. The food was removed 6 hours prior to the test, and the first blood withdrawal corresponded to time zero. After that, insulin (2U/kg of body weight) was injected intraperitoneally, and blood samples were collected from the tail at 5, 10, 15, 20, 25, and 30 minutes. Blood glucose was determined by a glucometer. The speed of the glucose decay constant (K RI ) was calculated through the formula 0.693/t 1/2 . The t 1/2 of glucose was calculated from the curve of the analysis of the least squares of the concentration of serum glucose, during the phase of linear decay. This test was done to confirm insulin resistance induction in the obese mice and verify a possible improvement in the treated animals.

Western blotting

After 24 hours of the last NAC administration, the animals were euthanized, and the cardiac apex was extracted and immediately homogenized in a specific buffer with protease and phosphatase inhibitors. The total protein concentration was determined according to the method by Bradford et al. ( 16 ) The proteins were resuspended and preserved in Laemmli buffer with 100mmol/L of dithiothreitol (DTT), ( 17 ) and immunoblotting was determined with specific antibodies. For that, aliquots with 250µg of protein per sample were applied over polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and were later transferred to nitrocellulose membranes via electrophoresis. After that, the membranes were incubated with specific primary antibodies anti-pAKT, glutathione peroxidase (GPx) and beta-actin acquired from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA) under constant agitation and overnight at 4°C. Later, the membranes were incubated in a solution with peroxidase conjugated secondary antibody for 2 hours, at room temperature. After that, the membranes were incubated for 2 minutes in an enzyme substrate and exposed to the X-Ray film on a radiographic development cassette. The intensity of the bands was determined through the reading of the developed radiographs through optic densitometry, with a scanner (HP G2710) and the software ImageJ.

Dichlorohydrofluorescein

The oxidation of the 2’7’ dichlorohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) through the cells causes difluorescein fluorescence (DCF), which can easily be read in a spectrophotometer. In this essay, 100µL of water and 75µL of DCFH-DA were added to 25µL of sample homogenate, homogenized in vortex and taken into a water bath at 37°C in the dark, for 30 minutes. Separately, a calibration curve was prepared, which used as a standard the DCFH-DA 0.1µM diluted in phosphate buffer/EDTA at pH 7.4 in different concentrations. The samples and the calibration curve were processed in duplicate and protected from light. After 30 minutes, the results were read in the spectrophotometer (525nm excitation and 488nm emission) and results were expressed in nmol of DCF per mg of protein. ( 18 )

Nitric oxide formation indicator

To measure the nitrite content, the samples were incubated with Griess reagent (1% sulfanilamide and 0.1% of N-1 (naphthyl) ethylenediamine) at room temperature, for 10 minutes and absorbance was measured at 540nm. Nitrite content was calculated with base on a standard curve from 0 to 100nM performed with the metabolite sodium nitrite (NaNO2). Results were calculated in µmol nitrite/mg protein. ( 19 )

Protein carbonylation

The carbonyl content was determined spectrophotometrically at 370nm as previously described by Levine et al. ( 20 ) The results were calculated as nmol/mg of protein using the molar extinction coefficient of dinitrophenylhydrazones of 22.000M -1 cm -1 .

Statistical analysis

Results were expressed as mean±standard deviation and analyzed statistically through the variance analysis (ANOVA) follow by the Bonferroni post hoc test. Statistical significance was set at p<0.05. Statistical analyses were done through the software GraphPad Prism ® (version 5.00) for Microsoft Windows ® .

RESULTS

Body weight and fasting blood glucose

The evaluation of the effects of the NAC supplementation over the body weight, fasting blood glucose and insulin tolerance in obese mice is shown in figure 1 . As expected, the high-fat diet was efficient in increasing the body weight of the mice and administering the antioxidant NAC did not alter this parameter, which remained significantly elevated in relation to the Control Group ( Figure 1A ). The fasting blood glucose levels of the obese mice were higher compared to the Control Group. NAC administration reduced the fasting blood glucose levels in the Group Treated with NAC in relation to the non-treated Obese Group ( Figure 1B ).

Figure 1. Effects of the supplementation with N-acetylcysteine on body weight, fasting glucose and insulin tolerance in obese mice.

Figure 1

* p<0.05 versus Control Group; p<0.05 versus Obese Group.

NAC: Obese Group Treated with N-acetylcysteine; KRI: speed of the glucose decay constant.

Insulin tolerance test

To evaluate insulin sensitivity among the studied groups, the glucose decay constant (K RI ) was used. Obesity significantly reduced the K RI values in comparison to the Control Group. On the other hand, the treatment with the antioxidant NAC significantly reverted this effect ( Figure 1C ).

