槟榔与细胞内活性氧及自噬的关系

Abstract

槟榔作为一级致癌物，其与口腔癌的关系受到广泛关注。活性氧（ROS）及自噬水平与肿瘤的发生发展密切相关，研究发现槟榔可诱发细胞内ROS及自噬水平变化。本文结合相关研究进展，对槟榔、细胞内ROS以及自噬之间的关系进行综述。

槟榔是一种重要的中药材，其果实加工后作为一种咀嚼嗜好品被广泛使用，大部分以咀嚼品的形式推向市场。在很多东亚及东南亚国家，槟榔已经成为仅次于尼古丁、乙醇和咖啡因的第四大嗜好物品。国际癌症研究中心曾收集并综合多个国家和地区的流行病学和分子生物学相关研究，认定槟榔果、槟榔咀嚼块为一级致癌物。在流行咀嚼槟榔的国家和地区中，口腔癌（oral cavity cancer）的发病率居高不下。目前槟榔消耗最大的国家是印度；而中国台湾地区亦是咀嚼槟榔嗜好的盛行地[1]。根据中国大陆的相关流行病学研究，在湖南、海南等省份，咀嚼槟榔相当盛行，而随之带来的口腔癌发病率也呈逐年上升的趋势[2]，并有向青少年及周边其他省份蔓延之趋势[2]–[3]。此外，咀嚼槟榔与咽癌、喉癌、食道癌等也有明显相关性[1],[4]。

槟榔的主要生物活性成分是所含的生物碱，占其总质量的0.3%~0.6%。其主要包含4种生物碱，分别为槟榔碱（化学名为N-甲基-1,2,5,6-四氢烟酸甲酯）、槟榔次碱、去甲基槟榔碱以及去甲基槟榔次碱[5]。槟榔成分中还有鞣质、甘露醇、脂肪酸等[6]。

有学者[7]曾对咀嚼槟榔诱导口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）癌变患者的病理及临床生物学行为进行了较大样本的回顾性研究，结果发现OSF癌变组患者在临床及病理学行为上有别于非OSF癌变组，提示OSF病变诱发的口腔癌患者平均发病年龄提前。在临床表现上，OSF发展而来的口腔癌具有更强的侵袭性和转移性等肿瘤生物学行为，通常预后较差。有学者[7]认为由咀嚼槟榔导致的OSF可被看作一种“口腔局部的系统疾病”，并形成了一种独特的疾病“微环境”。在OSF及OSF癌变发展过程中槟榔成分可对口腔内不同细胞施以相应作用。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括一系列含氧高反应性小分子物质，如氧阴离子、含氧自由基和过氧化氢，通常在细胞内短期存在[8]–[9]。ROS可以氧化蛋白质、脂质和DNA等，在氧化应激反应中，可作为一种重要的信号分子，相对过量的ROS可以打破细胞内稳态，调控氧化应激反应介导线粒体功能障碍[9]。自噬（autophagy）在诸如饥饿、缺血/再灌注和病原体感染的应激条件下发生上调，并且可在多种病理状况中失调，包括癌症和神经退行性疾病[8],[10]–[11]。鉴于咀嚼槟榔的行为在我国呈进一步增长态势，而ROS及自噬在疾病发生发展过程中有重要作用[12]，对槟榔与ROS和自噬的关系进行研究总结对OSF及槟榔相关口腔癌这种极具特点的疾病研究应有很好的促进作用。现通过回顾相关文献对槟榔与ROS及自噬的关系作一综述。

1. 槟榔成分与细胞内ROS关系的相关研究进展

细胞内ROS系统参与构成复杂的细胞内“氧化还原”分子调控网络，其功能是保持稳定的氧化还原环境[13]。ROS可抑制细胞的活性并促进细胞发生凋亡；但同时也是很多生理状态下多种信号转导的必要底物，ROS水平的稳定是维持细胞稳态的重要条件[14]–[15]。ROS通过慢性氧化应激反应促进多种病理过程的发展，包括肿瘤的发生发展，已成为肿瘤研究的一个热点[16]–[17]。ROS可促进钙离子从细胞内释放并激活多个信号转导途径，包括钙调蛋白和蛋白激酶C等，这些重要的信号转导过程均参与了肿瘤的进展[18]。多种转录因子也可被ROS激活。转录因子Nrf2可结合Keap1，导致目标蛋白酶体降解；而ROS直接激活蛋白激酶C，促进Nrf2和Keap1的解离，导致Nrf2移位入核。研究[19]–[21]表明，Keap1基因变异或功能失活可以促进肿瘤的生长和产生化疗抵抗。由此可见，ROS信号可与肿瘤的药物抵抗等相关肿瘤生物学特性存在关联。ROS被认为与多种头颈癌的发病机制和治疗过程相关，研究[22]表明，烟草、酒精和槟榔均可通过ROS引起DNA损伤，促进口腔癌变。

