microRNA-125b在舌鳞状细胞癌中的表达及意义

Abstract

Objective

The expression of microRNA-125b in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) was detected and analyzed for its relationship with the clinicopathological features of TSCC.

Methods

Real time fluorescence-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the expression of microRNA-125b in 35 TSCC tissues and adjacent normal tissues from 35 TSCC cases. The relationship between the expression of microRNA-125b in TSCC tissues and the clinicopathological features of patients with TSCC was analyzed. In situ hybridization (ISH) was used to detect the expression level of microRNA-125b gene in the TSCC tissues and adjacent normal tissues.

Results

RT-qPCR results showed that the relative expression levels of microRNA-125b in the TSCC issues was 2.32±0.69, and that of normal tissues was 0.87±0.32. The statistical results showed that the expression level of microRNA-125b was significantly higher in the TSCC tissues than in the normal tissues (P<0.001). The expression level of microRNA-125b in the TSCC tissues was not significantly correlated with age, gender, pathological grade, and lymph node metastasis but was positively correlated with TNM stage. Patients with high TNM stage had high microRNA-125b expression levels (P<0.05). The ISH results showed that the expression levels of microRNA-125b in the TSCC tissues were 0.010±0.003, and that of normal tissues was 0.004±0.001. The expression levels of microRNA-125b in the 35 TSCC tissues were significantly higher than those in the normal tissues (P<0.05).

Conclusion

MicroRNA-125b is highly expressed in TSCC and associated with TNM stage, suggesting that high microRNA-125b expression may be involved in the development of TSCC.

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔颌面部最常见的肿瘤[1]–[4]，约占口腔颌面部恶性肿瘤的50%~60%，全身恶性肿瘤的0.8%~ 2%，每年威胁着近50万人的生命[5]。TSCC经常导致患者咀嚼、言语和吞咽功能障碍，其恶性程度较高，侵袭性强，极易发生颈淋巴结远处转移[6]–[9]。近年来手术、放化疗水平已经取得巨大进步，但由于较高的局部区域性复发和颈部淋巴结转移，与过去的30年相比，患者的预后并没有得到提高[10]。随着分子生物学的发展，研究[11]–[14]发现，微小RNA在许多生理和病理过程中起着至关重要的作用，包括发育和细胞增殖、凋亡、侵袭、代谢等。实验[15]表明，多种类型的微小RNA分子通过沉默或者抑制癌基因表达的方式，参与到癌细胞生物程序的调控之中。有研究[16]发现，不同肿瘤中microRNA-125b的表达不同；还有研究[17]证实，口腔鳞状细胞癌中microRNA-125b可起到抑癌基因作用，在癌细胞中表达下调。Brito等[18]发现，在约80.0%的口腔和口咽肿瘤样本与非肿瘤样本中的microRNA-125b表达相近，microRNA-125b表达上调患者的总体生存率更高，但该结果未达到统计学意义。尽管如此，microRNA-125b仍然被认为能调节细胞增殖和凋亡。在同样是口腔鳞状细胞癌范畴的TSCC中，microRNA-125b的表达情况国内外鲜见公开报道。本实验通过实时荧光定量聚合酶链反应（real time fluorescence-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）及原位杂交（in situ hybridization，ISH）技术检测TSCC及对应的癌旁正常组织中microRNA-125b的表达情况，并分析其与临床病理的相关性。

1. 材料和方法

1.1. 临床标本

收集自2016年8月—2018年1月在新疆维吾尔自治区人民医院口腔颌面外科手术切除的TSCC组织及相对应的癌旁正常组织（距离切缘>2 cm）共计35例，其中男性10例，女性25例，从34~75岁不等，平均年龄为（57.8±6.2）岁。患者术前无长期服用非甾体类抗炎药物史，无其他同时存在的恶性肿瘤，未进行放化疗及免疫治疗。术后标本经病理科进行病理学诊断，明确诊断为TSCC，其中高分化16例，中分化10例，低分化9例，癌旁组织经病理诊断为正常组织。参照2002年国际抗癌联盟制订的口腔癌TNM分期标准进行病理分级分期。

