口腔黏膜癌前病变和口腔癌动物模型的研究进展

Abstract

口腔黏膜癌前病变和口腔癌是发展中国家的常见疾病尤其是在南亚地区，其癌变机制尚不明确，目前缺乏有效防治措施，因此口腔黏膜癌前病变及口腔癌动物模型建立显得尤为重要。本文结合相关研究，就近年来口腔黏膜癌前病变及口腔癌动物模型建立方法的进展作一综述。

口腔癌是全球十大常见癌症之一，组织结构上约90%属于口腔鳞状细胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）[1]。近年来其发病率不断上升，据全球癌症预估数据[2]显示，在2018年将会有246 420例口腔癌男性新发患者，108 444例口腔癌女性新发患者。根据世界卫生组织头颈部肿瘤分类第4版[3]中介绍，口腔黏膜癌前病变主要包括口腔潜在恶性疾病（oral potentially malignant disorder，OPMD）[4]、口腔上皮发育不良（oral epithelial dysplasia，OED）和增殖性疣状白斑（proliferative verrucous leukoplakia，PVL），而其中常见的口腔黏膜癌前病变则包括口腔黏膜白斑病（oral leukoplakia，OLK）[5]、口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）[6]、口腔黏膜红斑病（oral erythroplakia，OE）[7]、口腔黏膜下纤维性病变（oral submucous fibrosis，OSF）[8]、盘状红斑狼疮（discoid lupus erythematosus，DLE）[9]、口腔慢性念珠菌病[10]和光化性唇炎[11]等。目前，虽然外科手术治疗、放射治疗、辅助化学治疗等治疗方式都有较大发展，但OSCC的5年生存率仍没有明显提高，仅为50%，低于许多其他实体肿瘤。OSCC发生发展的分子机制尚不清楚，临床上也缺乏能对其进行早期诊断和预后判断的特异性分子标志物。为深入研究口腔黏膜癌前病变及癌变机制，进而寻求有效的防治手段和针对性的治疗措施，构建有效的口腔黏膜癌前病变及口腔癌动物模型就成为了相关研究的重要突破口。

1. 口腔黏膜癌前病变动物模型

目前常见的口腔黏膜癌前动物模型分类有以下3种：诱导性动物模型、移植瘤动物模型和基因修饰动物模型。但部分常见口腔黏膜癌前疾病包括OE、DLE以及光化性唇炎均尚无有效的动物模型，本部分将详细介绍OLK、OLP、口腔慢性念珠菌病和OSF这4种疾病的动物模型。

1.1. OLK动物模型

根据世界卫生组织公布的第11版国际疾病分类标准[12]，OLK是一种发生在口腔黏膜上的白色斑块或斑片，其周围附着有上皮增生、过度角化的疾病。建立OLK的动物模型的方法主要有2种：化学诱导法和原位移植动物模型。

1.1.1. 化学诱导法

化学诱导法方面，有研究者[13]采用0.005 g·L⁻¹的苯并芘（Benzo[a]pyrene，BaP）/7，12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethyl-benz[a]anthracene，DMBA）联合诱变剂对5周龄地鼠的颊囊黏膜进行涂擦，分别持续15周，每周3次，建立了OLK动物模型。虽然化学诱导法建立金黄地鼠颊囊OLK动物模型十分简便快捷，但是人类没有颊囊这一结构，而且人类的口腔黏膜也比金黄地鼠颊囊要厚，所以学术界一直对该模型有效性有争论。同时DMBA处理容易破坏黏膜上皮层。

后有研究者[14]改用4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline N-oxide，4NQO）饮药法处理小鼠，取0.001 g·L⁻¹的4NQO用饮药处理周龄6周的小鼠，分别持续24周，每周3次，可建立OLK动物模型。成年小鼠口腔黏膜与人非常相似，所以能够解决口腔黏膜的差异性问题。然而这一模型有建模周期较长，将饮药处理法改为涂药法，产生相同病理结果的时间要短3~4周。有研究者[14]取0.005 g·L⁻¹的4NQO用涂药法，涂抹周龄6周小鼠的舌部，分别持续20周，每周3次，可建立OLK动物模型。

