Introducción
Los virus son la causa más frecuente de las enfermedades infecciosas humanas. La gravedad de sus acciones va desde el resfriado común al sida. Los virus son parásitos intracelulares que necesitan células vivas para propagarse. La detección de los virus patógenos requiere la obtención del espécimen en el momento adecuado y su procesamiento. En este capítulo se presentan las principales técnicas utilizadas para el diagnóstico y el seguimiento de las enfermedades producidas por los virus.
Recogida, transporte y procesamiento de los especímenes
La viremia suela asociarse con la fase aguda de las enfermedades víricas y puede preceder a la aparición de los síntomas. La aportación del laboratorio para el diagnóstico de las infecciones víricas requiere que los especímenes se recojan, transporten y procesen adecuadamente. En la actualidad, la mayoría de los métodos de laboratorio emplean equipos comerciales. En todo momento deben seguirse las instrucciones de los fabricantes.
Los especímenes potencialmente infecciosos deben procesarse en una cabina de seguridad. Debe tenerse especial cuidado cuando se trabaje con muestras que contengan virus.
La sangre es un espécimen adecuado para muchas pruebas en el laboratorio de virología y ha de procesarse de acuerdo con las instrucciones del método. La sangre se obtiene para pruebas serológicas y pruebas moleculares de detección de ácidos nucleicos. Las muestras de sangre se recogen en tubos de vacío. Cuando se necesite plasma o leucocitos hay que emplear un anticoagulante.
Otras muestras utilizadas para el análisis de virus son el líquido cefalorraquídeo, el líquido amniótico, los especímenes respiratorios, la orina y las heces. Todos ellos han de recogerse en las condiciones adecuadas.
Métodos de laboratorio para el diagnóstico vírico
Existen cuatro métodos de laboratorio fundamentales para el diagnóstico de las enfermedades víricas: cultivo, detección de antígenos, detección del ácido nucleico y detección de anticuerpos.
Cultivos víricos
Los virus necesitan células vivas para replicarse. Muchos virus se replican de forma activa en cultivos celulares. Los sistemas de cultivo celular son monocapas de células vivas que sostienen el crecimiento de los virus. La replicación del virus se detecta mediante el efecto citopático en la monocapa celular. Se denomina efecto citopático a las alteraciones morfológicas visibles características en una línea susceptible debido a la replicación del virus.
Las líneas celulares pueden propagarse y/o mantenerse en el laboratorio, aunque lo más habitual es adquirir los cultivos celulares monocapa comerciales. Existen tres sistemas celulares generales: primarios, diploides y continuos. Las líneas celulares primarias son las que proceden directamente de tejidos animales o humanos y se preparan troceando el tejido y tratándolo con tripsina. Las líneas celulares diploides son aquellas que mantienen la infección vírica hasta de 20 a 50 pasadas y proceden de células fetales o de recién nacidos. Un ejemplo son los fibroblastos humanos diploides. Las líneas celulares continuas son las que proceden de cánceres humanos o animales o son células transformadas in vitro. Así, estas líneas celulares continuas tienen un cariotipo heteroploide y pueden subcultivarse de forma indefinida sin que se pierda la sensibilidad a la infección por el virus. Las líneas celulares continuas más utilizadas son la HeLa y la HEp-2.
Detección de antígenos víricos
Los antígenos del virus pueden detectarse mediante métodos inmunológicos con anticuerpos fluorescentes (inmunofluorescencia directa) o con métodos de inmunoanálisis. Los métodos de inmunofluorescencia directa implican bastante trabajo y la interpretación de los resultados es subjetiva. Los métodos de inmunoanálisis son más objetivos.
Detección del ácido nucleico
Los métodos moleculares permiten detectar el ácido nucleico del virus. La hibridación in situ permite detectar por medio de sondas marcadas con fluorescencia virus como el del papiloma, el citomegalovirus y los virus del herpes. Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos como la PCR o la bADN se emplean para el seguimiento del VIH y del virus de la hepatitis C. El uso de los métodos moleculares se ha potenciado con la PCR en tiempo real.
Detección de anticuerpos
Las medidas de los anticuerpos frente a los virus tienen dos aplicaciones fundamentales: diagnosticar la infección reciente y determinar la inmunidad. Demostrar la infección actual o reciente requiere la detección en el suero de IgM específica del virus.