Production of reactive species in the cardiac tissue

The effects of the antioxidant NAC on the production of reactive species through the techniques DCF and nitric oxide (NO,) and on the oxidative damage over the cardiac tissue of obese mice, are better illustrated in figure 2 . No difference between the three groups was found regarding the levels of DCF ( Figure 2A ). However, there was an increase in nitrite levels in the Obese Group, and a reduction in nitrite levels when the Obese Group received NAC ( Figure 2B ).

Figure 2. Effects of the administration of N-acetylcysteine on the levels of dichlorofluorescein, nitrite and carbonyl on the cardiac tissue of obese mice.

Figure 2

* p<0.05 versus Control Group; p<0.05 versus Obese Group.

DCFH: dichlorohydrofluorescein; NAC: Obese Group Treated with N-acetylcysteine.

Antioxidant defense and oxidative damage

Carbonyl was evaluated as a marker for oxidative damage. There was an increase in protein carbonylation in the Obese Group in comparison to the Control Group. The use of NAC significantly reduced this parameter ( Figure 2C ). Similar results were observed in the analysis of the expression of GPx. The protein levels of GPx were not significantly altered in the Obese Group. However, the administration of the antioxidant NAC significantly elevated the protein levels of this enzyme ( Figure 3 ).

Figure 3. Effects of the administration of N-acetylcysteine on the protein levels of glutathione peroxidase in the cardiac tissue of obese mice.

Figure 3

* p<0.05 versus Obese Group.

GPx: glutathione peroxidase; NAC: Obese Group Treated with N-acetylcysteine.

Effects of N-acetylcysteine on insulin signaling

Evaluations were conducted on the protein levels of phosphorylated Akt, as a marker of the insulin transduction pathway. The results showed that obesity significantly reduced the protein levels of Akt phosphorylation in comparison to the Control Group. On the other hand, treatment with NAC was effective in elevating phosphorylated Akt levels in the cardiac tissue to values similar to the Control Group ( Figure 4 ).

Figure 4. Effects of the administration of N-acetylcysteine on the protein levels of phosphorylated protein kinase B in the cardiac tissue of obese mice.

Figure 4

* p<0.05 versus Control Group; p<0.05 versus Obese Group.

pAKT: phosphorylated protein kinase B; NAC: Obese Group Treated with N-acetylcysteine.

DISCUSSION

This study investigated oxidative stress and its influence on insulin signaling in the myocardium of obese mice. Methodologically, the option chosen to achieve that was to treat the animals with the antioxidant NAC.

Our results show that the treatment with NAC was able to mitigate the production of reactive species, decrease the oxidative damage to the proteins, elevate the protein levels of GPx and alter the phosphorylation on the Akt protein (a crucial protein involved in insulin signaling). These results suggest that, with obesity, there is an increase in oxidative stress, which can affect insulin cell signaling, at least in the myocardium of obese mice.

We used the high-fat diet as a model to induce obesity. ( 21 ) In this study, the high fat diet was efficient in elevating the body weight in the Obese Group. The administration of the antioxidant NAC did not significantly alter the body weight of these animals. On the other hand, when NAC was administered concomitantly to the high fat diet, Ma et al., ( 22 ) observed a reduction in body weight of the Group Treated with NAC, as compared to the non-treated obese group.

Obese animals presented higher levels of fasting blood glucose in comparison to the Control Group. The increase in fasting blood glucose in obese animals suggested the induction of resistance to insulin. When insulin tolerance was tested, we saw that insulin sensitivity was significantly decreased in the Obese Group. It was interesting that, when supplemented with NAC, there was a reduction in the fasting blood glucose and an increase in insulin sensitivity. Zheng et al. ( 23 ) administered NAC orally in the drinking water for 5 months showed similar results. Obese mice that received NAC for 5 months had an improvement in fasting blood glucose and higher glucose tolerance, which reinforces the involvement of oxidative stress in the pathophysiology of insulin resistance.

Zafirovic et al., ( 24 ) showed that obesity, in addition to hindering glucose uptake and insulin signaling in the heart, elevates the production of NO in the heart through the increase in the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) ( 24 ) Nitric oxide is an important vasodilator and directly influences cardiac contractility. ( 25 ) However, from a biochemical point of view, NO can react with the superoxide anion, preventing it from being dismuted by superoxide dismutase (SOD) in H 2 O 2 . In this study, although no significant alterations were observed in the DCFH level, there was an increase in the reactive species of the Obese Group (at least nitrogen), and NAC administration reduced these parameters.