除此之外，还有学者[15]使用化学诱导法与机械刺激相结合：采用慢性机械刺激及50%香烟烟丝丙酮提取液涂擦已经用拔髓针轻刮多次的8周龄小鼠舌左侧缘中后1/3偏腹侧及左颊部中份黏膜处，至出现小的出血点或者发红，持续15~25周，可建立OLK动物模型。

1.1.2. 原位移植法

在原位移植动物模型方面，有研究者[16]向5~8周龄的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠的舌腹部移植人非白色念珠菌感染的OLK病损组织，可以建立OLK的动物模型。

在上述的这些动物模型中，尚不能完全地模拟人类OLK的生物学特性，各有各的优缺点（表1），对OLK的研究目的、研究手段不同，选用的动物模型也就不同，如何建立有效、稳定的OLK动物模型仍有待进一步探索，通过转基因法来构建OLK变动物模型，可能是今后的研究方向之一。

表 1. OLK动物模型比较.

Tab 1 Comparison of OLK animal model

主要方法	动物对象	处理方法	建模周期	建模成功率/%	模型解剖及组织生理与人类相似	操作接种简便	稳定性	癌变发展观察	参考文献
化学诱导	5周龄金黄地鼠	用0.005 g·L−1的BaP/DMBA涂抹地鼠颊囊	15周	-	×	√	√	√	[13]
	6周龄小鼠	用0.000 1 g·L−1的4NQO采取饮药法	24周	68.6	√	√	×	-	[14]
	6周龄小鼠	取0.000 5 g·L−1的4NQO涂抹小鼠舌部	20周	97.1	√	√	√	√	[14]
慢性刺激+化学诱导	8周龄小鼠	采用慢性机械刺激及50%香烟烟丝丙酮提取液涂擦已拔髓针轻刮8周龄的小鼠舌左侧缘及左颊部中份黏膜处数次至发红或出现少许出血点	15~25周	-	×	√	√	√	[15]
原位移植	SCID的5~8周龄小鼠	向小鼠舌腹位置原位移植人非白色念珠菌感染的OLK病损组织	8周	81.2	√	×	√	√	[16

1.2. OLP动物模型

OLP是一种细胞免疫紊乱造成的自身免疫病，世界卫生组织将其定义为癌前状态，其常见临床表现是网状、环形或者斑片状的白色丘疹[17]。目前OLP发病机制尚不明确，可能和抗原特异性以及抗原非特异性的T细胞介导的慢性炎症组织反应相关，也受包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等基因多态性、压力、烟草刺激等因素影响[18]。目前大部分建模方式均效果不佳（表2），但仍可尝试通过对具有遗传特性的棕色挪威鼠皮下注射氯化汞溶液，后向其黏膜表面涂抹氯化汞溶液从而构建OLP动物模型[19]。

表 2. OLP建模的比较.

Tab 2 Comparison of OLP animal model

处理方法	实验对象	效果简述	建模成功	参考文献
向大鼠的皮下注射氯化汞水溶液，导致其出现自身性免疫综合征，后局部涂抹氯化汞溶液	具有遗传易感性的棕色挪威鼠	8~10周后显示有单一症状的苔藓样病变	√	[19]
将人类非糜烂型OLP病损移植到小鼠的舌腹以及背部	SCID且NK细胞活性不强的小鼠	1周出现扁平苔藓病变；2周病理特征消失	×	[20]
对于口腔黏膜上皮与背部皮肤的表面采用针刺划痕法	金黄地鼠颊囊与背部皮肤	2周发现皮肤深处血管增生，炎细胞浸润；4周发现大量炎细胞浸润，但维持时间短	×	[22]
将典型的扁平苔藓病灶移植到小鼠的皮肤上	裸鼠	扁平苔藓在6周之后病理特征基本消失和正常皮肤相似，但角质层在6周后仍然是角质化。	×	[21]

未成功的建模方式主要包括：移植OLP患者病损组织至小鼠舌腹及背部[20]或皮肤[21]进行培养，也可通过黏膜表皮或皮肤针刺划痕法进行模型构建[22]，但几周后都出现了病理特征消失的现象。可能的解释是OLP的发生和宿主的自身特性相关，或因为建模过程中由于患者病损组织淋巴细胞游走或被小鼠自然杀伤（natural killer，NK）细胞所杀伤。

