Gentherapie zur Behandlung der akuten inflammatorischen Immunantwort

Abstract

Acute inflammation and the innate immune response to severe tissue trauma continue to pose a critical pathophysiological challenge in the intensive care regimen. Advances in the development of improved gene therapeutics and their application in diverse animal models of acute inflammation have shown promising results in reducing both morbidity and mortality. The introduction of inflammatory antagonists, by either viral or non-viral vectors, has thereby proven to play a significant role in determining the overall outcome. Recent findings of utilizing the functional characteristics of immunocompetent cells (e.g. dendritic cells) in combination with the gene therapy-induced overexpression of anti-inflammatory target proteins have significantly expanded this gene therapeutic spectrum. The results from diverse experiments in our own murine model of sepsis, in connection with findings from various other analogous international studies, have demonstrated great potential to revolutionize the clinical treatment concept and prevention of acute inflammatory diseases.

Trotz der rasanten Weiterentwicklung intensivmedizinischer Kenntnisse und moderner Therapiekonzepte bleibt die Sterblichkeitsrate von schwerstverletzten oder septischen Patienten auf Intensivstationen weltweit unverändert [43]. Durch die Aktivierung des körpereigenen Immunsystems im Rahmen eines schweren Gewebetraumas, Fraktur, Ischämie und Reperfusion sowie eines hämorrhagischen Schocks kommt es zur systemischen Verbreitung entzündlicher Mediatoren, die meist eng mit dem Ausmaß der Schädigung korreliert. Zusammen mit der konsekutiven Veränderung weiterer neuroendokriner, metabolischer und auch genetischer Parameter kann die unkontrollierte Produktion dieser Mediatoren Multiorganfunktionsstörungen (MOF) begünstigen, welche schließlich zum Multiorganversagen (MOV) mit Todesfolge führen können. In zahlreichen tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass die gezielte Steuerung des Immunsystems die Morbidität und Mortalität in der akuten Inflammation reduziert [12, 35, 39].

Mit der neusten Technologie der Gentherapie ist es heute möglich, sowohl gewebeständige wie auch immunkompetente Zellen in ihrer Eigenschaft und Funktion gezielt zu manipulieren. Diese Übersichtsarbeit soll die Möglichkeiten der Gentherapie sowie dessen vielfältige Anwendung in der akuten inflammatorischen Immunantwort erläutern und dabei einen kurzen Blick in die Zukunft gewähren.

Das Prinzip der Gentherapie

Die Gentherapie ermöglicht den Transfer von spezifischen Gensequenzen eines gewünschten Proteins in das Erbgut einer beliebigen Zelle. Diese gentechnisch veränderte Zelle wird somit gezwungen das entsprechende Protein herzustellen, welches normalerweise nicht oder nur in geringen Mengen von dieser Zelle produziert wird. Je nach Eigenschaft des neu zu synthetisierenden Proteins kann dieses entweder intrazelluläre Steuerungsmechanismen beeinflussen oder als biologisch aktiver Mediator sezerniert werden und so den Organismus lokal und/oder systemisch beeinflussen [31].

Verglichen mit der klassischen Methode der Medikamentenapplikation benutzt die Gentherapie den Zielorganismus zur Herstellung des gewünschten Wirkstoffs aus körpereigenen Proteinen. Dadurch entfallen bei der Gentherapie die lokalen und systemischen Nebenwirkungen, die viele klassische Medikamente aufweisen. Während bei der klassischen Arzneimitteltherapie in Abhängigkeit der Halbwertszeit des Medikaments pharmakologisch wirksame Konzentrationen über einen gewissen Zeitraum nur durch die wiederholte Verabreichung erreicht werden, können gentherapeutisch veränderte Zellen das gewünschte Protein in gleich bleibender Konzentration über einen bestimmten Zeitraum eigenständig synthetisieren. Die Halbwertszeit dieser implantierten Gene beträgt Tage bis Monate und ist sowohl vom verwendeten Vektor (z. B. Viren oder rezeptorbindende Schleusenmoleküle) sowie dem natürlichen Lebenszyklus der transfizierten Zelle abhängig [18, 41, 49].