Due to NO ability to react with the superoxide anion, there is a detour in the reaction, which favors the productions of nitrite peroxide through NO, and the formation of H 2 O 2 decreases (the main reagent in the dichlorohydrofluorescence technique). Therefore, it is possible that the maintenance of DCFH levels happens exactly because of this detour in the reaction, caused by the increase of NO. In addition, although the activity of direct neutralization of NAC reactive species (scavenger) is significantly lower than the action of antioxidant enzymes, such as SOD, catalase, and GPx, NAC can also have this function and prevent the development of oxidative stress. ( 15 )

The increase of reactive species is related to the oxidative damage to proteins, lipids, and nucleic acids. To find out if obesity is related to an increase in protein damage, we evaluated the carbonyl content in the cardiac tissue, which was elevated in the Obese Group. When analyzing the cardiac tissue of obese mice, Li et al., ( 26 ) showed that obesity causes an increase of oxidative damage to proteins. ( 26 ) According to Guo et al., ( 27 ) obesity can significantly elevate the expression of subunits of the complex nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH oxidase), the main ROS generator in the cardiac tissue. ( 27 ) By using NAC, these authors observed a lower translocation of the subunit p67 to the membrane and concluded that NAC administration reduces damage to protein by reducing NADPH oxidase activity in the cardiac tissue of obese rats.

In this study, protein levels were evaluated as indicators of antioxidant activity. Obesity reduced the protein levels of GPx, although not significantly. Treatment with NAC was able to elevate the protein levels of this enzyme. According to Lavoie et al., ( 28 ) the oral administration of NAC increases cysteine levels and, consequently, elevates the levels of reduced glutathione (GSH), a tripeptide composed by glycine, glutamyl and cysteine group. ( 14 , 15 ) While studying the antioxidant defense system in obese animals, Whiting et al., ( 29 ) observed an increase in the production of free radicals in obese hyperglycemic rats, which was related to lower levels of plasma and erythrocyte GPx. ( 29 ) In addition, a study conducted by Ballal et al., ( 30 ) showed reduced levels of GPx in the cardiac tissue of obese rats. ( 30 ) Some studies have shown that an increase in oxidative stress can hinder insulin signaling. ( 31 - 33 ) However, there is also a study showing the increase of ROS can elevate insulin sensitivity. ( 34 ) These contradictory findings in the literature suggest the relation between oxidative stress and insulin sensitivity is not yet clear and warrants further investigation.

In this study, by using the phosphorylation of Akt as a marker of insulin signaling, it was possible to observe that obesity significantly reduced Akt expression in the cardiac tissue of obese mice. By studying the myocardium of rodents, DeBosch et al., ( 35 ) and Shiojima et al., ( 36 ) reported that Akt activity can be regulated by insulin, by the nutritional status, and by the redox state. Using Akt phosphorylation as a myocardium marker for insulin resistance, Whaley-Connell et al., ( 37 ) reported that the production of oxidants is inversely associated to insulin sensitivity. ( 37 ) In order to verify this information, the obese mice were given NAC, which significantly elevated pAKT expression in relation to the Obese Group. Although the exact mechanism of how this occurs is not clear in the literature, it is believed that the increase in the inflammatory process, which is very present in obesity, can increase oxidative stress and hinder insulin signaling in the heart, and this correlation is reinforced in this study through the administration of the antioxidant NAC.

CONCLUSION

Our results suggested that obesity and/or a high fat diet lead to oxidative stress and resistance to insulin in the cardiac tissue of obese mice. The use of N-acetylcysteine as a methodological and therapeutic strategy suggests a relation between them. However, further studies are necessary to evaluate the cause-effect relation between oxidative stress and resistance to insulin and the possible resulting physiological alterations.

ACKNOWLEDGMENTS

This study received financial support from the Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), through its research incentive and support fund. We are also grateful to the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and the National Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for payment of human resources involved in this study, by means of grants for research mentorship, master's and doctorate degrees.

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Einstein (Sao Paulo). 2020 Mar 13;18:eAO5022. [Article in Portuguese]

Redução do estresse oxidativo melhora a sinalização da insulina em tecido cardíaco de camundongos obesos

Matheus Scarpatto Rodrigues 1, Bruno Luiz da Silva Pieri 1, Gustavo de Bem Silveira 1, Rubya Pereira Zaccaron 1, Ligia Milanez Venturini 1, Vitor Hugo Comin 1, Karine Damian Luiz 1, Paulo Cesar Lock Silveira 1

RESUMO

Objetivo

Avaliar os efeitos do estresse oxidativo sobre a sinalização da insulina em tecido cardíaco de camundongos obesos.

