Aportaciones de la anatomía patológica en el diagnóstico de las infecciones cutáneas: una perspectiva histórica

El auge de las etiologías infecciosas en el siglo XIX

Todas las áreas de la medicina han experimentado un espectacular cambio en las últimas décadas, y la anatomía patológica no es ajena a ellas. En concreto, en el área a la que se refiere este artículo —las enfermedades infecciosas— se ha confirmado la naturaleza infecciosa de muchos cuadros que en siglos pasados eran de etiología desconocida, así como se ha consolidado el diagnóstico certero de los mismos.

Recapitulando sobre las contribuciones de la anatomía patológica en las infecciones desde sus orígenes, habría que retrotraerse al conocimiento sobre el carácter contagioso de las mismas, que era conocido ya desde los tiempos de la medicina clásica, y que, por ejemplo, fue reflejado en los textos bíblicos sobre la naturaleza de la lepra. Aunque las enfermedades fueron conocidas en sus aspectos epidemiológicos, clínicos, e incluso higiénicos, terapéuticos, y preventivos, los etiológicos se resistieron en gran medida hasta el siglo XIX.

La sífilis es un buen ejemplo de ello. Desde muy temprano en la historia de la medicina se reconocieron la enfermedad y sus manifestaciones, ejemplificadas de modo extremo en el caso de sífilis terciaria mostrado en el libro VIII de la copia De Recóndita Abscessuum Natura de Marco Aurelio Severino (1632) (fig. 1 ). En 1754, Jean Astruc realizó un magnífico estudio histórico sobre la sífilis en su trabajo sobre las enfermedades venéreas (De Morbis Venereis)¹, siguiendo la pista de la enfermedad hasta el continente americano. Más importante todavía, realizó una excelente exposición sobre la contagiosidad de la enfermedad y atribuyó muchos de los síntomas sifilíticos a la presencia de un virus en el organismo.

Figura 1.

Ejemplo extremo de sífilis terciaria, tal y como aparece en el libro VIII de la copia De Recóndita Abscessuum Natura de Marco Aurelio Severino (1632).

La sífilis —junto con la tuberculosis— llegaron a ocupar gran parte de los tratados de Medicina Interna del Siglo XIX, llevando al gran Sir William Osler a escribir sus famosas palabras: «He who knows syphilis knows medicine» (el que sabe de sífilis sabe de medicina)². Sin embargo, no fue hasta 1905 cuando Fritz Chauddin y Erich Hoffmann descubrieron el Treponema pallidum en un frotis de un condiloma plano¹.

Esta fue una de las grandes aportaciones al diagnóstico y comprensión de las enfermedades infecciosas en el siglo XIX: los microorganismos podían verse.

Louis Paster había demostrado en 1857 que la fermentación dependía de microorganismos³ y en 1876 Robert Koch logró transmitir el carbunco a ratones⁴. En las tres últimas décadas del siglo XIX se descubrieron, entre otros, los agentes causantes de la lepra, la malaria tifoidea, el tétanos, la tuberculosis, la erisipela, la difteria, la fiebre de Malta, la gangrena gaseosa, la peste, el botulismo o la disentería⁵. También se identificaron los estafilococos y los estreptococos, la Escherichia coli, el Pneumococcus o el Haemophylus influenzae ⁵. La actinomicosis, considerada durante mucho tiempo un tumor maligno, fue correctamente identificada como enfermedad infecciosa por Emil Ponfick (un discípulo de Recklinghausen y Virchow)⁶. También las fases del ciclo del paludismo se habían identificado y reconocido al microscopio desde que en 1880, Alphonse Laveran descubriese el Plasmodium falciparum en la sangre de un soldado, en forma de «filamentos transparentes que se movían muy activamente y que más allá de toda cuestión, estaban vivos»⁷. Fueron los italianos Amico Bignami, Giovanni Battista Grassi y Giuseppe Bastianelli quienes confirmaron que el ciclo del parásito era el mismo en los humanos que en las aves, continuando así los trabajos iniciados por Ronald Ross y Patrick Masson⁵.