Dennoch birgt die Gentherapie auch Gefahren. So wurde beim retroviralen Gentransfer im Rahmen der Behandlung von Kindern mit einer schweren angeborenen Immunschwäche („X-linked severe combined immunodeficiency“, X-SCID) von einer Insertionsmutagenese berichtet, die eine lebensbedrohliche Leukämie verursachte [1, 9]. Bei einem anderem Fall endete die adenovirusvermittelte Gentherapie eines jungen Patienten mit einem angeborenen Mangel des Enzyms Ornithin-Transcarbamoylase (OTCD) tödlich, da alleine durch das Adenovirus bereits eine überschießende Aktivierung des Immunsystems induziert wurde [2, 16]. Neuere Vektorkonstruktionen (viral und nicht-viral) sollen daher die allgemeine Pathogenität reduzieren und die Steuerbarkeit in den verschiedenen Applikationsformen deutlich verbessern.

Werkzeuge der Gentherapie

Der Einbau einer gewünschten Gensequenz in das Erbgut einer Zelle wird als „Transfektion“ bezeichnet. In Abhängigkeit von der Lokalisation des Gentransfers unterscheidet man zwischen einem direkten „In-vivo-“ und dem indirekten „In-vitro-“ oder „Ex-vivo-Gentransfer“. Beim direkten Gentransfer wird der Vektor lokal an den gewünschten Ort im Organismus appliziert, während der indirekte Gentransfer die Isolierung der Zielzellen, Reinigung und Transfektion außerhalb des Organismus beinhaltet. Diese in vitro transfizierten Zellen werden dann entweder systemisch oder lokal an den gewünschten Ort im Organismus reappliziert. Der „Vektor“ gilt dabei als Transportmittel, um das spezifische Gen in die Zelle zu tragen. Dieser Vektor kann entweder viral (z. B. Adenovirus, adenoassoziierter Virus, Retrovirus) oder nicht-viral mechanisch (z. B. über oszillierende Tattoo-Nadeln, Goldplättchen) sowie als Trägermolekül (z. B. kationische Liposomen, Rezeptorliganden, Immunolipoplexe) appliziert werden [46].

Die im Vektor verpackte Gensequenz besteht im Wesentlichen aus einem „Promotor“ und einem „Transgen“. Die Gensequenz des Promotors („Starter-DNA“) bestimmt, wann und in welchen Zellen das Transgen gelesen wird und dient in der aktiven Form als „Antriebsaggregat“ der Genexpression. Dabei unterscheidet man zwischen unspezifischen und spezifischen Promotoren. Die unspezifische Promotorsequenz wird in der Regel aus einem Virus gewonnen (z. B. Zytomegalieviruspromotor). Durch den natürlichen Tropismus dieses viralen Promotors kann das Transgen von jeder transfizierten Zelle gelesen werden. Im Gegensatz hierzu stehen spezifische endogene Promotoren, die entweder organspezifisch (z. B. der hepatozytenspezifischer Promotor Phenylalanin-Hydroxylase) oder funktionsabhängig (z. B. der endogene Promotor für Akutphasenproteine) sind.

Das Transgen beinhaltet die Gensequenz („Therapie-DNA“) des gewünschten Proteins, welches von der Zielzelle überexprimiert, vermehrt produziert oder den intrazellulär manipulativen Effekt erzielen soll (Abb. 1), [14, 25].