Métodos

Utilizaram-se 30 camundongos Swiss subdivididos igualmente (n=10) em três grupos: Grupo Controle, Grupo Obeso e Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína. Após estabelecidas a obesidade e a resistência à insulina, os camundongos obesos foram tratados diariamente, durante 15 dias, via gavagem oral, com N-acetilcisteína na dose de 50mg/kg.

Resultados

Observaram-se maiores níveis de glicose sanguínea, conteúdos de nitrito e carbonil, e menores níveis proteicos de glutationa peroxidase e proteína quinase B fosforilada no Grupo Obeso quando comparado a seu respectivo controle. Por outro lado, o tratamento com N-acetilcisteína se mostrou eficiente em diminuir os níveis glicêmicos, os conteúdos de nitrito e carbonil, e aumentar significativamente os níveis proteicos de glutationa peroxidase e proteína quinase B fosforilada, quando comparados ao Grupo Obeso.

Conclusão

Obesidade e/ou dieta hiperlipídica levam a estresse oxidativo e à resistência à insulina no tecido cardíaco de camundongos obesos, e o uso da N-acetilcisteína como estratégia metodológica e terapêutica sugeriu haver relação entre ambos.

Keywords: Obesidade, Resistência à insulina, Estresse oxidativo, Miocárdio, Camundongos

INTRODUÇÃO

A obesidade é um problema de saúde pública mundial e multiétnico, que acomete homens e mulheres de todas as faixas etárias e classes sociais.( 1 , 2 )Dados epidemiológicos reforçam a prevalência desta patologia na população mundial. Segundo levantamento da Organização Mundial da Saúde (OMS), realizado em 2016, mais de 1,9 bilhão de adultos sofriam com o sobrepeso, sendo obesos 650 milhões destes.( 3 )Com a obesidade, surgem alterações fisiopatológicas importantes, como o diabetes mellitus do tipo 2, a resistência à insulina,( 4 )além de doenças cardiovasculares e complicações clínicas associadas.( 5 )

Várias estratégias têm sido utilizadas para se estudar experimentalmente a obesidade, com destaque para o modelo de indução por dieta rica em gordura (dieta hiperlipídica).( 6 , 7 )Camundongos alimentados com tal dieta apresentaram problemas cardíacos significativos, como fibrose do miocárdio, hipertrofia de cardiomiócitos e diminuição da capacidade contrátil do coração.( 8 )Camundongos obesos apresentam prejuízos nas captações de glicose e redução da sensibilidade à insulina no miocárdio.( 9 )

Vários mecanismos podem estar envolvidos na instalação da resistência à insulina neste órgão, e o elevado estresse oxidativo pode ser um deles. Animais tratados com dieta hiperlipídica apresentam superprodução de espécies reativas do oxigênio (ERO) no fígado e no tecido adiposo.( 10 )O miocárdio de camundongos obesos por dieta rica em gordura apresenta aumento de estresse oxidativo.( 11 )No entanto, os estudos não são conclusivos e merecem maiores investigações.

Estrategicamente, o uso de um clássico antioxidante poderia melhor demonstrar a relação estresse oxidativo e ação da insulina, e ser de grande valia. Sendo assim, o N-acetilcisteína (NAC), um antioxidante não enzimático derivado do aminoácido cisteína, de fórmula química C5H9NO3S e peso molecular 163,2kDa,( 12 )é uma substância que, devido a sua ação antioxidante, pode ser utilizada experimentalmente para melhor demonstrar esta relação.

O NAC é um composto muito empregado na prática clínica como agente mucolítico, para o tratamento de overdoses de paracetamol e prevenção de geração de radicais livres por substâncias tóxicas.( 13 )Sua atividade antioxidante está relacionada principalmente à redução do aminoácido extracelular cistina ao aminoácido intracelular cisteína, e à doação de grupamentos tiol para a glutationa reduzida.( 14 )Além disso, o NAC pode promover a neutralização direta de ERO como o radical hidroxila e o ácido hipocloroso, prevenindo a instalação do estresse oxidativo e suas possíveis consequências sobre resistência à insulina.( 15 )

OBJETIVO

Analisar o aumento de estresse oxidativo e resistência à insulina em miocárdio de camundongos obesos por dieta rica em gordura. Em caso de resposta positiva, analisar se o uso do N-acetilcisteína mostra alguma relação causal entre tais mecanismos.