1.2. 主要试剂

RT-qPCR主要试剂：Rneasy MiNi Kit RNA提取试剂盒、miScript Ⅱ RT Kit逆转录试剂盒、miScript SYBR® Green PCR Kit扩增试剂盒、microRNA-125b特异性引物、U6内参均购自德国Qiagen公司。ISH主要试剂：石蜡、无水乙醇、二甲苯、十二烷基磺酸钠、乙二胺四乙酸二钠、醋酸酐、三乙醇胺、聚乙烯毗铬烷酮均购自上海国药集团化学试剂有限公司，焦炭酸二乙酯购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，二硫苏糖醇、去离子甲酰胺、聚蔗糖均购自韩国BIOSHARP公司，鲑鱼精DNA购自美国Sigma-aldrich公司，蛋白酶K购自瑞士Roche公司，甘氨酸购自德国Biofroxx公司。探针名称为HSA-MIR-125B-5P，其序列（5′—3′）为/5DiGN/CACAAGTTAGGGTCTCAGGGA/3DiGN/。

1.3. RT-qPCR实验

取60 mg冻存的TSCC组织及癌旁正常组织，液氮研磨至粉末，刀片刮到EP管中。加入700 µL QIAzol Lysis后充分匀浆，按照Rneasy MiNi Kit RNA提取试剂盒说明书步骤提取TSCC组织及癌旁正常组织的总RNA，并用分光光度仪进行浓度和纯度的检测，计算在反转录中的使用量。

将提取的总RNA置于冰上，按5×miScript HiFlex Buffer 4 µL，10×miScript核酸混合物2 µL，无酶无菌水Variable，miScript逆转录酶混合物2 µL，Template RNA Variable（根据无酶无菌水的量来配置），配置反转录体系，总体积为20 µL。加RNA，轻柔混匀，简单离心，放于冰上，37 °C孵育60 min，然后置于95 °C 5 min以灭活酶，加30 µL水稀释后用于RT-qPCR扩增。引物序列由德国Qiagen公司提供，反应总体系为20 µL，在QIAGEN RGQ5 PLUS HRM仪上扩增。反应程序为：95 °C预变性15 min，进入循环，94 °C变性15 s，55 °C退火30 min，70 °C延伸30 s，采集荧光，共40个循环；60~95 °C融解，将内参调整为U6，用2^−ΔΔCT相对定量法检测不同组织microRNA-125b表达的差异，每个样本3个重复孔。

1.4. ISH实验

所有TSCC组织及癌旁组织经4%甲醛溶液固定，组织经常规脱水透明浸蜡后包埋于石蜡块中，切面在冻台上冷冻几分钟后，用切片机切片，切片厚度控制在4 µm，将切好的切片贴附于载玻片上，于60 °C烤箱烤片3 h。先后用二甲苯、无水乙醇、蒸馏水将切片进行脱蜡处理。脱蜡后的切片用 0.1 mol·L⁻¹磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PB）漂洗3次，每次5 min。加入0.3% Triton X-100-0.1 mol·L⁻¹ PB中15 min，去污，1 µg·mL⁻¹蛋白酶K消化30 min（37 °C）。4%多聚甲醛（加0.1 mol·L⁻¹ PB液配制）室温下终止消化和再固定5 min。0.1 mol·L⁻¹ PB（pH=7.2）冲洗3次，每次5 min，0.25%醋酸酐处理10 min。分别采用4×柠檬酸钠缓冲液（saline sodium citrate，SSC）漂洗 5 min，2×SSC漂洗10 min，滴加预杂交液（不含探针）于切片上，密封湿盒内45 °C下预杂交2 h。杂交液配制如下：在杂交缓冲液中加入适量地高辛标记microRNA-125b探针，使探针终浓度为0.5~1 µg·mL⁻¹，将混匀后的杂交液滴加在切片上（覆盖组织），或将切片漂浮于杂交液中，于密封湿盒内45 °C下杂交24 h。杂交后冲洗：5×SSC液漂洗15 min（45 °C）；4×SSC漂洗15 min（37 °C）；2×SSC（含50%去离子甲酰胺）漂洗15 min（37 °C）；1×SSC（含20 µg·mL⁻¹ RNaseA）冲洗15 min（37 °C）；0.5×SSC冲洗15 min（37 °C）；0.01 mol·L⁻¹PBS液室温漂洗3次，每次5 min。显示：碱性磷酸酶标记地高辛抗体Fab片段室温下孵育4 h；0.01 mol·L⁻¹PBS漂洗4次，每次5 min；TSM1漂洗2次，每次5 min；TSM2漂洗2次，每次5 min；氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP）显色液中室温下显色0.5~2 h，显微镜下观察显色情况以决定终止或延长显色时间；0.01 mol·L⁻¹ PBS冲洗2次，每次5 min；明胶甘油封片，二甲苯透明，树脂封片。

