Abstract
目的
探究黏着斑激酶抑制剂TAE226对人口腔鳞状细胞癌细胞上皮间质转化（EMT）过程的影响。
方法
不同浓度（0、1、5、10 µmol·L−1）的TAE226作用于人口腔鳞状细胞癌HSC-3和HSC-4细胞24、48、72 h后，实时定量聚合酶链反应检测EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达；蛋白质印迹法检测E-cadherin、Vimentin在TAE226作用48 h后的蛋白表达。
结果
实时定量聚合酶链反应检测表明，随着TAE226作用时间和浓度的增加，E-cadherin mRNA的表达增加，Vimentin mRNA的表达降低（P<0.05）。蛋白质印迹法检测表明，随着TAE226浓度的增加，E-cadherin蛋白的表达增加，Vimentin蛋白的表达降低（P<0.05）。
结论
TAE226能有效抑制人口腔鳞状细胞癌细胞株的EMT进程，有望成为治疗口腔鳞状细胞癌的有效药物之一。
Keywords: 黏着斑激酶抑制剂TAE226, 上皮间质转化, 口腔鳞状细胞癌
Abstract
Objective
To study the effect of the focal adhesion kinase inhibitor TAE226 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human oral squamous cell carcinoma (OSCC) cell line.
Methods
HSC-3 and HSC-4 cells were cultured with TAE226 under different concentrations (0, 1, 5, and 10 µmol·L−1) for 24, 48, and 72 h. Real-time quantitative polymerase chain reaction was performed to detect the mRNA expressions of E-cadherin and Vimentin. The protein expressions of E-cadherin and Vimentin were determined by Western blot assay after 48 h of TAE226 treatment.
Results
Real-time quantitative polymerase chain reaction showed that increasing the TAE226 dose and reaction time resulted in increased and decreased E-cadherin and Vimentin mRNA expressions, respectively (P<0.05). Western blot assays showed that increasing the TAE226 dose resulted in increased and decreased E-cadherin and Vimentin protein expressions, respectively (P<0.05).
Conclusion
TAE226, which is expected to be an effective drug for OSCC treatment, can effectively inhibit the EMT of the OSCC cell line.
Keywords: focal adhesion kinase inhibitor TAE226, epithelial-mesenchymal transition, oral squamous cell carcinoma
黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，通过整合来自胞外的压力、细胞黏着等方面的信号，参与肿瘤的增殖、迁移、侵袭和血管再生等有关的多条信号传导通路，目前已成为肿瘤诊断的分子标志物和恶性肿瘤治疗的重要靶点[1]–[2]。TAE226是一种针对FAK的强效抑制剂，可以有效阻断FAK信号通路[3]。随着研究的深入，人们发现TAE226对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）具有明显的抗增殖、迁移和侵袭作用，但对发生在OSCC细胞转移阶段的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程的作用尚不清楚。本研究采用实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和蛋白质印迹法（Western blot），探究TAE226在OSCC细胞EMT过程中的作用及其意义。
1. 材料和方法
1.1. 实验材料
人OSCC HSC-3、HSC-4细胞株（由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供）。TAE226（上海蓝木化工有限公司），优质胎牛血清、PBS缓冲液（北京索莱宝生物科技有限公司），DMEM高糖培养基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司），DMSO（AMRESCO公司，美国），RNA提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司），逆转录试剂（TOYOBO公司，日本），QuantiFast SRBR Green PCR Kit（QIAGEN公司，德国），Anti-E-cadherin抗体、Anti-Vimentin抗体（Abcam公司，英国），二抗（北京博奥森生物技术有限公司），电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）检测试剂盒（Millipore公司，美国）。