Síndromes infecciosos víricos
Una forma de abordar el diagnóstico de laboratorio de las infecciones víricas es agruparlas en síndromes clínicos específicos. Se consideran los más importantes: infecciones de las vías respiratorias, mononucleosis infecciosa, infecciones congénitas y neonatales, infecciones del sistema nervioso central, gastroenteritis víricas, hepatitis víricas e infecciones por VIH.
Infecciones de las vías respiratorias
Un gran número de virus dan lugar a infecciones de las vías respiratorias. Los principales patógenos respiratorios son el virus de la gripe, el virus respiratorio sincitial y los metapneumovirus.
El virus de la gripe se replica rápidamente en las células de la faringe y el árbol traqueobronquial. El comienzo de la fiebre es repentino, y se produce dolor de cabeza, dolor muscular y debilidad. La gripe sin complicaciones se resuelve tras 4–5 días. El diagnóstico se realiza durante los dos o tres primeros días de la enfermedad, cuando es máxima la expansión vírica. El método más sensible es la RT-PCR (PCR con transcriptasa inversa); el siguiente es el cultivo, y los especímenes más adecuados son las secreciones nasofaríngeas, los esputos y los hisopos faríngeos. Para hacer un diagnóstico rápido es útil la inmunofluorescencia directa de antígenos víricos en secreciones nasofaríngeas. La detección de antígenos víricos en estas secreciones nasofaríngeas puede realizarse mediante enzimoinmunoanálisis comerciales.
El virus respiratorio sincitial produce infecciones importantes de las vías respiratorias inferiores, sobre todo en los niños pequeños. Puede detectarse mediante inmunofluorescencia directa o enzimoinmunoanálisis de los antígenos en las secreciones respiratorias.
Los metapneumovirus producen diversas infecciones respiratorias, principalmente en los niños y las personas mayores. El diagnóstico de metapneumovirus se realiza principalmente por RT-PCR, sólo al alcance de algunos laboratorios.
Mononucleosis infecciosa
La mononucleosis infecciosa es una enfermedad linfoproliferativa producida por el virus de Epstein-Barr (VEB). Es un virus con ADN de doble cadena de la familia de los herpesvirus, que también produce el linfoma de Burkitt, el carcinoma nasofaríngeo y la neumonitis intersticial linfocítica. El VEB se propaga a través de la saliva contaminada e infecta a los linfocitos B. Los antígenos víricos que aparecen sobre la superficie de los linfocitos B afectados inducen la producción de linfocitos T mononucleares anómalos característicos. Los períodos de incubación van de 4 a 6 semanas y, aunque al final la enfermedad suele resolverse, los síntomas pueden durar períodos largos.
El VEB puede cultivarse en líneas celulares linfoblastoides. Sin embargo, esto no es práctico, ya que lleva mucho tiempo y, además, no diferencia entre infecciones primarias y reactivadas. El diagnóstico de la infección por el VEB en el laboratorio generalmente se hace identificando linfocitos atípicos en sangre periférica, junto con una prueba de anticuerpos heterófilos (prueba de Paul-Bunnell). La detección de estos anticuerpos es muy específica, pero muy poco sensible. Asimismo, se dispone de métodos de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos contra el antígeno de la cápsida del virus. Y los métodos de enzimoinmunoanálisis detectan anticuerpos de las clases IgG e IgM contra el antígeno de la cápsida. También pueden determinarse anticuerpos contra el antígeno nuclear del virus.
Recientemente, se ha hecho posible detectar el ADN del VEB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica puede ser útil para diagnosticar la infección tempranamente. Puede detectarse en suero, líquido cefalorraquídeo o biopsias tisulares de enfermos con una linfoadenopatía inducida por una mononucleosis infecciosa, enfermedades linfoproliferativas tras trasplantes, un linfoma de Burkitt y un carcinoma nasofaríngeo. El ácido nucleico del VEB también puede detectarse mediante hibridación in situ (HIS), en la que se emplea una sonda para los ARN codificados por el virus.
Infecciones congénitas y neonatales
Las principales infecciones congénitas y neonatales están producidas por citomegalovirus, virus de la rubéola y virus del herpes simple.
