猪软骨脱细胞基质对人脂肪干细胞增殖及分化的影响

Abstract

目的

研究猪软骨脱细胞基质（pACM）对人脂肪干细胞（hADSCs）增殖及分化的影响。

方法

将猪关节软骨进行脱细胞处理制备pACM并进行鉴定。分离培养hADSCs并分化鉴定。将不同浓度pACM与hADSCs共培养，以不添加pACM为对照组，通过CCK-8法检测pACM对hADSCs增殖能力的影响，通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法检测pACM对hADSCs成软骨分化的影响。

结果

0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹ pACM组hADSCs细胞增殖速率与对照组无统计学差异，而4.0、8.0 mg·mL⁻¹ pACM组hADSCs细胞增殖速率低于对照组（P<0.05）。0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹ pACM组成软骨相关基因SOX-9、抗Ⅱ型胶原纤维α1（COL2A1）、抗蛋白聚糖（ACAN）及细胞黏附相关基因层黏连蛋白（LAMININ）的表达均高于对照组（P<0.05），细胞干性相关基因Notch-1的表达低于对照组（P<0.05），成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAr-γ）的表达各组间均无统计学差异（P>0.05）。成软骨相关蛋白SOX-9、COL2A1及ACAN的表达高于对照组（P<0.05）。

结论

适宜浓度的pACM不会影响hADSCs的增殖，并且可以在基因水平上诱导其向成软骨方向分化。

在口腔颌面部创伤中，常见鼻、耳廓软骨或软骨下组织的缺损，其严重影响患者的面部健康、美观以及生活质量。软骨是一种无血管、淋巴、神经的组织，其中包含的软骨细胞属于终末分化细胞，自我修复与再生的能力非常有限[1]。

近年来，运用脱细胞生物支架材料以及人间充质干细胞进行组织再生的研究越来越多。猪软骨脱细胞基质（porcine acellular cartilaginous matrix，pACM）是一种天然的生物支架材料，其消除了细胞和抗原成分，同时含有大量胶原及软骨细胞分泌的多种细胞因子，可以提供类似于天然软骨的微环境，从而有利于诱导干细胞向软骨分化[1]–[2]。人间充质干细胞具有较强的自我更新能力以及多向分化潜能，其中，人脂肪干细胞（human adipose-derived stromal cells，hADSCs）来源丰富，较易获取，且造成损伤较小[3]。本实验将pACM与hADSCs进行共培养，研究其对hADSCs增殖及分化的影响，从而在细胞水平探讨将pACM与hADSCs联合应用后进行软骨再生的可能性。

1. 材料和方法

1.1. 主要实验材料及仪器

α-MEM培养基、胎牛血清（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶、双抗（上海碧云天生物技术有限公司），十二烷基硫酸钠脱细胞液（sodium dodecyl sulfate，SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、DNA酶、RNA酶（Sigma公司，美国），酶标仪（BioTek弓丝，美国），蛋白定量试剂盒、蛋白质印迹（Western blot）发光液、细胞培养箱（Thermo Scientific公司，美国），荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（Bio-Rad公司，美国），抗SOX-9、抗Ⅱ型胶原纤维α1（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）、抗蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）（Santa Cruz公司，美国）。

1.2. pACM制备

将猪关节软骨剪碎，在液氮中浸泡5 min，用高通量组织研磨仪将软骨碎块粉碎，PBS冲洗过滤，加入1%SDS脱细胞液，置于37 °C摇床中4 h，PBS冲洗，加入1%TritonX-100液1 h破膜，PBS冲洗后加入DNA酶、RNA酶处理30 min，PBS反复冲洗，冻干机冻干，Co60辐照灭菌后备用。

1.3. pACM鉴定

大体观察：通过体视显微镜观察pACM形态及结构。

扫描电子显微镜观察：将pACM置于2.5%戊二醛，4 °C下固定30 min，乙醇梯度脱水，干燥，喷金，通过扫描电子显微镜观察表面的超微结构。

组织学染色观察：将pACM进行石蜡包埋，切片，分别行甲苯胺蓝染色、番红O-固绿染色，倒置相差显微镜下观察。

1.4. hADSCs的分离培养及分化鉴定

hADSCs的分离培养：于空军军医大学第三附属医院整形美容科门诊收集患者（22~35岁，n=3）新鲜抽取的腹部脂肪样本，捐献者均于术前签署知情同意书。将人脂肪样本剪成大小约1 mm×1 mm×1 mm的组织块，PBS冲洗以后用Ⅱ型胶原酶消化30 min，1 000 r·min⁻¹离心5 min。然后吸弃上层的脂肪组织及上清液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基重悬，将细胞悬液移入25 cm²细胞培养瓶。置于37 °C、含5%CO₂、70%湿度的恒温培养箱中培养。72 h首次换液，之后每3 d换液，待细胞生长至铺满培养瓶底80%后，以1︰3比例传代。取第3代细胞进行实验。