研究[23]表明，槟榔提取物（areca nut extract，ANE）可以诱导口腔正常角化上皮细胞内ROS水平上调，同时修饰DNA形成8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG），而8-OHdG参与了多种肿瘤的进程[24]–[25]。用ANE处理口腔鳞状细胞癌细胞可显著增加细胞内ROS水平，刺激丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1（mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1）上调，增强细胞自噬及凋亡水平[26]。槟榔提取液成分中相对分子质量30~100的部分（简称ANE 30-100K）可提高正常口腔黏膜上皮细胞、口腔癌和食管癌细胞中ROS水平[27]–[28]。ANE可以通过ROS途径刺激口腔成纤维细胞分泌多种细胞因子，这些细胞因子可以对口腔黏膜正常上皮施以作用，促进OSF的发生发展。研究[29]发现，使用ROS清除剂，如NAC等，可以有效降低ROS对细胞的损伤，其具有抑制OSF发生发展乃至癌变的潜在作用。ANE除了可以通过ROS介导细胞自噬之外，还可通过ROS途径参与caspase信号介导的细胞凋亡过程[30]–[31]。

在对槟榔成分的研究中，槟榔碱具有很高的关注度，其具有明确的化学结构，较早被提纯并商品化以便于体内外实验研究。作为槟榔成分中最主要的生物碱，槟榔碱可诱导斑马鱼胚胎的染色体畸变和发育迟缓[32]–[33]。槟榔碱在正常口腔角化上皮细胞内调控与氧化应激反应相关的多个基因，而ROS信号是氧化应激相关反应的重要体现形式[28]。槟榔碱在单独刺激细胞时可诱导细胞内ROS水平的上升，通过ROS影响下游多个信号，包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相关分子信号[31]，mTOR在肿瘤的治疗和干预方面发挥重要的调控作用[34]。研究[31]表明，随着槟榔碱的浓度增高，mTOR-1的表达呈逐渐降低的趋势，槟榔碱可通过ROS/mTOR信号通路调节p21和p27的表达，进而对细胞周期加以调控；提示槟榔碱可以通过ROS途径导致DNA的损伤，造成DNA复制过程出错从而促进癌变的发生，揭示了槟榔碱导致口腔癌变的一种潜在机制。

槟榔成分中除了生物碱，亦富含很多无机金属元素成分，其中被广泛关注的便是二价铜离子（Copper-Ⅱ），其在OSF患者口腔黏膜组织及唾液成分中明显提高[35]。有学者[36]通过研究发现，Copper-Ⅱ可与槟榔碱产生协同作用，促进正常口腔黏膜上皮细胞中ROS水平上调，ROS的上调促进了口腔上皮萎缩，并认为Copper-Ⅱ和槟榔碱介导的细胞内ROS上调是导致口腔黏膜上皮萎缩以及恶变的关键因素。

咀嚼槟榔导致的OSF的临床和病理改变并不局限于口腔黏膜的角化上皮层[36]–[38]，针对疾病微环境的研究是目前的热点之一，包括OSF的微环境以及其所导致的口腔癌微环境的研究。咀嚼槟榔导致的OSF具有一个典型的临床表现，即张口受限；OSF患者伴有不同程度的张口受限的病理基础是口腔黏膜上皮下间质细胞发生相应病理改变：包括纤维结缔组织（包括胶原纤维、血管内皮及浸润的免疫细胞）的病理改变[37]。ROS在疾病微环境中的作用也逐渐被广大学者所重视，其与头颈部癌症中细胞免疫作用密切相关[39]。研究[40]–[41]发现，ANE可通过上调T淋巴细胞内ROS水平抑制T淋巴细胞活化并减少γ干扰素（interferon-γ）的生成、分泌。槟榔成分亦可对外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes，PBLs）及白血病来源Jurkat T细胞（Jurkat leukemia T cells）产生类似的作用，上调细胞内ROS水平，即槟榔提取物可以作用于PBLs，导致相关的细胞因子分泌增加，包括炎症细胞因子（inflammatory cytokines）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）1β以及IL-6和IL-8的表达和分泌上调[42]。ANE 30-100K同样对Jurkat T细胞以及PBLs产生相应的作用，上调细胞ROS水平并可诱导自噬性凋亡过程，研究结果提示包括T淋巴细胞在内的多种免疫细胞可作为ANE作用的靶细胞[27]。