Citomegalovirus
La infección por citomegalovirus (CMV) es la infección intrauterina más frecuente y afecta a cerca del 1% de los recién nacidos. Alrededor del 90% de estos niños son asintomáticos al nacer, de forma que el aislamiento del CMV de la orina o la saliva o la detección de anticuerpos IgM frente al CMV puede ser la única señal de infección congénita. Los IgM pueden determinarse mediante enzimoinmunoanálisis con antígenos recombinantes. La prueba prenatal más fiable para verificar la infección fetal es el cultivo del virus y la detección del CMV en el líquido amniótico mediante PCR.
Rubéola
La rubéola la causa un virus con ARN de la familia togavirus. Es una enfermedad muy contagiosa que se propaga a través de las secreciones respiratorias. El paso a la cavidad amniótica a través de la placenta durante el primer trimestre produce en el feto muchas malformaciones. Sin embargo, en la actualidad, la rubéola congénita es rara debido a la eficacia de la vacunación y la detección sistemática prenatal. El cultivo requiere mucho tiempo y no suele realizarse. Se emplean enzimoinmunoanálisis para detectar anticuerpos de los tipos IgG o IgM. Estos señalan una infección reciente, mientras que aquellos indican el estado inmunitario.
Virus del herpes simple
La infección neonatal por el virus del herpes simple (VHS) posee una elevada mortalidad y una morbilidad significativa. Normalmente se adquiere durante el nacimiento por un tracto genital materno infectado. La infección puede ser localizada o sistémica y las manifestaciones se presentan entre la primera y la segunda semana de vida. Pueden aparecer lesiones cutáneas, oculares o daño cerebral grave. El diagnóstico se realiza por el cultivo del virus mediante PCR a partir del material de las vesículas cutáneas o del líquido cefalorraquídeo.
Infecciones del sistema nervioso central
Las principales infecciones del sistema nervioso central son las meningitis y las encefalitis. En las meningitis se produce la inflamación de las capas meníngeas que recubren el cerebro, mientras que en las encefalitis el virus se replica en el parénquima cerebral. Muchos virus se asocian bien con meningitis o con encefalitis, aunque pueden afectarse ambos lugares en la meningoencefalitis, especialmente por infección por arbovirus. Los principales virus que producen meningitis son los enterovirus, mientras que el que ocasiona más a menudo encefalitis es el virus del herpes simple. La técnica más adecuada para el diagnóstico de la encefalitis vírica y la meningitis vírica es la amplificación de ácidos nucleicos en el líquido cefalorraquídeo.
Gastroenteritis víricas
Las gastroenteritis víricas son patologías frecuentes especialmente en los niños. Los principales virus que producen estas enfermedades son los rotavirus, los adenovirus entéricos, los calicivirus y los coronavirus. Los rotavirus son virus con ARN que tienen una cápsida de dos capas, lo cual da al virus el aspecto de una rueda. Son responsables de al menos el 50% de los casos de diarreas acuosas en los niños pequeños. Los serotipos 40 y 41 de los adenovirus están asociados con gastroenteritis y representan el 10–20% de los casos pediátricos. Los calicivirus producen gastroenteritis epidémicas agudas y, finalmente, los coronavirus producen gastroenteritis leves en adultos.
Tradicionalmente, el diagnóstico de las gastroenteritis víricas se ha hecho según las características morfológicas mediante microscopia electrónica (ME) en especímenes de heces. Sin embargo, la ME no está al alcance de la mayoría de los laboratorios. La detección rápida de antígenos de rotavirus en especímenes de heces puede hacerse fácilmente y con gran exactitud mediante pruebas de aglutinación con látex o inmunoanálisis.
Hepatitis víricas
Hay un gran número de virus que producen afectación hepática. Sin embargo, la mayor parte de las enfermedades hepáticas víricas las producen los virus llamados A, B, C, D y E, todos ellos hepatotrópicos y productores de alteraciones líticas en los hepatocitos.