MÉTODOS

Aspectos étnicos e caracterização dos animais

Foram utilizados, neste estudo, 30 camundongos Swiss machos com 45 dias de vida, provenientes do Centro de Bioterismo da UNESC, divididos inicialmente em dois grupos: 10 animais alimentados com dieta padrão para roedores (Grupo Controle) e os demais 20 animais alimentados com dieta hiperlipídica, após comprovada a obesidade e a resistência a insulina, foram subdivididos em dois outros grupos experimentais: Grupo Obeso (n=10) e Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína (n=10). Todos os animais foram mantidos em ciclos de 12 horas claro/escuro, ambiente com 70% de umidade e temperatura entre 20°C e 22°C, alojados em gaiolas de poliuretano com cobertura metálica (um animal por caixa), e alimentados por 12 semanas com ração padrão (carboidrato: 70%; proteína: 20%; gordura: 10%; totalizando 3,8kcal/g) ou ração hiperlipídica (carboidrato: 38,5%; proteína: 15%; gordura: 46,5%; totalizando 5,4kcal/g) para roedores e água ad libitum .

Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), protocolo 042/2016-2. Todos os experimentos respeitaram estritamente os princípios éticos da experimentação animal.

Tratamento dos animais com antioxidante N-acetilcisteína

Após a instalação da obesidade e da resistência à insulina, os animais que receberam previamente a dieta hiperlipídica foram subdivididos em dois grupos: Grupo OB, grupo de obesos alimentados com dieta hiperlipídica (n=10), e Grupo OB + NAC, grupo de obeso tratado durante 15 dias com N-acetilcisteína (n=10). Vale ressaltar que os animais deste último grupo só receberam a terapia antioxidante após a devida comprovação da obesidade e da resistência à insulina, cujas avaliações foram devidamente realizadas após três meses de exposição dos animais à dieta rica em gordura. A NAC foi administrada uma vez ao dia, via gavagem oral (50mg/kg), durante 15 dias. O estudo foi realizado nos meses de fevereiro e março de 2017. Ao todo, a duração do protocolo experimental (período experimental) foi de 14 semanas e 1 dia. Depois de 24 horas da última administração da NAC, os animais foram eutanasiados, e o coração foi extraído, para posterior realização das técnicas bioquímicas.

Glicemia em jejum

O teste foi realizado ao final do período experimental. A alimentação foi retirada 6 horas antes do teste. A dosagem da glicose sanguínea foi feita por meio de glicosímetro, e os resultados foram expressos em mg/dL.

Teste de tolerância à insulina

O teste de tolerância à insulina foi realizado antes do início da administração de antioxidante e ao final do período experimental. O alimento foi retirado 6 horas antes do teste, e a primeira coleta sanguínea equivale ao tempo zero. Após isso, a insulina (2U/kg de peso corporal) foi injetada intraperitonealmente, e amostras de sangue foram coletadas pela cauda nos tempos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos, sendo a determinação da glicemia realizada com um glicosímetro. A velocidade constante do decaimento da glicose (KRI) foi calculada usando a fórmula 0,693/t1/2. O t1/2da glicose foi calculado a partir da curva da análise dos mínimos quadrados da concentração da glicose sérica, durante a fase de decaimento linear. Esse teste foi realizado para comprovação da instalação da resistência à insulina nos camundongos obesos e verificar possível melhora nos animais tratados.

Western blotting

Após 24 horas da última administração de NAC, os animais sofreram eutanásia, e o ápice cardíaco foi extraído e imediatamente homogeneizado em tampão específico, contendo inibidores de proteases e fosfatases. A concentração de proteínas totais fora determinada segundo método de Bradford et al.( 16 )As proteínas foram ressuspensas e conservadas em tampão Laemmli, contendo 100mmol/L de ditiotreitol (DTT),( 17 )e realizou-se a determinação do immunoblotting com anticorpos específicos. Para isso, alíquotas contendo 250µg de proteína por amostra foram aplicadas sobre gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e, posteriormente, foram transferidas para membranas de nitrocelulose via eletroforese. A seguir, as membranas foram incubadas com anticorpos primários específicos anti-pAKT, glutationa peroxidase (GPx) e beta-actina adquiridos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA), sob agitação constante, durante a noite, a 4°C. Posteriormente, as membranas foram incubadas em solução com anticorpo secundário conjugado com peroxidase, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Após, as membranas foram incubadas por 2 minutos em substrato enzimático e expostas ao filme de raios X em cassete de revelação radiográfica. A intensidade das bandas foi determinada por meio da leitura das radiografias reveladas por densitometria ótica, utilizando um scanner (HP G2710) e o programa ImageJ.