成骨诱导：取第3代hADSCs，待细胞生长融合至90%，更换成骨诱导液（10%胎牛血清、1%双抗、50 µg·mL⁻¹维生素C、10 mmol·L⁻¹ β-甘油磷酸钠、100 nmol·L⁻¹地塞米松的α-MEM培养基），诱导21 d后行茜素红染色，倒置显微镜下观察。

成脂诱导：取第3代hADSCs，待细胞生长融合至90%，更换成脂诱导液（10%胎牛血清、1%双抗、0.01 mg·mL⁻¹胰岛素、0.5 mmol·L⁻¹吲哚美辛、100 nmol·L⁻¹地塞米松的α-MEM培养基），诱导14 d后行油红O染色，倒置显微镜下观察。

1.5. CCK-8法检测pACM对hADSCs增殖能力的影响

将pACM分别以0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·mL⁻¹浓度置于α-MEM培养基中，72 h后离心，取上清液，加入10%胎牛血清、1%双抗配制pACM浸取液培养基。将hADSCs以每孔10³个接种于96孔板中，贴壁后更换为不同浓度的pACM浸取液培养基，并设一组不添加pACM为对照组。各组分别在第1、3、5、7天时间点更换新鲜培养基，每孔加入10 µL CCK-8溶液，培养4 h后测吸光度值。

1.6. 荧光定量PCR、Western blot检测pACM对hADSCs成软骨分化的影响

将第3代hADSCs以每孔1×10⁵个接种于六孔板中，加入2 mL含10%胎牛血清的α-MEM培养基，在Transwell上室中分别加入含不同浓度（0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹）pACM的培养基（0.5、1.0、2.0 mg pACM+1 mL无血清的α-MEM培养基），另设一组仅添加1 mL无血清α-MEM培养基（不添加pACM）为对照组。

培养7 d后提取细胞RNA，进行荧光定量PCR实验，检测hADSCs成软骨相关基因SOX-9、COL2A1、ACAN、细胞黏附相关基因层黏连蛋白（LAMININ）、细胞干性相关基因Notch-1、成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAr-γ）等的表达。引物序列见表1，所用引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，以GAPDH为内参基因，检测目的基因表达量。

表 1. 基因引物序列.

Tab 1 Primer sequences

目的基因	引物序列（5′-3′）
GAPDH	F：TCAGCAATGCCTCCTGCAC
	R：TCTGGGTGGCAGTGATGGC
SOX-9	F：AGCGAACGCACATCAAGAC
	R：CTGTAGGCGATCTGTTGGGG
COL2A1	F：TGGACGATCAGGCGAAACC
	R：GCTGCGGATGCTCTCAATCT
ACAN	F：ACTCTGGGTTTTCGTGACTCT
	R：ACACTCAGCGAGTTGTCATGG
LAMININ	F：ACTGGACTCACCTACGCCAAC
	R：GGGAGCACACTGGTCACATTT
Notch-1	F：CGAACCAATACAACCCTCTGC
	R：CTGGTAGCTCATCATCTGGGACA
PPAr-γ	F：GGTGACTTTATGGAGCCCAAGT
	R：GACTCATGTCTGTCTCCGTCTTC

培养7 d后提取细胞总蛋白，采用Western blot检测hADSCs成软骨相关蛋白SOX-9、COL2A1、ACAN的表达，GAPDH为内参。

1.7. 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。实验数据采用单因素方差（one-way ANOVA）分析比较组间差异；若有差异，采用Turkey HSD检验进行两两比较，P<0.05时认为有统计学意义。

2. 结果

2.1. pACM鉴定

加工后的pACM呈白色半透明颗粒状，有韧性质感（图1A）。体视显微镜下可见颗粒呈不规则的多孔样结构，大小50~300 µm（图1B）。扫描电子显微镜下可见大量软骨胶原基质，软骨陷窝内几乎无遗留的细胞成分（图1C、D）。番红O-固绿染色表明pACM内含大量的葡糖胺聚糖（glucosaminoglycan，GAG）成分（图1E），甲苯胺蓝染色显示pACM仍保留了大部分软骨基质成分（图1F），进一步证明细胞成分在pACM内基本去尽。

图 1. pACM鉴定.