1.5. 统计学分析

使用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，年龄与表达量的关系采用相关性分析，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. TSCC组织及癌旁正常组织microRNA-125b的表达差异

RT-qPCR结果显示，TSCC组织中microRNA-125b的相对表达量为2.32±0.69，癌旁正常组织中microRNA-125b的相对表达量为0.87±0.32，经统计学分析，TSCC组织中microRNA-125b的表达显著高于癌旁正常组织（t=11.099，P<0.001）。

2.2. microRNA-125b表达与临床病理特征的相关性

35例TSCC中microRNA-125b的相对表达量为2.32±0.69，与年龄、性别、病理分级和淋巴结转移无明显相关性，而与TNM分期呈明显正相关，TNM分期越高，其microRNA-125b的相对表达量越高（表1）。

表 1. TSCC microRNA-125b表达与临床病理特征的关系.

Tab 1 Relationship between the expression of TSCC microRNA-125b and the clinicopathological features

临床特征		例数	TSCC表达量	统计量	P值
年龄/岁		57.86±6.29＃	2.32±0.69	−0.157Δ	0.367
性别	男	10	2.34±0.90	0.261	0.796
	女	25	2.26±0.82
淋巴结转移	有	24	2.41±0.82	0.401	0.691
	无	11	2.28±0.91
TNM分期	Ⅰ+Ⅱ	14	1.88±0.76	2.615	0.013*
	Ⅲ+Ⅳ	21	2.61±0.83
组织分化程度	低	9	2.28±0.85	0.044ΔΔ	0.957
	中	10	2.28±0.89
	高	16	2.37±0.92

注：^＃项目为35例患者的年龄均数；^Δ代表相关性分析，^ΔΔ代表单因素方差分析，其余为配对样本t检验；*P<0.05。

2.3. ISH结果与分析

NBT和BCIP显色液显色后，用microRNA-125b探针杂交的细胞质内呈紫蓝色反应产物，microRNA-125b在TSCC组织中上调（图1）。用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量染色信号密度，35例患者的癌组织平均密度为0.010±0.003，而癌旁正常组织的平均密度为0.004±0.001。该结果表明与其癌旁正常组织相比，TSCC组织中microRNA-125b表达水平增高（P<0.05）。

图 1. TSCC及癌旁正常组织中microRNA-125b的表达 ISH.

Fig 1 Expression of microRNA-125b in the TSCC tissues and adjacent normal tissues ISH

A：TSCC组织 × 100；B：TSCC组织 × 400；C：同一患者癌旁组织 × 100；D：同一患者癌旁组织 × 400。

3. 讨论

舌癌是口腔颌面部常见恶性肿瘤之一，常发于舌缘，其次为舌尖和舌背，位于舌前2/3的为口腔癌范畴，多为鳞状细胞癌。临床上TSCC的治疗方法仍然是以手术治疗为主，辅助阳性切缘和静脉、淋巴或神经浸润的检测，术后联合放化疗的综合治疗[19]。然而舌体组织具有丰富的淋巴和血液循环，且舌体活动频繁，使其具有早期转移和局部复发的特点[20]。随着医学科技的不断进步，治疗舌癌的手段和水平不断得到发展，但由于TSCC较高的转移和复发率，对晚期TSCC和无法耐受手术及术后放化疗的患者缺乏有效的治疗手段，导致患者术后5年生存率并没有得到显著提高[21]，因此研究TSCC的发生和发展机制对于预防和治疗来说至关重要。从目前研究看来，TSCC的发病机制较为复杂，有环境因素作用，有局部刺激因素作用，有自身免疫体质因素，也有基因突变因素等。随着分子生物学的发展，微小RNA的发现，使人们对疾病的研究又有了新的微观视角。