在OSF病变中，结缔组织内微血管的损伤也是其典型的病理表现之一，其直接或间接地导致了张口受限的症状[43]–[44]。研究[45]证明，咀嚼槟榔导致的OSF患者黏膜下血管的密度、血管管径及微血管密度均有别于正常口腔黏膜，并在不同病变程度的OSF标本中存在差异；从正常黏膜到癌前病变再到癌症恶变的过程中，血管生成能力不同，提示血管生成能力在槟榔相关口腔癌发生发展过程中具有重要作用。在OSF早期血管生成能力增强，而在疾病的晚期血管生成能力减弱，揭示疾病早期相关炎性因子可以促进微环境中血管生成，而在疾病的中晚期黏膜下表现出的过度纤维化则降低了疾病微环境中的血管生成能力[44]–[45]。在对人内皮细胞系的研究中发现，槟榔碱可改变内皮细胞的细胞周期，促进内皮细胞发生凋亡并具有明显的细胞毒性，提示槟榔成分对内皮细胞的损伤作用可能与其相关疾病如OSF、牙周病及心血管疾病密切相关[46]–[47]。槟榔碱可以刺激人脐静脉内皮细胞发生氧化应激反应，促进ROS水平升高；而血红素氧化酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）可通过ROS途径表达上调。有趣的是，HO-1可对血管组织产生一定的保护作用[46]，这也在一定程度上解释了在OSF发生发展的早期，成血管能力提高的病理改变。伴随HO-1的表达升高，细胞黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）/血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表达同样升高；ROS信号被激活的同时，酪氨酸激酶及丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路在人脐静脉内皮细胞中亦可被槟榔碱激活[48]。

2. 槟榔成分与细胞自噬的相关研究进展

在肿瘤的发生发展以及治疗过程中，自噬表现出了重要的作用，肿瘤细胞的自噬作用可以促进肿瘤发生凋亡同时又赋予肿瘤细胞抵抗“恶劣环境”的能力，自噬可被认为是一把“双刃剑”[11],[49]–[50]。自噬过程可看成是一种细胞对环境的自我适应能力而不单纯是一种凋亡前表现[51]，普遍认为自噬是肿瘤治疗过程中的潜在作用靶点[49]。自噬与食道恶性肿瘤及乳腺癌化疗过程中的耐药性有密切相关作用，阻断肿瘤的自噬过程可以有效提高化疗药物对肿瘤治疗的敏感性[33],[52]。在头颈部鳞状细胞癌中，自噬和细胞凋亡可由共同的上游信号触发，导致细胞自噬和细胞凋亡的联合发生，促进了有凋亡缺陷的永生化上皮细胞产生，使其具有致瘤性[33]。研究[33]证实，多种与头颈部鳞状细胞癌密切相关的致癌因素可以激活自噬的上游信号。

槟榔成分可以上调细胞自噬水平最先由学者在2008年提出并加以证明，即槟榔成分可使正常口腔上皮细胞及口腔鳞状细胞癌细胞上调自噬水平[26]；其中ANE 30-100K亦可以有效地诱导正常及恶性上皮细胞发生自噬[27]。在对人口腔成纤维细胞的研究中，原始槟榔成分以及ANE 30-100K可以通过ROS途径介导成纤维细胞上调细胞自噬水平[12],[48]。在槟榔成分上调细胞自噬的过程中，ROS起到关键作用。研究同时表明，槟榔成分尤其是ANE 30-100K，可以在不同细胞系中上调细胞自噬水平，并且影响自噬上游的信号通路和自噬相关肿瘤生物学行为。通过运用化学抑制剂以及shRNA干扰技术，抑制Atg5或Beclin-1可以明显减弱ANE 30-100K对多种细胞系产生的促自噬作用（包括口腔癌细胞系OECM-1、SCC-15、SCC-25及食管癌上皮细胞系CE81T/VGH和Jurkat T细胞系），证明Atg5及Beclin-1是ANE 30-100K上调自噬水平过程中的关键分子。此外，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）可以作为细胞外调节激酶的上游信号，调控ANE 30-100K对Jurkat T细胞的自噬作用；阻断细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路可在Jurkat T/OECM-1/CE81T/VGH细胞中有效降低槟榔所导致的自噬水平[48],[53]。