1.2. 实验方法
1.2.1. TAE226的配置及实验分组
用10.67 mL DMSO溶解5 mg TAE226，配成浓度为1 mmol·L−1的TAE226母液，分装后于-20 °C冰箱中保存。临用前按比例用培养液将其稀释，并使其中DMSO液的含量低于0.1%。本实验将1、5、10 µmol·L−1浓度的TAE226培养液作为实验组，将不含TAE226（0 µmol·L−1）的培养液作为对照组。
1.2.2. 细胞培养和铺板
HSC-3、HSC-4细胞株由含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养液常规培养，每2天换液1次，待细胞融合度80%~90%时，消化传代。将对数生长期的HSC-3细胞制备成细胞浓度为3×105个·mL−1的细胞悬液，按每孔2 mL接种于六孔板内。培养24 h至贴壁后，弃原培养液，PBS液洗2遍后分别加入含TAE226 0、1、5、10 µmol·L−1的培养液每孔3 mL，摇匀置于37 °C、5%CO2孵箱中培养，培养24、48、72 h时用于EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）mRNA的检测，并对培养48 h的细胞进行E-cadherin和Vimentin蛋白检测。
1.2.3. 实时定量PCR检测
按RNA提取试剂盒的操作说明进行操作。分别在HSC-3和HSC-4细胞培养24、48、72 h时将其取出，置于显微镜下观察其生长情况并拍照，用PBS液洗2遍，按每孔1 mL向六孔板中加入Trizol液以裂解细胞，提取总RNA，并于微量分光光度计上检测RNA的纯度及浓度，逆转录合成cDNA，进而扩增E-cadherin和Vimentin的mRNA。反应体系：总RNA模板2 µL（1 µg），蒸馏水6.4 µL，SRBR Green Real time PCR Master Mix 10 µL，上游引物0.8 µL，下游引物0.8 µL。设置2个复孔，扩增条件为：95 °C预变性30 s，95 °C变性30 s，57 °C退火10 s，72 °C延伸15 s，共40个循环。实时定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成（表1）。以目的基因的相对表达量（2−ΔΔCT）计算出各基因相对表达水平，其中ΔCT=CT目的基因−CT内参基因，ΔΔCT=ΔCT实验组−ΔCT对照组。
表 1. 引物序列和产物.
Tab 1 Sequences of primers and products
| 引物名称 | 引物序列（5'-3'） | 片段大小/bp |
| GAPDH | F-GACAGTCAGCCGCATCTTCT | 395 |
| R-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC | ||
| E-cadherin | F-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA | 106 |
| R-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC | ||
| Vimentin | F-CTCTCAAAGATGCCCAGGAG | 176 |
| R-GCACGATCCAACTCTTCCTC |
1.2.4. Western blot检测
培养HSC-3和HSC-4细胞48 h后取出六孔板于显微镜下观察细胞生长情况，拍照，将其用PBS液洗2遍，按每孔250 µL向六孔板中加入蛋白裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，在蛋白液内加入适量的5×蛋白上样缓冲液（蛋白液︰5×蛋白上样缓冲液为4︰1），95~100 °C干锅浴5 min进行变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶、转至PVDF膜。脱脂牛奶室温封闭2 h，4 °C孵育一抗过夜，TBST漂洗PVDF膜5次，每次5 min。室温孵育二抗1 h，TBST洗膜。ECL混合溶液避光孵育1 min，置于凝胶成像系统成像拍照。将拍摄的图片保存，用AlphaEase FC软件测量灰度值，并计算蛋白相对表达量。将目的蛋白的光密度值/内参的光密度值的比值作为目的蛋白的相对表达丰度。
1.3. 统计分析
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。多因素多组间的比较采用重复变量的方差分析，单因素多组间的比较采用单因素方差分析。
2. 结果
2.1. HSC-3和HSC-4细胞在TAE226作用下细胞形态的变化
对照组细胞生长快速，彼此紧密贴壁生长，细胞呈短梭形或菱形，细胞膜和细胞核清晰可见，胞质饱满且透亮。加入了TAE226的HSC-3/HSC-4细胞培养后，随着TAE226浓度不断增加，细胞体积逐渐皱缩变小，细胞膜边界不清，细胞固缩成圆形、长梭形、椭圆形或镂空状，最后呈蜂窝样空洞性连接并出现大量脱落漂浮细胞，基本上无贴壁细胞（图1）。
图 1. 不同浓度的TAE226干预72 h后的HSC-3、HSC-4细胞 显微镜 × 200.