Die immunologische Antwort auf die akute Inflammation

Im Rahmen der initialen Immunantwort auf einen inflammatorischen Stimulus stellen die antigenpräsentierende Zellen, wie z. B. dendritische Zellen und Monozyten, die wesentlichen Komponenten unseres zellulären Abwehrsystems dar. Diese immunkompetenten Zellen zirkulieren durch das Blut- und Lymphsystem oder residieren im entsprechenden Gewebe, um den Organismus ständig hinsichtlich gewebefremder Stoffe und Antigene zu überwachen. Ihre Aktivierung erfolgt einerseits durch sog. „Danger-Signale“ (z. B. freie Sauerstoffradikale, Hitze-Schock-Proteine, Zytokine, Chemokine, DNA-Fragmente) oder durch körperfremde Pathogene, wie z. B. Bakterien, Viren und Pilze und deren molekularen Bestandteile. Diese Danger-Signale werden im unnatürlichen Stress der Zellen vermehrt an der Zelloberfläche exprimiert oder durch deren Schädigung in die Umgebung freigesetzt (Abb. 2). Diese Stressproteine sowie körperfremdes Material werden vom Immunsystem durch entsprechende Wächterzellen wie Monozyten und dendritische Zellen sofort erkannt, dessen Aktivierung wiederum zur Freisetzung von entzündlichen (proinflammatorisch oder antiinflammatorisch) Mediatoren (Zytokine und Chemokine) führt.

Die Bilanz dieser inflammatorischen Kaskade dient im kontrollierten Falle dem Ziel das Entzündungsgeschehen örtlich einzugrenzen und weitere immunkompetente Zellen zur Elimination der entsprechenden Noxe zu rekrutieren. Die klassischen proinflammatorischen Proteine führen dabei zur typischen lokalen Entzündungsreaktion mit Rubor, Tumor, Calor und Dolor. Im schweren Gewebeschaden (nach mechanischem Trauma, Ischämie und Reperfusion, Verbrennung) bedarf der lokale Schaden jedoch oft eine „Massenrekrutierung“ aktiver immunologischer Zellen, die wiederum neue inflammatorische Proteine produzieren. Dies führt schlussendlich zu einer Überschwemmung des gesamten Systems mit inflammatorischen Mediatoren („systemic inflammatory response syndrome“, SIRS), welches nach den klassischen Prodromi mit Fieber und Unwohlsein zu Gerinnungsstörungen, diversen Organfunktionsstörungen mit konsekutivem Multiorganversagen bis hin zum Tode führen kann. Der Schweregrad dieser Störung korreliert dabei eng mit dem Aktivierungsgrad des Immunsystems (Abb. 2).

Während dieser initialen Phase der übermäßigen Produktion an proinflammatorischen Botenstoffen versucht der Organismus zeitgleich dieser Überreaktion des Immunsystems durch diverse antiinflammatorische Regulationsmechanismen entgegen zu wirken. Hierbei spielen zum einen die Produktion antiinflammatorischer Zytokine [z. B. Interleukin (IL)-4 und −10] sowie der physiologische Zelltod (Apoptose) antigenpräsentierender Zellen wie Monozyten, dendritische Zellen und Lymphozyten eine entscheidende Rolle [23]. Bei einer erhöhten Apoptose wird die Anzahl verfügbarer immunologisch und inflammatorisch wirksamer Zellen vermindert, wodurch eine Reduktion der immunologischen Kapazität erreicht wird. Dieses Stadium der Immunparalyse nennt man auch „compensatory anti-inflammatory response syndrome“ (CARS) und besteht zeitlich wesentlich länger als die Ganzkörperinflammation (SIRS). In dieser Phase ist der Körper sehr vulnerabel hinsichtlich eines zweiten immunologischen Stimulus (second hit), was die Ausgangslage eines Intensivpatienten wesentlich verschlechtert [5, 28, 30]. In vielen tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass ein Entgegenwirken der inflammationsinduzierten Apoptose immunkompetenter Zellen (z. B. Monozyten, Lymphozyten und dendritische Zellen) zur signifikant verbesserten Überlebenschance septischer Tiere führen kann [15, 33, 35]. Das Ziel unserer Forschung war es bislang, diese Immunparalyse mit Hilfe der Gentherapie zu verzögern bzw. zu verhindern.