La pasión por esta área en expansión de la medicina llevó a algunos investigadores a posturas inaceptables a todas luces: la experimentación con su propio cuerpo. Arthur Loss ingirió larvas de Strongyloides stercolaris, y Daniel Carrión (fig. 2 ) se inyectó material procedente de una verruga peruana para demostrar que el organismo causante también producía la fiebre de Oroya, consiguiendo su objetivo, pero falleciendo víctima de la enfermedad8, 9.

Figura 2.

Daniel Alcides Carrión, peruano, que siendo estudiante de medicina, se inyectó material procedente de una verruga peruana para demostrar que el organismo causante también producía la fiebre de Oroya. Aunque Carrión consiguió su objetivo, falleció víctima de la enfermedad.

Sin embargo, aunque en las enfermedades transmitidas por bacterias y parásitos, se describían el vector y el cuadro clínico, los virus —que por supuesto no se sabía todavía lo que eran— no podían ser observados directamente en el siglo XIX. Para ver los virus, quedaban por venir al menos dos desarrollos clave en esta historia: la histoquímica y la microscopía.

La histoquímica y los nuevos microscopios

En efecto, el siglo XIX trajo el progreso notable de la histoquímica, cuyo despegue muchos achacan a la introducción en la década de 1860 y 1870 de los colorantes de anilina¹⁰. Tan es así que algunos fijan en esta «histoquímica diagnóstica aplicada» el origen de la histopatología¹⁰.

Parte de estas nuevas técnicas histoquímicas fueron utilizadas en la identificación de distintos microorganismos directamente en los tejidos. En 1882, por ejemplo, Franz Ziehl y Friedrich Neelsen describieron la tinción de ácido rápido, que permitió la visualización de las micobacterias en los cortes tisulares¹¹. En 1884, fue introducida la tinción de Gram por el patólogo holandés Christian Gram, y en 1890 Loeffler identificó flagelos bacterianos por impregnación argéntica. Las técnicas de Romanovsky fueron introducidas en 1891 con un uso principal en la identificación de parásitos en hematología.El avance en este caso se centró en que los microorganismos podían verse en su contexto tisular.

De este modo, la histopatología ligó los gérmenes causantes a las alteraciones morfológicas que los acompañaban: el granuloma, la necrosis, la respuesta inflamatoria… Se lograron así avances en la interpretación patogénica del daño causado al ser humano por los microorganismos.

En 1872, Hjalmar Heiberg, profesor de patología en Christiania, describió lo que le parecían micelios de Leptotrix en las vegetaciones de un caso de endocarditis en una mujer después del parto⁶. Friedrich Albert von Zenker, profesor de Dresden y Erlangen, presentó su —luego famosa— monografía sobre la degeneración cerúlea en músculos de pacientes con fiebre tifoidea⁶.

Además, aunque los virus en sí seguían sin verse, las enfermedades virales iban asociadas a signos histológicos reconocibles que permitían su diagnóstico indirecto. El Die Pocken-Effloreszenzen de Weigert en 1874, por ejemplo, incluyó magníficos dibujos histológicos de pústulas de viruela⁶, y a finales del siglo XIX, Paul Unna realizó sus descripciones sobre el diagnóstico diferencial entre el herpes genital y la sífilis. En 1893 Guarneri describió los cuerpos de inclusión de la viruela y de la viruela de vaca¹² y en 1904, Mallory describió los de la fiebre escarlata en autopsias¹³, mientras que tan solo un año más tarde, Field W. Cyrus los aislaría directamente de ampollas, ilustrando su artículo con bellos dibujos a color¹⁴. Es decir: se describieron claves morfológicas para el reconocimiento de las enfermedades infecciosas, incluso si no se observaba el microorganismo en sí.