1.3. 口腔慢性念珠菌病动物模型

念珠菌是一种感染口腔和阴道黏膜表层的常见条件致病真菌，口腔念珠菌病的发生和发展受局部和系统的多种因素影响[23]。目前明确说明所建立模型为口腔慢性念珠菌感染动物模型的报道较少，而对于口腔念珠菌感染的方法报道则较为全面，因此本部分主要介绍口腔念珠菌感染的方法，其中包括消化道感染、静脉接种、口腔溃疡并灌注口腔念珠菌，运用激素以及基因型的筛选为口腔慢性念珠菌动物模型的建立提供参考。

1.3.1. 静脉注射法

对免疫缺陷小鼠每天连续注射环磷酰胺，3 d后通过小鼠口腔感染白色链球菌即可形成口腔的局限性感染而建立动物模型[24]。也有研究者[25]先使得小鼠发生口腔溃疡后再进行口腔念珠菌灌注，向昆明小鼠口腔内注射环磷酞胺溶液后，用醋酸溶液灌口腔，2 h后再用念珠菌菌悬液0.5 mL灌注口腔，也可建立口腔念珠菌感染物模型。除此还可以采用泼尼松龙构建相应动物模型，有研究者[26]对小鼠注射苯甲酸雌二醇后，注射泼尼松龙进行处理，后将含100 µL菌液的棉球塞入小鼠口腔1~2 h，可建立口腔念珠菌感染动物模型。还有研究者[27]将白色念珠菌涂抹在大鼠口腔黏膜并每周用无菌探针轻刮3次，持续数周，可成功构建动物模型；而如果在实验前在大鼠饮水中添加阿莫西林进行预处理，则白色念球菌感染效果更好。

1.3.2. 利用基因型筛选法

Hu等[28]通过对6周龄的BALB/c（敏感型）小鼠进行白色念球菌3683注射，发现其动物模型的白色念球菌感染比CBA/CaH（抵抗型）小鼠更为严重；并且白色念球菌3683比白色念球菌3630型和SC5314型口腔感染更好。

目前尽管已经有许多成熟的口腔念珠菌感染动物模型，但由于人类口腔慢性念珠菌病的发生十分复杂，相关机制尚不完全明确，对于口腔慢性念珠菌动物模型建立的较少，同时很多的动物模型一般只能模拟部分口腔慢性念珠病发生的特征。研究者从原先的静脉感染到后来的结合宿主自身免疫状态和感染方式，以及对动物模型的选取采取了基因层面的分析，发现变化的基因种类繁多，同时不同基因型小鼠的动物模型成功率有明显差异。因此，从动物模型的本身基因型进行筛选可能是一种更有前景的动物模型制作方向，而口腔慢性念珠菌病动物模型的有效建立仍有待进一步探索。

1.4. OSF动物模型

OSF是一种口腔癌前病变，其黏膜上皮萎缩、玻璃样病变，主要临床表现为感觉口腔干燥，灼痛，进食刺激性食物时感到疼痛，严重者可致张口和进食困难。

Sumeth Perera等[29]曾采用槟榔提取物滴小鼠口腔黏膜，建模成功，但建模时间长达300~600 d，时间太长。有文献[30]报道在8周时间内，在麻醉状态下，每天向SD大鼠两侧颊黏膜下注射1 g·L⁻¹的博来霉素稀释液，可制备出实验性OSF大鼠模型。博来霉素是治疗恶性肿瘤效果较好的重要化疗药物，但其主要不良反应为肺纤维化，也正是因为该药物的这种不良反应，博来霉素成为了构建肺纤维化模型的金标准[31]。实验者也尝试利用博来霉素的不良反应效果构建OSF，在他们的建模过程中，第2周即在实验组口腔黏膜发现了巨噬细胞等炎性细胞浸润，而在这过程中，巨噬细胞可能分泌了转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1导致成纤维细胞（fibroblast，FB）向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）的转变[32]，并在第4周时发现了动物模型中干扰素（interferon，IFN）-γ表达的下降，这可导致其拮抗TGF-β1的能力下降[33]，进而促进OSF的发生。