Diclorohidrofluoresceína

A oxidação do 2’7’diacetato de diclorohidrofluoresceína (DCFH-DA) pelas células causa a fluorescência da difluoresceína (DCF), que pode facilmente ser lida em espectrofotômetro. Neste ensaio, 100µL de água e 75µL de DCFH-DA foram adicionados a 25µL de homogeneizado de amostra, homogeneizados em vórtex e levados ao banho-maria a 37°C ao abrigo da luz, por um período de 30 minutos. Separadamente, foi preparada a curva de calibração, onde se utilizou como padrão o DCFH-DA 0,1µM diluído em tampão fosfato/EDTA em pH 7,4 em diferentes concentrações. Tanto as amostras quanto a curva de calibração foram processadas em duplicata e ao abrigo da luz. Ao final dos 30 minutos, foram feitas as leituras no espectrofotômetro (525nm excitação e 488nm de emissão), sendo os resultados expressos em nmol de DCF por mg de proteínas.( 18 )

Indicador de formação de óxido nítrico

Para mensurar o conteúdo de nitrito, as amostras foram incubadas com reagente Griess (1% sulfanilamida e 0,1% de N-1 (naftil) etilenodiamina) em temperatura ambiente, por 10 minutos, e a absorbância foi medida a 540nm. O conteúdo de nitritos foi calculado com base em uma curva padrão de 0 a 100nM realizada com o metabólito nitrito de sódio (NaNO2). Os resultados foram calculados em µmol nitrito/mg proteína.( 19 )

Carbonilação de proteínas

O conteúdo de carbonilas foi determinado espectrofotometricamente a 370nm como previamente descrito por Levine et al.( 20 )Os resultados foram calculados como nmol/mg de proteína empregando o coeficiente de extinção molar de dinitrofenilhidrazonas de 22.000M-1cm-1.

Análises estatísticas

Os resultados foram expressos como média±erro padrão da média e analisados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA), seguida do teste post hoc Bonferroni. Foi adotado nível de significância p<0,05. A análise estatística foi realizada por meio do software GraphPad Prism®(versão 5.00) para Microsoft Windows®.

RESULTADOS

Peso corporal e glicemia em jejum

A avaliação dos efeitos da suplementação de NAC sobre o peso corporal, da glicemia em jejum e da tolerância à insulina em camundongos obesos está ilustrada na figura 1 . Como esperado, a alimentação dos camundongos com dieta hiperlipídica foi eficiente em aumentar o peso corporal dos camundongos; a administração do antioxidante NAC não alterou tal parâmetro nos camundongos, o qual permaneceu elevado de modo significativo em relação ao Grupo Controle ( Figura 1A). Os níveis glicêmicos em jejum dos camundongos obesos foram maiores quando comparados ao Controle. A administração de NAC reduziu os níveis glicêmicos de jejum no Grupo Tratado com NAC, em relação ao Grupo Obeso ( Figura 1B).

Figura 1. Efeitos da suplementação de N-acetilcisteína sobre o peso corporal, glicemia em jejum e tolerância à insulina em camundongos obesos.

Figura 1

* p<0,05 versus Grupo Controle;p<0,05 versus Grupo Obeso.

NAC: Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína; KRI: velocidade constante do decaimento da glicose.

Teste de tolerância à insulina

Para avaliar-se a sensibilidade à insulina entre os grupos estudados, utilizou-se a constante de decaimento da glicemia (kRI). A obesidade reduziu significativamente os valores de kRIquando comparado ao Grupo Controle. Por outro lado, o tratamento com antioxidante NAC reverteu esse efeito significativamente ( Figura 1C).

Produção de espécies reativas no tecido cardíaco

Os efeitos do antioxidante NAC sobre a produção de espécies reativas pelas técnicas de DCF e óxido nítrico (NO), e sob o dano oxidativo no tecido cardíaco de camundongos obesos, estão mais bem ilustrados na figura 2 . Nenhuma diferença entre os três grupos foi encontrada quanto aos níveis de DCF (Figura 2A). No entanto, observaram-se aumento da concentração de nitrito no Grupo Obeso e redução desta concentração quando o Grupo Obeso recebeu a NAC (Figura 2B).

Figura 2. Efeitos da administração de N-acetilcisteína sobre os níveis de diclorofluoresceína, nitrito e carbonil no tecido cardíaco de camundongos obesos.

Figura 2

* p<0,05 versus Grupo Controle;p<0,05 versus Grupo Obeso.

DCFH: Diclorohidrofluoresceína; NAC: Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína.

Defesa antioxidante e dano oxidativo

Avaliou-se carbonil como marcador de dano oxidativo. Observou-se aumento na carbonilação de proteínas no Grupo Obeso quando comparado ao Controle. O uso de NAC reduziu significativamente este parâmetro (Figura 2C). Resultados similares foram observados quando se analisou a expressão da GPx. Os níveis proteicos de GPx não se alteraram significativamente no Grupo Obeso. No entanto, a administração do antioxidante NAC elevou marcantemente os níveis proteicos dessa enzima ( Figura 3 ).