Con la entrada del siglo XX, el interés de la histoquímica se centró en nuevas técnicas para mejorar la identificación de microorganismos o el reconocimiento de aquellos que aún no se podían teñir: se introdujeron las técnicas para espiroquetas (Whartin y Chronister 1920), bacterias Gram-positivas (Brown y Brenn 1931) o algunas variantes del Romanowsky para la identificación de parásitos (Giemsa 1902, Wright 1902, May-Grunwald 1902)¹⁵.

Tras alcanzar un cénit en torno a la tercera década del siglo XX, pocas técnicas histoquímicas fueron ya introducidas a partir de 1940, con alguna excepción aislada en lo que se refiere a las enfermedades infecciosas, tal como el Grocott en 1955 para la identificación de hongos¹⁵.

En ese momento, existía un sentir generalizado de que el avance en el conocimiento patológico solo se conseguiría con el logro de mayores aumentos microscópicos. Sin embargo, el límite de resolución estaba marcado por la longitud de onda de la luz.

Dos intentos de introducción de nuevos microscopios de fuentes distintas a la luz habían en parte fracasado: con el microscopio de luz ultravioleta, la imagen solo podía observarse en fotografía. Con el microscopio de rayos X, los tiempos de exposición eran tediosos e impracticablemente prolongados. A pesar de ello, se produjeron algunos logros importantes aislados, como por ejemplo, la primera visualización de un virus con el microscopio de luz ultravioleta a manos del inglés Barnard en 1925.

En 1934, Ernst Ruska presentó el primer microscopio electrónico, en donde un haz de electrones sustituía al haz de luz del microscopio óptico, y había lentes magnéticas en vez de lentes de cristal. Se desarrollaron fundamentalmente dos sistemas de microscopía electrónica: el de transmisión de electrones y el de barrido16, 17, 18. En este último, los electrones detectados provenían de la superficie de la muestra, y se obtenían así, imágenes en relieve. Un modelo funcional de este último fue presentado en 1953 y en 1965 se lanzó al mercado el primer modelo¹⁹.

Gracias a ello, en 1950 se realizaron las primeras observaciones de un virus al microscopio electrónico mediante sombreado de los viriones, pero fue en 1960 cuando se difundió el uso del microscopio electrónico en virología²⁰ para enfermedades que hasta ese momento se diagnosticaban con cultivo, a veces no concluyente. Se describió, por ejemplo, la morfología característica del virus de la viruela (fig. 3 ), así como la naturaleza viral de la hepatitis B²¹, los rotavirus22, 23, los astrovirus, los coronavirus, los calicivirus…²⁴, pero también fue descrita la ultraestructura de microorganismos no virales, como Cryptosporidium, Ciclospora ²⁵ o Angiostringylus ²⁶.

Figura 3.

Gracias al microscopio electrónico, en los años 1960 se describió la morfología característica del virus de la viruela.

Las técnicas modernas

Durante la década de 1970, se introdujo en histopatología uno de los avances que más hizo progresar la especialidad y por extensión, el conocimiento en todas las áreas de la dermatopatología: la inmunohistoquímica. Con el uso de anticuerpos marcados enzimáticamente, el reconocimiento de antígenos localizados en el tejido permitió la identificación y clasificación de gran cantidad de tumores y entidades27, 28, 29. La inmunohistoquímica supuso tal contribución al desarrollo de la histopatología, que el propio Juan Rosai dijo de ella que «no hay probablemente otra técnica que ha revolucionado tanto el campo durante los pasados cincuenta años, como la técnica de la inmunohistoquímica».³⁰

Sin embargo, el uso de la inmunohistoquímica en patología infecciosa fue muy limitado en un principio. Los microorganismos se seguían identificando mediante cultivo o mediante técnicas tradicionales histoquímicas, tales como las tinciones de Ziehl-Neelsen, Grocott, PAS…

Por el contrario, el nuevo avance en el diagnóstico de enfermedades infecciosas llegó de la mano de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permitía diagnósticos certeros del germen causante, incluso con estudios sobre susceptibilidades a antibióticos.