Fig 1 Characterization of pACM

A：大体观察；B：体视显微镜 × 40；C：扫描电子显微镜 × 1 500；D：扫描电子显微镜 × 5 000；E：番红O-固绿染色 × 100；F：甲苯胺蓝染色 × 100。

2.2. hADSCs培养及鉴定

原代hADSCs培养3 d后可见有短梭形细胞贴壁，7 d后细胞呈集落样生长（图2A）。传至第3代可见细胞呈一致的长梭形（图2B）。成骨诱导21 d后，茜素红染色显示有红色钙化结节形成（图2C）。成脂诱导14 d后，油红O染色显示细胞内有串珠样脂滴形成（图2D）。

图 2. hADSCs鉴定.

Fig 2 Characterization of hADSCs

A：培养3 d的原代hADSCs × 40；B：第3代hADSCs × 40；C：茜素红染色 × 40；D：油红O染色 × 100。

2.3. pACM对hADSCs增殖能力的影响

实验结果显示：1）培养7 d后，0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹ pACM组hADSCs细胞增殖速率与对照组无统计学差异，而4.0、8.0 mg·mL⁻¹ pACM组hADSCs细胞增殖速率低于对照组（P<0.05）。2）在培养的各个时期，pACM较高浓度组（4.0、8.0 mg·mL⁻¹）细胞增殖速率均低于对照组（P<0.05），其中8 mg·mL⁻¹ pACM组对hADSCs的抑制作用更加明显。

图 3. pACM对hADSCs增殖的影响.

Fig 3 The effects of pACM on proliferation of hADSCs

与对照组相比，*P<0.05。

2.4. pACM对hADSCs成软骨分化的影响

将hADSCs与pACM共培养7 d后，实时定量PCR检测结果（图4）表明，1）pACM组SOX-9、COL2A1及ACAN的表达均高于对照组（P<0.05）；0.5 mg·mL⁻¹ pACM组SOX-9及COL2A1的表达高于1.0 mg·mL⁻¹以及2.0 mg·mL⁻¹ pACM组（P<0.05）。2）pACM组LAMININ的表达高于对照组（P<0.05），Notch-1的表达低于对照组（P<0.05）；3）PPAr-γ的表达各组间均无统计学差异（P>0.05）。

图 4. 实时定量PCR检测pACM对hADSCs分化的影响.

Fig 4 The effects of pACM on differentiation of hADSCs by real-time quantitative PCR

横坐标中，A、B、C、D分别为对照组及0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹ pACM组。与对照组相比，*P<0.05；与0.5 mg·mL⁻¹ pACM组相比，^#P<0.05。

将hADSCs与pACM共培养7 d后，Western blot检测结果（图5）表明：pACM组SOX-9、COL2A1及ACAN的表达均高于对照组。

图 5. Western blot检测pACM对hADSCs分化的影响.

Fig 5 The effects of pACM on differentiation of hADSCs by Western blot

A、B、C、D分别为对照组及0.5、1.0、2.0 mg·mL⁻¹ pACM组。

3. 讨论

以往的研究中多使用同种异体脱细胞软骨支架，而关于异种的支架材料对于pACM软骨向分化的研究较少[4]。本实验将猪关节软骨进行脱细胞后可基本消除细胞和抗原成分，减少炎症和免疫反应发生。同时可以维持其天然的三维结构，具有多种胶原和蛋白多糖等，从而为细胞的增殖及分化提供良好的微环境，促进软骨再生[5]。

如何高效的对软骨进行脱细胞化是获得软骨脱细胞基质中重要的一步。目前脱细胞化的方法主要包括物理法（反复冻融等）、化学法、酶解法等。但在溶解细胞的过程中，往往也会造成软骨组织3D结构的破坏、GAG的降解等而影响其功能。研究[6]表明，在脱细胞之前，将软骨组织碎片化可减少软骨组织在脱细胞化过程中暴露于化学试剂等的时间，从而有效减少脱细胞软骨支架中GAG和Ⅱ型胶原的降解。本实验中将猪软骨组织在脱细胞前处理为软骨碎片，采用SDS脱细胞液、Triton-X100、DNA酶、RNA酶等方法进行处理。扫描电子显微镜检测结果显示软骨颗粒的细胞成分基本去尽。番红O-固绿染色以及甲苯胺蓝染色的结果均呈阳性，证实通过该处理所获得的pACM可以有效地保留天然软骨中的GAG及Ⅱ型胶原组分。