目前没有公认的重复性较好的OSF动物模型，相比较来看，博来霉素所诱导的动物模型效果较好，同时OSF也是由于长期咀嚼槟榔刺激而产生的，还需要对相关动物模型的实验条件、高敏动物种属等进行进一步的摸索与选择。

2. 口腔癌相关动物模型

口腔癌是十大癌症之一，预估在2018年，全球将会有超过30万的新发口腔癌患者[2]，口腔癌中90%为OSCC，口腔癌大多是由口腔黏膜癌前病变发展而来的。在我国，口腔癌发病率较高，因其解剖位置特别、累及面广，危害较大，其5年生存率不足50%，亟待提高诊治水平，因此口腔癌动物模型的构建十分重要。常见的口腔癌动物模型建立方法包括：化学诱导法、原位移植法和转基因法。

2.1. 化学诱导法

化学诱导法是目前最为成熟的口腔癌模型建立方法，成本低、发生条件易控制、可大规模批量建立，深受科研工作者的青睐。

化学诱导法最为常用的2种化学药物为9,10二甲基-1,2苯并蒽以及4NQO。9,10二甲基-1,2苯并蒽中存在苯环结构，有直接致癌作用，常用液体石蜡或丙酮溶解进行使用，但9,10二甲基-1,2苯并蒽容易破坏上皮细胞DNA的正常架构。4NQO是一种水溶性的致癌物质，经口服可诱导口腔癌[34]，其代谢产物有导致鼠7号染色体突变的致癌作用[35]。

Nagini等[36]利用9,10二甲基-1,2苯并蒽的石蜡油溶液涂抹小鼠颊囊，持续14周，成功建立了OSCC动物模型。有学者[37]对大鼠黏膜用4NQO水溶液进行涂抹，持续28周后成功诱导出浸润性OSCC。饮水法也是4NQO常用诱导方法之一，一些学者[38]用4NQO喂养SD大鼠32周，也可成功构建口腔癌动物模型。随后有研究者[39]结合基因敲除手段，发现视黄醇基因敲除小鼠被4NQO诱导成功的时间缩短。Lin等[40]连续8周用9,10二甲基-1,2苯并蒽涂抹小鼠颊囊，后连续4周继续使用水解槟榔碱，最后成功建立OSCC动物模型，大幅减少了DMBA单独使用时的建模时间。

2.2. 原位移植法

原位移植瘤模型是目前运用较为广泛的一类口腔癌诱导方法，除口腔癌之外也运用到全身组织器官的肿瘤模型建立中，开辟了在人体外建立人类肿瘤模型的途径。按照接种的形式可以分为活体肿瘤细胞株接种（cell line-derived xenograft，CDX）模型（即细胞源性异种移植模型）和肿瘤组织块移植（patient-derived xenograft，PDX）模型（即人源肿瘤异种移植模型）[41]。按照接种的肿瘤来源可分为小鼠来源的肿瘤细胞和人源性肿瘤细胞，适用的实验对象分别为小鼠和裸鼠。按照移植的部位可分为皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。皮下移植瘤模型就是将瘤组织或细胞用注射器注入动物皮下（常为背部、腹股沟、前肢腋窝等处），因皮下血供较差、纤维结缔组织丰富，肿瘤多为局限性生长且位置表浅，容易观察[42]。而口腔癌模型原位移植法则是将瘤细胞或组织移植到口腔内相应部位，让肿瘤在其原发部位生长，并具有向周围侵袭扩散的能力，这样能客观地反映口腔癌的生物学行为，吻合“种子与土壤理论”，能模拟出肿瘤细胞与宿主组织器官间相互作用的关系[42]。