Así, en la década de 1990, la PCR abrió, por ejemplo, una puerta al diagnóstico de la neurosífilis. Hasta ese momento, la demonstración de la presencia de Treponema pallidum (T. pallidum) en el líquido cefalorraquídeo era imposible, dada la imposibilidad de cultivo. Además los métodos serológicos no eran suficientes para establecer un diagnóstico definitivo³¹. La PCR permitió detectar ADN de T. pallidum en el líquido cefalorraquídeo de pacientes en todos los estadios de sífilis, demostrando así que los microorganismos invadían el sistema nervioso central desde los estadios tempranos de la enfermedad³¹.

La PCR no fue de uso exclusivo de la histopatología. Los microorganismos se detectaban en todo tipo de muestras: líquidos, secreciones, exudados, raspados… Sin embargo, diagnosticar los patógenos fuera de su contexto tisular nos desproveía de la información sobre la respuesta inflamatoria de los órganos ante la infección o sobre otros cambios celulares inducidos.

Lo anterior, que pudiera parecer trivial, era fundamental en ciertos casos: no era lo mismo diagnosticar la presencia del virus de Epstein-Barr en un linfoma, que demostrar que se trata de un linfoma relacionado con el virus de Epstein-Barr. Para afirmar lo segundo, las células tumorales tenían que expresar marcadores del virus. No bastaba con la presencia de este último en los linfocitos del componente inflamatorio acompañante, cosa que sucedía en un altísimo porcentaje de individuos sanos. En definitiva: se comprobó que la presencia del germen no necesariamente significaba que este fuese el causante de la patología.

Precisamente por esto, la tendencia natural de la histopatología fue la que siempre había sido: priorizar las técnicas que permitían la visualización directa de los microorganismos en los tejidos. Por ello, lenta y paulatinamente se fue imponiendo la inmunohistoquímica, con anticuerpos sensibles y específicos para bacterias y virus: Treponema, Borrelia, micobacterias, Bartonella, Listeria…

Un magnífico ejemplo lo representaron los anticuerpos contra el herpesvirus humano 8 (HHV8) y contra el virus del carcinoma de células de Merkel.

Con respecto al HHV8, el virus fue identificado en 1994 en el sarcoma de Kaposi de un paciente con síndrome de inmunodeficiencia adquirida³² y pronto se comprobó que el virus era aislado en todos los casos de sarcoma de Kaposi33, 34. Tanto el aislamiento del virus como la detección del mismo se hacían en un principio por PCR. Sin embargo, fruto de ello, se obtuvieron algunos resultados controvertidos que informaban de la presencia de HHV8 en el granuloma piógeno³⁵, en hemangiomas36, 37, en el hemangioendotelioma retiforme³⁸, o en el angiosarcoma³⁹.

Este desconcierto fue en parte resuelto con la aparición del anticuerpo anti-LNA-1, una proteína presente en todas las células infectadas por HHV-8⁴⁰. La positividad, pudo no solo ser evaluada en el contexto morfológico, comprobando la expresión en el núcleo de las células tumorales (fig. 4 ), sino que también se comprobó la presencia de la proteína en todos los casos de sarcoma de Kaposi. No se presentó en la literatura ningún caso positivo convincente que no fuese un sarcoma de Kaposi. Además, el anticuerpo hizo desaparecer todas las dudas morfológicas diagnósticas, simplificando muchísimo el diagnóstico diferencial dermatopatológico de los casos de sarcoma de Kaposi⁴¹.

Figura 4.

Positividad para anticuerpo frente a Herpesvirus humano tipo 8 en un estudio inmunohistoquímico de un sarcoma de Kaposi. La positividad es característicamente nuclear y granulada.

Algo parecido sucedió con el poliomavirus de células de Merkel, descubierto en 2008 en casos del carcinoma homónimo⁴². La detección del virus se hizo en un principio mediante PCR, centrándose en el gen «large T-antigen»43, 44, 45, 46. Sin embargo, la técnica pronto arrojó datos controvertidos: de un lado, la frecuencia del virus variaba entre 24 y 100% según las series42, 47, 48, 49, 50. De otro, el virus también fue detectado en tejido no tumoral de pacientes tanto con carcinoma de células de Merkel como sin él⁵¹.