Figura 3. Efeitos da administração de N-acetilcisteína sobre os níveis proteicos de glutationa peroxidase no tecido cardíaco de camundongos obesos.

Figura 3

* p<0,05 versus Grupo Obeso.

GPx: glutationa peroxidase; NAC: Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína.

Efeitos do N-acetilcisteína sob a sinalização da insulina

Avaliaram-se os níveis proteicos de Akt fosforilada, como marcador da via de transdução da insulina. Os resultados mostraram que a obesidade reduziu significativamente os níveis proteicos da fosforilação da Akt, quando comparado ao Grupo Controle. Por outro lado, o tratamento com NAC mostrou-se eficaz em elevar os níveis da Akt fosforilada no tecido cardíaco a valores similares ao Grupo Controle ( Figura 4 ).

Figura 4. Efeitos da administração de N-acetilcisteína sobre os níveis proteicos da proteína quinase B fosforilada no tecido cardíaco de camundongos obesos.

Figura 4

*p<0,05 versus Grupo Controle; † p<0,05 versus Grupo Obeso.

pAKT: proteína quinase B fosforilada; NAC: Grupo Obeso Tratado com N-acetilcisteína.

DISCUSSÃO

O presente estudo investigou o estresse oxidativo e sua influência sobre a sinalização da insulina em miocárdio de camundongos obesos. Metodologicamente, optou-se, para isso, tratar os animais com o antioxidante NAC.

Nossos resultados mostram que o tratamento com NAC foi capaz de atenuar a produção de espécies reativas, diminuir danos oxidativos às proteínas, elevar os níveis proteicos de GPx e ainda alterar a fosforilação da proteína Akt (proteína crucial envolvida na sinalização da insulina). Tais resultados permitem sugerir que, na obesidade, ocorre aumento do estresse oxidativo, o que pode influenciar e afetar a sinalização celular insulínica, ao menos no miocárdio de camundongos obesos.

Utilizamos a dieta hiperlipídica como modelo para indução da obesidade.( 21 )No presente estudo, a dieta rica em gordura foi eficiente em elevar o peso corporal nos animais do Grupo Obeso. A administração do antioxidante NAC não alterou significativamente o peso corporal desses animais. Por outro lado, quando NAC foi administrada de forma concomitante à oferta da dieta rica em gordura, Ma et al.,( 22 )observaram redução do peso corporal do Grupo Tratado com NAC, comparado com o Grupo Obeso não tratado.

Animais obesos apresentaram maiores níveis sanguíneos de glicose em jejum quando comparado ao Grupo Controle. O aumento da glicemia em jejum nos animais obesos sugeriu instalação da resistência corporal à insulina. Ao realizar o teste de tolerância à insulina, verificou-se que a sensibilidade à insulina foi, de fato, significativamente diminuída no Grupo Obeso. Interessantemente, quando suplementado com NAC, houve redução da glicemia em jejum, bem como aumento da sensibilidade à insulina. Estudo desenvolvido por Zheng et al.,( 23 )administrando o NAC por 5 meses via oral diluído na água de beber mostrou resultados similares. Camundongos obesos que receberam NAC por 5 meses tiveram melhora no quadro glicêmico de jejum, bem como melhor tolerância à glicose, evidência que reforça a participação do estresse oxidativo sob a fisiopatologia da resistência à insulina.

Zafirovic et al.,( 24 )mostraram que a obesidade, além de prejudicar a captação de glicose e a sinalização da insulina no coração, eleva, via aumento da expressão de oxido nítrico sintase induzível (iNOS), a produção de NO neste órgão.( 24 )O NO é um importante vasodilatador e influencia diretamente na contratilidade cardíaca.( 25 )Porém, no ponto de vista bioquímico, o NO pode reagir com o ânion superóxido o impedindo de ser dismutado pela superóxido dismutase (SOD) em H2O2. No presente estudo, embora não tenham sido observadas alterações significativas no nível de DCFH, houve aumento de espécies reativas no Grupo Obeso (ao menos de nitrogênio), e a administração de NAC reduziu tais parâmetros.