Der gentherapeutische Ansatz zur Behandlung der akuten Inflammation – ein Erfahrungsbericht

Die stetige Weiterentwicklung viraler und nicht-viraler Vektoren hat die Handhabung und klinische Sicherheit dieser verschiedenen Verfahren sowohl in vitro als auch in vivo deutlich verbessert. In unseren Studien verwendeten wir daher einen rekombinanten Adenovirus der 2. Generation. Durch die im Vergleich zum natürlich vorkommenden Adenovirus verminderte Anzahl vireneigener Proteine wurde die virusinduzierte Aktivierung des Immunsystems deutlich reduziert. In einem ersten gentherapeutischen Ansatz beabsichtigten wir die für die Immunparalyse mitverantwortlich erhöhte Lymphozytenapoptose gezielt zu manipulieren. Unsere initialen Versuche mit isolierten Leukozytensubpopulationen der Maus zeigten jedoch, dass sich isolierte Lymphozyten nicht effektiv mit dem Adenovirus transfizieren ließen. Interessanterweise war aber die Transfektionsrate für Monozyten und myeloide dendritische Zellen deutlich gesteigert [34].

Durch die potente Eigenschaft dendritischer Zellen, die klonale Ausbreitung von T-Lymphozyten zu aktivieren und diese in gleichem Maße in ihrer Immunantwort hinsichtlich der Zytokinproduktion zu steuern, fand sich somit ein Ansatz die Lymphozytenapoptose indirekt zu regulieren. Da dem antiinflammatorischen Zytokin IL-10 auch die Eigenschaft die Apoptose von Lymphozyten zu vermindern zugeschrieben wird [7, 13, 24, 36], wählten wir das IL-10 zu unserem gewünschtem Transgen [29]. Mit der Überexpression an IL-10 konnten wir im septischen Tiermodell der Maus eine signifikant geringere Mortalität im Vergleich zu Kontrolltieren aufzeichnen [26]. Zusätzlich ließ sich die Verminderung der Apoptoserate von Lymphozyten z. T. auf eine IL-10-induzierte Hochregulation von antiapoptotischem BcL-2-Protein zurückführen. Gentherapeutisch behandelte Mäuse wiesen darüber hinaus deutlich weniger Bakterien in den Blutkulturen auf als septische Kontrollen [32]. Anhand dieser Daten konnten wir den positiven Einfluss der gentherapeutischen Manipulation des Immunsystems bestätigen.

Um die Applikationsmethode hinsichtlich der klinischen Anwendung zu verbessern, war jedoch ein alternativer Weg zur intrathymischen Injektion der ex vivo behandelten Immunzellen notwendig. So machten wir uns die Migrationseigenschaft der in fast allen Geweben vorkommenden und systemisch zirkulierenden dendritischen Zellen zunutze und applizierten das Virus in die Fußsohle der Versuchstiere. Dabei wurde in allen Versuchen die entsprechende Partikeldosis Adenovirus appliziert, um das Transgen IL-10 nur lokal entlang der Lymphabflusswege und nicht systemisch messbar erscheinen zu lassen [19]. Wir konnten in diesen Versuchen bestätigen, dass die transfizierten dendritischen Zellen von der Haut gemäß ihrer immunologischen Eigenschaft zum nächsten Lymphknoten wanderten, um dort das fremde Protein durch Überexpression und vermehrte Produktion ortsständiger Lymphozyten zu präsentieren. Im gleichen Mausmodell der Sepsis führte diese Applikation des IL-10-exprimierenden Adenovirus erneut zur signifikanten Verbesserung der Überlebensrate im Vergleich zur unbehandelten septischen Kontrollgruppe [26].