En 2009 se presentó un anticuerpo contra el large T-antigen, conocido como CM2B4⁴³ (fig. 5 ). De nuevo, la ventaja del anticuerpo era evaluar posibles diferencias morfológicas entre los casos negativos y los positivos. Combinando varias técnicas de detección viral, se concluyó que no todos los carcinomas de células de Merkel estaban relacionados con la infección viral. El poliomavirus estaba integrado en aproximadamente un 80% de los casos⁴² y pudo determinarse que la patogenia de ambos grupos (con y sin virus) era distinta49, 52, 53, 54. Los carcinomas de Merkel que no estaban relacionados con el polioma, parecían seguir un mecanismo patogénico ligado a la radiación ultravioleta y eran más frecuentes en el hemisferio sur y Australia. Además, los datos parecían indicar que las formas tumorales positivas para el virus tenían mejor pronóstico que las negativas44, 55, 56, 57, 58, aunque dicha interpretación no carecía de su controversia⁵⁹.

Figura 5.

Ejemplo de un carcinoma de célula de Merkel relacionado con el virus de célula de Merkel. Dicha relación se demuestra mediante la positividad con el anticuerpo CM2B4.

No solo el carcinoma de células de Merkel se benefició de la comprensión de mecanismos patogénicos aportada por la inmunohistoquímica. También por ejemplo, se demostró la teoría de que los síntomas sistémicos en la infección por Clostridium eran fundamentalmente producidos por toxinas, al detectar el microorganismo localizado en la puerta de entrada⁶⁰. O en el caso del T. pallidum, se comprobó una distinta distribución de las espiroquetas en los tejidos en casos de sífilis primaria y secundaria, con predominio de un patrón perivascular en la primaria y epidérmico en la secundaria⁶¹. En definitiva: la visualización de los microorganismos en el tejido proporcionó información patogénica de relevancia.

La inmunohistoquímica supuso además una considerable mejora en la sensibilidad diagnóstica: Goel y Budhwar encontraron que mientras la histoquímica convencional (Ziehl-Neelsen) demostraba microorganismos en los granulomas de 36,1% de los casos de infección por M. tuberculosis, la inmunohistoquímica era positiva en el 100%⁶².

También logró la inmunohistoquímica superar la sensibilidad de la PCR en situaciones concretas. Tal era el caso de la infección por Bacillus anthracix: cuando los pacientes habían recibido antibióticos, las técnicas de detección del germen (cultivo, Gram, PCR…) eran a menudo insuficientes. Sin embargo, el desarrollo de anticuerpos para uso inmunohistoquímico consiguió salvar tales obstáculos en un porcentaje significativo de casos, siendo la inmunohistoquímica el método diagnóstico de preferencia, por encima incluso de la serología, el cultivo, la PCR o las tinciones histoquímicas60, 63.

Algo parecido sucedía en las infecciones por micobacterias, en donde la cantidad de bacilos era no infrecuentemente muy pequeña (de difícil detección por PCR) o estaba oscurecida por una prominente reacción inflamatoria. Ambos obstáculos eran salvados con la inmunohistoquímica: la técnica, con muy poco o nada de fondo, permitía la visualización fácil de los bacilos, incluso en muy pequeña cantidad⁶⁰.

El futuro

Dentro de lo difícil y arriesgado que resulta establecer predicciones de futuro, se puede quizá anticipar dos tendencias con riesgo pequeño de equivocarse.