微小RNA是约22个核苷酸的非编码单链RNA，通过与靶mRNA的30个非翻译区（30UTR）结合，抑制mRNA翻译或降解mRNA分子来调节表达[22]。目前已经发现，通过调控人类基因表达水平的变化可影响人类的发育及疾病的发生发展[23]–[26]。微小RNA在人类恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，在已发现的各种不同类型肿瘤中存在异常表达[27]，支持其具有显性或隐性癌基因的功能[28]；其中microRNA-125b在头颈部恶性肿瘤的发生发展中起到重要的作用，能在转录水平调控基因的表达[29]。microRNA-125b主要通过作用于细胞的增殖、分化和凋亡等，直接影响肿瘤的发生发展。作为一种抑癌基因，microRNA-125b在皮肤鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）、软骨肉瘤、黑素瘤、肝癌及白血病中表达下调[17]。He等[30]的研究发现，microRNA-125b在卵巢癌组织中低表达，通过在卵巢癌细胞中过表达microRNA-125可以抑制肿瘤诱导的血管生成，从而促进卵巢癌细胞凋亡，这与人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和人类表皮生长因子受体3（human epidermal growth factor receptor-3，HER3）的表达密切相关。Zhao等[31]检测了膀胱癌患者癌组织以及癌旁正常组织中microRNA-125b的表达，结果发现，microRNA-125b在肿瘤组织中的表达低于正常组织。Shiiba等[32]报道，在OSCC衍生的细胞系和OSCC样品中microRNA-125b的下调表达，可以降低OSCC衍生的细胞增殖率，并且可以增强放射敏感性和减少细胞间黏附分子-2（intercellular cell adhesion molecule 2，ICAM2）-mRNA的表达；此外，microRNA-125b表达与OSCC肿瘤分期和生存相关。阎文婷等[33]发现，在胃癌组织中microRNA-125b表现为高表达，且在胃癌细胞系中过表达microRNA-125b后，胃癌细胞的增殖能力显著增加，同时细胞凋亡也明显受到抑制。

目前认为，microRNA-125b在OSCC中为抑癌基因作用，但其作用尚存争议。笔者结合本地区TSCC的现况，探讨TSCC组织中microRNA-125b的表达情况。本研究采用RT-qPCR法对35例TSCC及其相应癌旁正常组织样本中的microRNA-125b的相对表达量进行检测，并进行对比分析，结果发现，TSCC组织中的microRNA-125b的相对表达量较癌旁正常组织显著增高。对TSCC中microRNA-125b的表达与年龄进行相关性分析，发现microRNA-125b的表达与年龄无明显相关性（P>0.05）；将10例男性和25例女性TSCC组织中microRNA-125b的相对表达量进行分析，发现其表达与性别也无明显相关性（P>0.05）。此外，本研究还证实，microRNA-125b表达与肿瘤分化程度和有无淋巴结转移也无明显相关性，但与肿瘤的TNM分期有相关性，TNM分期越高，肿瘤的恶性程度越高，microRNA-125b表达量亦越高。ISH是通过带有标记物的核酸探针来检测待测组织中核酸的表达及分布情况，是定性分析微小RNA表达的方法之一。本研究通过ISH发现，相对于癌旁组织，TSCC组织中microRNA-125b表达明显上调。本研究初步证明了microRNA-125b在TSCC组织是有表达且高表达的，提示microRNA-125b在TSCC发病中起促癌基因的作用，与microRNA-125b在OSCC中起抑癌基因作用的报道相反。笔者认为，OSCC是一个很大范畴的疾病，包括颊黏膜、上下牙龈、硬腭和舌等多个部位的鳞状细胞癌，在不同的解剖分区microRNA-125b的表达及作用可能会有不同。细胞增殖、分化及凋亡异常会导致肿瘤的发生，而侵袭和迁徙功能的紊乱会导致淋巴转移和复发。microRNA-125b通过调控作用于上下游相关蛋白形成一个巨大的调控网络，具体的调控作用机制仍需进一步的研究去证实。

Funding Statement

[基金项目] 新疆维吾尔自治区自然科学基金（2016D01C099）

Supported by: Xinjiang Uygur Autonomous Region Natural Science Fund (2016D01C099).