Los virus de la hepatitis A (VHA) y hepatitis E (VHE) se transmiten de forma oral-fecal. El virus de la hepatitis B (VHB) se transmite fácilmente a través de la sangre y se ha adquirido, clásicamente, mediante transfusiones y pinchazos con agujas contaminadas. Sin embargo, son rutas importantes la infección vertical durante el embarazo, la transmisión mediante contactos sexuales y los líquidos biológicos infectados, como la saliva. El virus de la hepatitis C (VHC) se transmite fundamentalmente por vía sanguínea y en mucha menor medida durante el embarazo, o a través del contacto sexual o en casa.
Los cinco virus de la hepatitis no se replican en las líneas celulares estándares, y la detección de antígenos víricos y de anticuerpos específicos de los tipos IgM e IgG señala la fase de la infección. La determinación de la carga viral se emplea para el control de la respuesta al tratamiento de la infección crónica.
Hepatitis A
La hepatitis A la causa un pequeño virus de la clase picornavirus, que son virus con ARN. El virus está muy extendido por todo el mundo y produce infeccio-nes tanto epidémicas como esporádicas, sobre todo en áreas con poca higiene y condiciones socioeconómicas bajas. El período de incubación del VHA es de 7 a 42 días, y los pacientes son infecciosos entre 7 y 10 días antes de que aparezcan los síntomas y durante unos pocos días después. En la figura 36-1 se presenta la evolución cronológica de la infección por el VHA.
Figura 36-1.
Evolución cronológica de la infección por el virus de la hepatitis A (VHA).
El diagnóstico serológico de la infección aguda por el VHA depende de la demostración de anticuerpos anti-VHA de tipo IgM. Generalmente, aparecen unas 4 semanas después de la infección y pueden mantenerse hasta 4 meses tras el comienzo de los síntomas clínicos. La presencia de anticuerpos IgG o totales (IgM e IgG) indica una infección pasada y una inmunidad asociada.
Hepatitis B
La hepatitis B la produce un virus con ADN de doble cadena, miembro de la familia hepadna. El virus está formado por un núcleo (core) central que contiene el ADN, rodeado por una cápsida proteínica. El VHB se halla repartido por todo el mundo, y esta enfermedad es una de las causas principales del carcinoma hepático. El período de incubación del VHB está comprendido entre 30 y 180 días. Alrededor del 60% de las infecciones son asintomáticas, pero una pequeña proporción son muy graves y producen mucho daño al hígado e insuficiencia hepática.
El diagnóstico y seguimiento de laboratorio de las infecciones agudas y crónicas del VHB utiliza uno o varios de los siguientes marcadores serológicos: antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), antígeno e (HBeAg), anticuerpo contra el antígeno core (anti-HBc), anticuerpo contra el antígeno e (anti-HBe) y anticuerpo contra el antígeno de superficie (anti-HBs). La inmunidad de la vacuna para el VHB puede también valorarse midiendo la concentración de anti-HBs.
Las combinaciones de varios de estos marcadores son especialmente útiles para diferenciar la hepatitis aguda, la hepatitis crónica y el estado de portador crónico. Su patrón de reactividad refleja la evolución de la infección. En la figura 36-2 se presenta la temporalidad de la aparición de los antígenos y los anticuerpos durante la infección por el VHB.
Figura 36-2.
Temporalidad de la aparición de los antígenos y los anticuerpos en sangre durante una infección por el virus de la hepatitis B.
El HBsAg se detecta entre las 2 semanas y los 2 meses anteriores a la aparición de los síntomas clínicos y unas 2 semanas después de la infección. Su presencia varía hasta 2 o 3 meses. Entre un 5 y un 10% de los pacientes tienen concentraciones persistentes de HBsAg transcurridos 6 meses (portador crónico y hepatitis crónica).
Los anti-HBc de tipo IgM se hacen detectables al mismo tiempo que aparecen los síntomas clínicos y el aumento de las transaminasas. Permanecen elevados varios meses y a veces hasta 1 año. Los anti-HBc de tipo IgG aparecen pronto, tras los de tipo IgM, y permanecen durante años. En algunos pacientes desaparecen en última instancia.
Generalmente, la aparición de los anti-HBs se produce tras la desaparición del HBsAg. Persisten durante años y se asocian con una inmunidad relativa o absoluta. En los pacientes que han recibido la vacuna contra el VHB, este anticuerpo debe ser el único que se detecte en los que respondan.