Una, que se impondrán las técnicas de secuenciación genética masiva de genoma completo, del tipo de la Next Generation. Para hacerse una idea conceptual previa de lo que suponen estas nuevas técnicas, baste compararlas con sus predecesoras de secuenciación (como la PCR) en un aspecto: la PCR secuencia segmentos previamente conocidos del material genético. Ello requiere que se haya establecido una hipótesis etiológica previa sobre una enfermedad⁶⁴. Además, las técnicas de PCR no siempre son eficaces en la distinción de genotipos virales, por ejemplo. Aunque para paliar este y otros problemas, se han ideado, entre otras soluciones, los test de PCR multiplexed para detección simultánea de múltiples loci, su actualización con nuevos primers y validación del nuevo producto, es siempre laboriosa.

Por el contrario, el avance mayor introducido por las técnicas de secuenciación de genoma completo es que extienden el proceso a millones de reacciones que tienen lugar de modo paralelo, en vez de limitarla a unos pocos fragmentos de ADN. El resultado es la secuenciación rápida de grandes cantidades de material, incluidos genomas enteros. Y todo ello, sin necesidad de generar primers previos. Por si fuera poco, desde su introducción en 2007, la Next Generation se ha mejorado a un ritmo que supera la ley de Moore, más que duplicando cada año la capacidad cuantitativa de información obtenida por prueba. Esto se ha unido a un abaratamiento progresivo de los costes. Para que el lector se haga una idea, en el momento de escribir este editorial, la técnica permite la secuenciación de más de cinco genomas humanos en poco más de una semana, por un coste de unos 4.000 €.

Además, la técnica permite la flexibilidad de la obtención de datos, seleccionando la cantidad de los mismos, o centrándose en un área genómica específica, o por el contrario, obteniendo una especie de visión más amplia de los datos (con menos detalles). Adicionalmente, el hecho de que se puedan secuenciar grandes cantidades de ADN, permite obtener información sobre la implicación de las regiones no codificadas en los procesos patológicos.

El paso conceptual dado con la Next Generation es que ya no se necesita conocer previamente el agente causante de una enfermedad. Por lo tanto, se pueden descubrir nuevos microorganismos o nuevas especies, y no hace falta variar ningún tipo de primer para adaptarlo a posibles mutaciones de los microorganismos conocidos.

Este tipo de técnicas ha permitido, por ejemplo, el estudio rápido de la diversidad de los virus aviares⁶⁵, algo crucial en un mundo en el que la globalización determina la difusión rápida de enfermedades de causa viral en las que el diagnóstico de especificidad viral es necesario para un tratamiento eficaz.

Adolece, eso sí, de lo mismo que han flaqueado siempre las técnicas de detección genética: genes no son proteínas, y la presencia de material genético no se correlaciona con las proteínas efectoras patógenas. Pensemos, por ejemplo en un microorganismo inviable o de capacidad nóxica reducida o ausente por mecanismos epigenéticos, enzimáticos, ambientales u otros. Su genoma será detectable y detectado, pero no nos informará de su capacidad lesiva. Por ello, se puede casi complementar esta predicción con el augurio de que se introducirán técnicas de proteómica aplicadas a la información genética obtenida con la Next Generation.

Esta es en definitiva la segunda predicción: que la patología volverá a traer el diagnóstico de los microorganismos al contexto tisular. Es decir, se introducirán técnicas de la misma sensibilidad y ventajas de la Next Generation, pero en las que la información será obtenida sobre el tejido, y gracias a las que sabremos dónde se ubica el microorganismo que estamos detectando. Todo ello, con la superación conceptual de las técnicas de secuenciación masiva: que no se irá buscando un germen conocido a priori, sino probablemente una etiología desconocida.

En conclusión, volviendo al título de este editorial, la anatomía patológica lleva haciendo contribuciones a las enfermedades infecciosas de modo infatigable desde sus inicios. Para ello, cuenta con una ventaja que no tienen otras especialidades: contextualiza la infección en el tejido y en la respuesta inflamatoria del huésped. Ello posibilita el mejor conocimiento de los mecanismos patogénicos de la enfermedad, así como el diseño de estrategias de defensa más eficaces contra un patógeno concreto.

Conflicto de intereses

El autor declara no tener ningún conflicto de intereses.