Devido à capacidade de reação do NO com o ânion superóxido, ocorre desvio na reação, que favorece a produção de peróxido nitrito via NO e diminui a formação de H2O2(principal reagente na técnica do diclorohidrofluoresceína). Assim, é possível que a manutenção dos níveis de DCFH seja justamente devida ao fato de haver este desvio na reação provocado pelo aumento de NO. Em adição, embora a atividade de neutralização direta de espécies reativas ( scavenger) do NAC seja significativamente menor do que a ação das enzimas antioxidantes como SOD, catalase e GPx, o NAC também pode exercer esta função e prevenir o desenvolvimento de estresse oxidativo.( 15 )

O aumento de espécies reativas relaciona-se com o dano oxidativo a proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos. Para saber se a obesidade está relacionada ao aumento de dano proteico, avaliou-se o conteúdo de carbonil no tecido cardíaco, o qual estava elevado no Grupo Obeso. De fato, analisando o tecido cardíaco de camundongos obesos, Li et al.,( 26 )demonstraram que, na obesidade, ocorre aumento de dano oxidativo em proteínas.( 26 )Segundo Guo et al.,( 27 )a obesidade é capaz de elevar significativamente a expressão de subunidades do complexo fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina oxidase (NADPH oxidase), principal gerador de ERO no tecido cardíaco.( 27 )Utilizando o NAC, estes autores observaram menor translocação da subunidade p67 para a membrana e concluíram que a administração de NAC reduz danos à proteína por meio da redução da atividade da NADPH oxidase em tecido cardíaco de ratos obesos.

No presente estudo, avaliaram-se os níveis proteicos da GPx como indicativo de atividade antioxidante. A obesidade reduziu os níveis proteicos de GPx, embora não de maneira significante. O tratamento com NAC foi capaz de elevar os níveis proteicos desta enzima. Segundo Lavoie et al.,( 28 )a administração oral de NAC aumenta os níveis de cisteína e, consequentemente, eleva os níveis de glutationa reduzida, a GSH, um tripeptídeo composto por glicina, glutamil e grupamento cisteína.( 14 , 15 )Estudando o sistema de defesa antioxidante em animais obesos, Whiting et al.,( 29 )observaram aumento na produção de radicais livres em ratos obesos hiperglicêmicos, o que foi relacionado com menores níveis de GPx plasmática e eritrocitária.( 29 )Em adição, estudo realizado por Ballal et al.,( 30 )mostrou reduzidos níveis de GPx em tecido cardíaco de ratos obesos.( 30 )Alguns estudos têm demonstrado que o aumento do estresse oxidativo pode prejudicar a sinalização da insulina.( 31 - 33 )No entanto, há, também, estudo demonstrando que o aumento de ERO pode elevar a sensibilidade à insulina.( 34 )Esses achados contraditórios na literatura sugerem que a relação entre estresse oxidativo e sensibilidade à insulina ainda não está elucidada e merece maiores investigações.

No presente estudo, utilizando a fosforilação da Akt como marcador da sinalização da insulina, observou-se que a obesidade reduziu significativamente a expressão da Akt no tecido cardíaco de camundongos obesos. Estudando a Akt no miocárdio de roedores, DeBosch et al.,( 35 )e Shiojima et al.,( 36 )relataram que a atividade desta proteína pode ser regulada pela insulina, pelo estado nutricional e pelo estado redox. Usando a fosforilação de Akt como marcador miocárdico de RI, Whaley-Connell et al.,( 37 )reportaram que a produção de oxidantes está inversamente associada à sensibilidade à insulina.( 37 )Com o intuito de verificar esta informação, administrou-se, nos camundongos obesos, o antioxidante NAC, elevando-se, assim, a expressão da proteína pAKT de modo significativo em relação ao Grupo Obeso. Embora o exato mecanismo de como isso ocorra não esteja claro na literatura, acredita-se que o aumento do processo inflamatório, muito presente na obesidade, possa elevar o estresse oxidativo e prejudicar a sinalização da insulina neste órgão − correlação esta reforçada neste estudo por meio da administração do antioxidante NAC.

CONCLUSÃO

Nossos resultados sugerem que a obesidade e/ou a dieta hiperlipídica levam ao estresse oxidativo e à resistência à ação da insulina no tecido cardíaco de camundongos obesos. O uso de N-acetilcisteína como estratégia metodológica e terapêutica sugere relação entre ambos. No entanto, futuros estudos são necessários para avaliar-se a relação causa-efeito entre estresse oxidativo e resistência à insulina, bem como as possíveis alterações fisiológicas resultantes.

AGRADECIMENTOS

Este estudo obteve apoio financeiro da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC), através de seu fundo de incentivo e auxilio a pesquisa. Agradecemos também a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela manutenção dos recursos humanos, através do fornecimento de bolsas de iniciação cientifica, mestrado e doutorado, envolvidos com a realização deste estudo.


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