在体内软骨缺损区，往往没有足够的自体细胞迁移到缺损区进行修复。而通过传统组织工程的方法，获取自体软骨细胞时易造成供区损伤，数量有限，并且软骨细胞在传代过程中易去分化[7]。间充质干细胞以其自我更新能力强、分化潜能多向等优势，已被大量应用于软骨再生的研究[8]。相比于人骨髓间充质干细胞，hADSCs易获取，创伤小，可得细胞数多，在软骨组织工程的应用中具有很好的前景。本研究中细胞增殖实验结果显示：较低浓度的pACM对hADSCs无明显生长抑制作用，而大于4.0 mg·mL⁻¹浓度的pACM对hADSCs的增殖产生了明显的抑制作用，这可能是由于过大浓度的pACM中含有过量的促分化的细胞因子，从而抑制了细胞增殖。这提示在使用pACM与hADSCs进行软骨再生时，应该特别注意两者数量配比的问题。本实验结果表明适宜剂量的pACM不会抑制hADSCs的增殖，可作为支架材料与hADSCs复合后进行软骨的再生。

以往研究表明，骨髓间充质干细胞、ADSCs等间充质干细胞可接种至不同种类的支架材料，在体外3D培养环境以及动物实验中能诱导形成软骨样组织。与成熟软骨细胞作为种子细胞相比，间充质干细胞可获得更好的软骨向分化及软骨基质形成效果。Almeida等[9]研究发现，使用软骨脱细胞基质及转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可诱导脂肪来源干细胞向软骨方向分化。Xue等[10]将脱细胞软骨片与骨髓间充质干细胞复合植于裸鼠皮下，可形成软骨组织。本实验将hADSCs与pACM进行共培养，检测成软骨相关基因及蛋白表达，结果显示，成软骨相关基因SOX-9、ACAN、COL-2表达升高，细胞黏附相关基因LAMININ表达升高，细胞干性相关基因Notch-1下降，成软骨相关蛋白表达升高。本实验证实了适宜浓度的pACM可诱导hADSCs向软骨方向分化。其原因可能是：pACM中含有多种促软骨分化的细胞因子，如胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factors，IGF-1）、TGF-β、骨形成蛋白-6（bone morphogenetic protein-6，BMP-6）等。本实验结果表明，异种的猪软骨来源的pACM可在不添加其他生长因子的情况下，诱导人脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。

目前已有多项动物试验表明软骨脱细胞基质与ADSCs可实现软骨缺损的修复和再生。如Wang等[11]的研究表明兔ADSCs可在兔软骨脱细胞基质的作用下诱导分化为软骨细胞，并且将两者混合后移植于兔膝关节软骨缺损可实现较好的修复效果。然而目前的研究多为同种异体的支架材料与同种细胞进行组织再生[12]。但对于人体，若用自体来源的软骨则会造成供区的创伤，这就限制了同种软骨脱细胞基质的应用，而当前对于异种脱细胞支架在软骨修复中的研究还较少[13]。异种脱细胞组织来源丰富，且具有与人体相对应组织相似的结构及成分，通过脱细胞处理可消除抗原，减少移植后的免疫反应[14]。Kang等[12]将人来源的脱细胞软骨支架与兔ADSCs植入兔软骨缺损模型，取得了较好的软骨修复与再生效果。Choi等[15]发现猪软骨细胞外基质可诱导兔骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化，并且在裸鼠体内可实现软骨再生。Liu等研究[16]结果表明，hADSCs具有低免疫原性和免疫调节能力，从而其能更好地适应pACM的微环境。反之，pACM中含有的天然分泌的细胞因子也可以促进hADSCs的黏附、软骨向分化及软骨基质的产生。本实验表明猪来源的适宜浓度的pACM可以诱导hADSCs向成软骨方向分化，为后续利用二者进行人体软骨再生提供了一定的理论依据。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81700930）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81700930).