Zur Erweiterung dieser Ergebnisse in die klinisch-tierexperimentelle Anwendung züchteten wir myeloide dendritischen Zellen ex vivo aus murinem Knochenmark und transfizierten sie in Kultur. Diese ex vivo transfizierten dendritischen Zellen wurden den Tieren schließlich reappliziert und der therapeutische Effekt im Sepsismodell (Zäkumligatur und Perforation mit konsekutiver generalisierter Peritonitis) evaluiert. Analog der Versuchsreihe mit direkter Virusapplikation zeigten die behandelten Tiere eine gesteigerte IL-10-Produktion mit signifikant verbesserter Überlebensrate [27]. Obwohl der genaue Signalmechanismus dieses beobachteten Phänomens noch nicht im Detail geklärt ist, scheint die Transfektion dendritischer Zellen anhand unserer Erkenntnisse ein neues therapeutisches Instrument zur Behandlung der chronischen und akuten Inflammation darzustellen.

Ähnliche Erfolge dieser gentherapeutischen Ansätze zur Behandlung der akuten Inflammation wurden auch von anderen internationalen Arbeitsgruppen berichtet. Dabei stand bislang die Überexpression antiinflammatorischer Zytokine zur Neutralisation der proinflammatorischen Zytokinantwort im Vordergrund [4, 38, 42]. In einem murinen Endotoxinmodell konnte die intraperitoneale Injektion von plasmidbeladenen Liposomen mit IL-10 oder dem TNF-Rezeptor p55 die Überlebensrate der behandelten Mäuse signifikant steigern [38]. Die i.m.-Applikation von IL-10-exprimierendem Adenovirus zeigte gleichermaßen antiinflammatorische Wirksamkeit [35, 47]. Weitere tierexperimentelle Ansätze zur Untersuchung von Alveolarzellen im Modell des „adult-respiratory distress syndrome“ (ARDS) bewiesen eine Reduktion der lokalen Entzündungsreaktion und der daraus resultierenden Gewebeschäden durch die gentherapeutisch induzierte Überproduktion inflammatorischer Antagonisten wie das α1-Antitrypsin [20], Prostaglandine [8], dem Hitze-Schock-Protein 70 (HSP-70 [45]) oder einem „Nuklear-Faktor-kB-Inhibitor“ [3].

Obwohl die Mehrzahl dieser Erkenntnisse aus dem Tiermodell stammt, bietet die Gentherapie in solch diversen akuten und chronisch-entzündlichen Prozessen, wie Frakturheilung [11], Wundheilung [10], Sehnenheilung [37], Knorpelheilung [44], Wirbelsäulenerkrankungen [21], Pankreatitis [6], Kolitis [22], Arthritis [17, 40] und der Artheriosklerose [48] ein modernes und erfolgversprechendes Behandlungskonzept.

Fazit für die Praxis

Die Gentherapie kann, wie unsere und andere Studien gezeigt haben, die inflammatorische Reaktion auf eine gewebeschädigende Noxe positiv beeinflussen. Mit der stetigen Weiterentwicklung verschiedener Vektorkonstruktionen und neuer nicht-viraler Applikationsformen wird die Gentherapie durch eine verbesserte und zielsichere Steuerbarkeit sowie einer geringeren Immunogenität in den nächsten Jahren bald zum klinischen Alltag gehören. So könnte die trauma- und/oder sepsisinduzierte Immunparalyse auf Intensivstationen durch eine systemische Reinigung und extrakorporale „Beimpfung“ im Sinne einer Dialyse gentherapeutisch unterstützt oder sogar behandelt werden. Immunkompetente Zellen wie dendritische Zellen würden selektiv filtriert, mit dem gewünschten Transgen transfiziert und anschließend dem Patienten wieder reinfundiert werden. Auch in anderen Bereichen der muskuloskelettalen Inflammation, wie z. B. in der Behandlung von Frakturen, Knorpelschäden, und Wundheilungsstörungen verspricht die Gentherapie in der Zukunft einen bedeutenden Stellenwert einzunehmen.