El HBeAg está asociado con el HBsAg, pero normalmente no persiste tanto. Generalmente, su presencia se asocia con una mayor infectividad, pero tiene una utilidad diagnóstica limitada. La aparición de los anticuerpos anti-HBe coincide con la desaparición del antígeno e. Esto ocurre, normalmente, después de la aparición de los anti-HBc y antes de que aparezcan los anti-HBs. Aunque los anti-HBe a menudo desaparecen, su persistencia se ha asociado con la hepatitis crónica y el estado de portador crónico. No confieren ninguna protección.
El caso típico de hepatitis aguda por el VHB se caracteriza por la presencia de HBsAg y anti-HBc de tipo IgM. Este último es particularmente útil en los casos de HBsAg negativos. No se recomienda utilizar sólo el HBsAg para diagnosticar la infección aguda. En los casos de antígeno negativo, la presencia de anti-HBc de tipo IgM o total, y la del ADN del VHB en ausencia de anti-HBs, ayuda a confirmar esa infección. Por su parte, en la hepatitis crónica, el HBsAg está presente junto con el anti-HBc, pero no el anti-HBs. El HBeAg puede o no estar presente.
Las pruebas más recientes para valorar las infecciones por VHB son las medidas cualitativas y cuantitativas del ADN del VHB mediante métodos moleculares, como la PCR y las sondas específicas.
Hepatitis C
La hepatitis C la produce un pequeño virus con ARN. Está distribuida por todo el mundo, con más de 100 millones de portadores. La mayoría de los casos son asintomáticos, pero cuando se producen los síntomas es frecuente la hepatitis crónica. La transmisión tiene lugar mediante la exposición a la sangre o a los productos sanguíneos.
La determinación de los anticuerpos contra el virus de la hepatitis C (VHC) es la prueba principal para diagnosticar esta enfermedad. Sin embargo, el tiempo de seroconversión va de 3 a 6 meses en la infección adquirida mediante transfusión y de seis a nueve en los casos que no están relacionados con las transfusiones.
Los enzimoinmunoanálisis para el VHC detectan anticuerpos (anti-VHC) para cualquiera de las cuatro proteínas del mismo (5-1-1, c100-3, c33c y c22-3). Estas proteínas se sintetizan mediante técnicas recombinantes y se fusionan con la superóxido dismutasa (SOD) como portadora. El RIBA (recombinant immunoblot assay) es una técnica de inmunotransferencia que se emplea para detectar anticuerpos contra proteínas del VHC.
La PCR para el ARN del VHC utiliza cebadores para una región 5’ no codificante muy conservada del genoma del virus. Cuando esta prueba es positiva, el paciente tiene una infección activa con el VHC. Esta prueba se recomienda para los pacientes que sean positivos para anti-VHC. La medida cuantitativa del ARN del VHC (carga vírica) es útil para seguir la respuesta al tratamiento en los pacientes que están infectados con este virus.
Hepatitis D
La hepatitis D (delta) tiene por causa un virus que contiene un ARN circular. Requiere HBsAg para poder replicarse y, como consecuencia, una coinfección con el VHB. El modo de transmisión es parenteral y en las áreas endémicas está asociado con epidemias de gran mortalidad. Con relación al diagnóstico, al producirse en coinfección con el citado virus, sólo debe considerarse en casos de hepatitis B. El diagnóstico serológico de la hepatitis D depende del hallazgo del antígeno y/o la presencia de anticuerpos contra el virus de la hepatitis D (anti-VHD). En los pacientes con coinfecciones agudas, el antígeno de la hepatitis D (HDAg) aparece poco después del HBsAg y desaparece con la convalecencia. Las infecciones agudas están asociadas con el anticuerpo IgM anti-VHD, y los casos crónicos normalmente sólo dan el anticuerpo IgG. Ambos anticuerpos pueden finalmente desaparecer después de la convalecencia. El antígeno y los anticuerpos se determinan mediante radioinmunoanálisis o enzimoinmunoanálisis.