值得一提的是，槟榔成分可对mTOR磷酸化的抑制具有双向作用，即可以同时调控细胞凋亡和自噬。原始槟榔成分、ANE 30-100K和槟榔碱均可以抑制mTOR的磷酸化，其中原始槟榔成分和ANE 30-100K可通过抑制mTOR磷酸化促进细胞发生自噬；而单纯槟榔碱虽然可以有效抑制细胞内mTOR磷酸化，但并不能通过抑制mTOR磷酸化而进一步上调自噬水平[12]。故而，槟榔碱虽然诱导细胞发生氧化应激反应，提升细胞内ROS水平而使细胞发生凋亡，但其不能直接上调细胞自噬水平，槟榔碱需要联合其他槟榔成分才可有效上调细胞自噬。

高浓度的槟榔提取物对细胞有明显的毒性作用，为更好地在体外模拟咀嚼槟榔的作用，研究人员选择运用低毒剂量的ANE长期刺激细胞来设置体外细胞模型[54]–[56]。在低血清培养的环境中，长时间低浓度ANE处理的恶性肿瘤细胞可表现出较强的生存能力，提示在恶劣环境中，槟榔成分上调的细胞自噬水平可能对细胞具有保护作用[52]。采用低浓度ANE刺激口腔鳞状细胞癌细胞系以及白血病来源的T淋巴细胞系后，发现肿瘤细胞对常见化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶产生化疗抵抗。细胞内 LC3-Ⅱ表达上调证明低毒浓度的槟榔刺激条件下，细胞自噬水平升高；运用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）以及氯喹（chloroquine，CQ）可以有效抑制ANE对肿瘤细胞产生的促自噬作用，并在一定程度上逆转肿瘤细胞对化疗药物的抵抗作用，提示槟榔成分上调细胞自噬的过程可在肿瘤化疗抵抗中发生作用[56]–[57]。近期的研究[54]表明，利用ANE对口腔鳞状细胞癌细胞系进行慢性低毒刺激后，肿瘤细胞对顺铂耐药性获得提升且与自噬和ROS水平密切相关，其中AMPK信号通路在其中起关键作用。

鉴于自噬在肿瘤治疗尤其是化疗抵抗中的重要性已被广泛认可[33],[58]，认为在咀嚼槟榔相关的口腔恶性肿瘤中，由于细胞自噬水平上升，肿瘤的生物学特性会有相应改变，尤其是耐药和耐低氧的能力可能有别于其他原因（如烟酒嗜好、人乳头瘤感染以及不良义齿机械刺激等）相关的口腔恶性肿瘤。槟榔成分引起自噬和化疗耐药的关系及相关分子机制的研究仍是相关热点之一，并将对临床中咀嚼槟榔相关口腔癌治疗方案的选择具有积极的指导作用。

针对肿瘤免疫的研究是近年来癌症研究的热点之一，在对口腔鳞状细胞癌患者组织标本的研究中发现，自噬相关指标（LC3、Beclin-1以及p62）与肿瘤间质中的免疫相关指标存在明显关联，推测口腔鳞状细胞癌中的自噬水平可与肿瘤微环境中的免疫作用存在相互作用，但具体机制尚不明确[59]。相关研究的深入探索，可以帮助挖掘槟榔相关口腔癌的肿瘤免疫特点，揭示槟榔相关口腔癌免疫逃逸的机制。

综上所述，槟榔成分可以有效促进口腔正常细胞（包括口腔角化上皮细胞及间质细胞）以及肿瘤细胞内ROS及自噬水平的增高；槟榔介导的ROS和自噬水平变化可以诱发细胞的生物学行为发生相应改变，可与槟榔相关口腔癌的化疗耐药有较强的相关性。针对槟榔成分和细胞内ROS及自噬关系的进一步探究对OSF及咀嚼槟榔相关口腔癌的基础研究和临床诊治具有积极作用。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金（81901016）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81901016).