裸鼠在口腔癌动物模型的建立中是至关重要的实验动物，是一种由第11对染色体的nu/nu基因纯合杂交而形成的新品种无毛小鼠。由于胸腺先天性缺失，其特征表现为缺乏T细胞免疫产生的免疫排斥反应，在一定程度上可接受外来的移植细胞，因此广泛地运用到了移植法诱导口腔癌动物模型中[43]。另外，由于金黄地鼠的口腔两侧有颊囊结构，在此区域内缺乏组织相容性抗原，可避免对移植组织的免疫排斥反应，其可用于移植法建立口腔癌模型[44]–[46]。近年来，新西兰大白兔也常被作为实验建模对象，相比于鼠科动物来说，其优点在于体积较大，便于影像学检测、抗癌药物筛选及介入治疗等相关研究项目的开展[47]。

Cal-27、HSC-3和SCC Ⅶ细胞系属于较为经典的用于OSCC肿瘤模型构建的细胞系。而近年来VX2细胞株的诱导潜力被逐渐发掘，其具有诱导时间短、侵袭性强、成功率高的特点，并在生物学行为上与人OSCC较为相似[45]。Jefferis等[48]首先报道了用VX2细胞株构建兔舌鳞癌的实验，取得了较好的结果。

综上，原位移植法能较好地保留人类口腔癌的部分特性，在原位移植中可观察到肿瘤扩散浸润的生物学行为，能在一定程度上拟合人类肿瘤的发生发展过程。但移植法需具备一定的外科手术条件，确保严格无菌，以防实验动物出现术后感染、伤口黏连等情况，这也增加了动物模型建立的难度。

2.3. 转基因法

转基因法是20世纪90年代新兴的一种构建口腔癌动物模型的方法，它通过基因工程技术使目的基因整合于受体染色体，形成可将目的基因在后代中稳定传递的个体，使受体生物及其家族均表现出研究者所需要的口腔癌性状。2005年Opitz等[49]率先建立了第一个口腔癌转基因动物模型，他们将目的基因注入受精卵的雄原核，得到C57BL/6鼠，并将其回交3代得到的较纯转基因鼠杂交得到具有口腔食道鳞状细胞癌的鼠模型。而Caulin等[50]则首次在转基因鼠上建立了具有可诱导性的口腔癌动物模型，他们通过融合人类孕激素受体技术激活诱导性Cre重组酶的基因改造建立实验小鼠，然后与ROSA26受体鼠杂交，在小鼠怀孕14.5 d时，向其子宫注射100 µg·kg⁻¹的RU486激活，之后不再暴露于RU486，其子代在5个月出现口腔癌。Huang等[51]则通过新兴的规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技术建立p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor，p75^NTR）敲除的人舌鳞状细胞癌SCC-9细胞株来探究p75^NTR的生物学作用，CRISPR/Cas9技术的DNA切割仅仅依靠一小段RNA而不是整个基因工程蛋白，更加便捷高效[52]，同时可有效应用于多种生物的基因编辑中[53]–[54]。这提示可将该技术与移植动物模型相结合，有效建立多种口腔癌动物模型，但其“脱靶”现象仍需进一步深入研究来解决[55]。

转基因法相比于其他构建口腔癌动物模型的方法来说，其优势在于它使对肿瘤的研究深入至细胞和分子水平，精准到基因表达的失活或增强；对于研究口腔正常组织发展到口腔黏膜癌前病变，进而恶化形成口腔癌的分子机制，具有重要意义。但它也存在着一些局限性：难以控制产生单一部位的肿瘤，常有多部位出现瘤灶，不符合人体口腔癌癌变部位较为局限的性质；转基因常导致的基因增添或缺失，无法模拟肿瘤发生中的基因局部突变；同时其动物模型成活率较低等。

3. 展望

用于口腔黏膜癌前病变及口腔癌研究的动物模型，已经从肿瘤上皮细胞培养物，发展到体内模拟口腔癌遗传学、病理特征和肿瘤-基质相互作用的系统性口腔癌患者的发展情况。在癌症免疫治疗和精准治疗时代，使用疾病模型进行系统地测试，是口腔癌预防和治疗干预的必要手段，也是研究口腔癌发生机制的重要方法。

Funding Statement

[基金项目]  国家重点研发计划重点专项课题（2017YFC0840100，2017YFC0840107）；国家自然科学基金（81872211，81672675，81621062）；高等学校学科创新引智计划（111计划）（B14038）；四川大学大学生创新创意实验项目（20171082，20171083）

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