Hepatitis E
El VHE es un virus con ARN esférico sin envoltura. Este agente infeccioso está restringido a los países desarrollados y tiene una distribución mundial. Para el diagnóstico, se utiliza la determinación de anticuerpos contra el VHE mediante radioinmunoanálisis o enzimoinmunoanálisis. También puede detectarse el ácido nucleico mediante PCR.
Virus de la inmunodeficiencia humana
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) produce el sida. Se han detectado dos tipos de virus, el VIH-1 y el VIH-2. Estos virus atacan principalmente los linfocitos T4, que tienen un papel fundamental en la coordinación de la respuesta inmunitaria celular. Durante el curso de la enfermedad, estos linfocitos van disminuyendo, con el consiguiente deterioro de la respuesta inmunitaria. En consecuencia, los pacientes con sida son muy susceptibles a las infecciones; las principales las causan protozoos (criptosporidios y Pneumocystis jirovecii), hongos (criptococos) y virus (citomegalovirus y herpes), y las bacterias intracelulares (micobacterias).
La infección por el VIH induce al organismo a producir anticuerpos contra las proteínas del virus de diferentes partes del genoma de este, como env, gap y pol. El antígeno del VIH (Ag VIH) se produce durante la fase de replicación del virus y generalmente aparece algunos días después de la exposición; luego desciende rápidamente, al irse formando los anticuerpos. Años después, la antigenemia puede volver a aumentar, lo cual indicaría una replicación intensa del virus. En la figura 36-3 se muestra un perfil cronológico característico de una infección por VIH. Tras la infección aguda, el paciente sufre una enfermedad leve entre las 4 y las 8 semanas siguientes. El antígeno del VIH puede detectarse alrededor de 4 semanas después, y los anticuerpos empiezan a detectarse entre 6 y 8 semanas.
Figura 36-3.
Perfil cronológico característico de una infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
El diagnóstico de infección por el VIH se basa principalmente en las pruebas que detectan los anticuerpos contra el virus. La prueba de detección sistemática primaria es el enzimoinmunoanálisis (EIA). La mayoría de los EIA de tercera generación emplean proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de la cubierta, tanto del VIH-1 como del VIH-2, lo cual proporciona una sensibilidad elevada. Los EIA de cuarta generación, más recientes, incluyen en la fase sólida anticuerpos contra el antígeno p24 para reducir el período de ventana. Se comercializan en la actualidad pruebas rápidas de detección sistemática con una sensibilidad y especificidad semejante a las pruebas normales, que incorporan en su fase sólida péptidos sintéticos de la región inmunodominante de la proteína transmembrana de la cubierta gp41 para VIH-1 y gp36 para VIH-2.
Todos los enzimoinmunoanálisis que sean positivos deberán confirmarse mediante transferencia Western o inmunotransferencia. La transferencia con-firmatoria detecta anticuerpos contra proteínas del centro (p17, p24 y p55), la polimerasa (p31, p51 y p66) y la cubierta (gp41, gp120 y gp160) del VIH.
Las pruebas de inmunofluorescencia confirmatorias utilizan linfocitos T que expresan antígenos del VIH-1 fijados sobre portas de vidrio para capturar los anticuerpos contra el VIH-1 del suero, con la detección de los anticuerpos del paciente unidos mediante un segundo anticuerpo marcado con fluoresceína.
Respecto a las pruebas de detección del ARN del virus y del antígeno p24, no son útiles para el diagnóstico, aunque pueden utilizarse para tratar a los pacientes infectados. El ARN vírico puede dar resultados falsos positivos y no todas las personas infectadas tienen concentraciones detectables del antígeno p24 al comienzo de la infección. Para el cuidado de los pacientes se emplean las técnicas de biología molecular que determinan la concentración del ARN del VIH, que se conoce como carga vírica.
Virus del papiloma
Las infecciones por el virus del papiloma humano (VPH) están entre las enfermedades de transmisión sexual más frecuentes. Hay más de 70 genotipos conocidos del VPH. En los últimos años, muchos investigadores han demostrado que este virus es el factor que se asocia con más fuerza con el cáncer de útero en las mujeres. Los virus pueden detectarse en células teñidas con Papanicolaou (Pap). Actualmente, el mejor método es la detección del ADN del VPH mediante hibridación, utilizando sondas de ADN o ARN. Puede emplearse también la PCR.