Fig 1 HSC-3 and HSC-4 cells were observed after 72 h intervention with TAE226 at different concentrations microscope × 200
上：HSC-3细胞；下：HSC-4细胞。从左到右TAE226的浓度依次为0、1、5、10 µmol·L−1。
2.2. TAE226作用下HSC-3和HSC-4细胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表达
TAE226作用下HSC-3细胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表达见表2、3。从表2、3可见，1）除对照组（0 µmol·L−1 TAE226）在TAE226作用24 h和48 h时，E-cadherin mRNA的表达无统计学差异外，其他不同浓度和不同时间的比较均有统计学差异（P<0.05），E-cadherin mRNA的表达随TAE226作用时间和浓度的增加而表达增加。2）对照组Vimentin mRNA的表达随时间增加而升高（P<0.05），实验组Vimentin mRNA的表达低于对照组（P<0.05），且随时间和浓度的增加而表达降低（P<0.05）。
表 2. TAE226作用下HSC-3细胞的E-cadherin mRNA表达.
Tab 2 The relative expression of E-cadherin mRNA in HSC-3 cells with TAE226
| TAE226浓度/µmol·L−1 | 作用时间 |
||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 0 | 1.00±0.25aA | 1.01±0.10aA | 0.80±0.13bA |
| 1 | 1.98±0.66aB | 3.77±0.34bB | 6.41±0.16cB |
| 5 | 4.15±0.02aC | 8.08±0.12bC | 14.52±0.97cC |
| 10 | 10.10±0.84aD | 11.18±0.09bD | 20.58±0.32cD |
注：组内变量和组间变量交互作用F=13.649，P<0.05，二者存在交互作用。同一浓度不同时间比较，F=201.930，P=0.000；进一步两两比较，a、b、c、d字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。同一时间不同浓度比较，F=145.796，P=0.000；进一步两两比较，A、B、C、D字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。
表 3. TAE226作用下HSC-3细胞Vimentin mRNA的表达.
Tab 3 The relative expression of Vimentin mRNA in HSC-3 cells with TAE226
| TAE226浓度/µmol·L−1 | 作用时间 |
||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 0 | 1.01±0.18aA | 1.61±0.12bA | 3.16±0.97cA |
| 1 | 0.90±0.13aB | 0.75±0.06bB | 0.55±0.21cB |
| 5 | 0.76±0.44aC | 0.51±0.03bC | 0.15±0.29cC |
| 10 | 0.25±0.18aD | 0.11±0.05bD | 0.08±0.00cD |
注：组内变量和组间变量交互作用F=55.420，P<0.05，二者存在交互作用。同一浓度不同时间比较，F=9.630，P=0.000；进一步两两比较，a、b、c、d字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。同一时间不同浓度比较，F=220.215，P=0.000；进一步两两比较，A、B、C、D字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。
TAE226作用下HSC-4细胞E-cadherin和Vimentin mRNA的表达见表4、5。从表4、5可见，1）对照组E-cadherin mRNA的表达随着时间增加而降低（P<0.05），实验组E-cadherin mRNA的表达高于对照组（P<0.05），且随TAE226作用时间和浓度的增加而表达增加（P<0.05）。2）对照组Vimentin mRNA的表达随着时间增加而增加（P<0.05），除实验组1 µmol·L−1 TAE226作用24 h时Vimentin mRNA的表达与对照组无统计学差异外，其他不同浓度和不同时间的比较均具有统计学差异（P<0.05），实验组Vimentin mRNA的表达低于对照组，且随时间和浓度的增加表达降低（P<0.05）。
表 4. TAE226作用下HSC-4细胞E-cadherin mRNA的表达.
Tab 4 The relative expression of E-cadherin mRNA in HSC-4 cells with TAE226
| TAE226浓度/µmol·L−1 | 作用时间 |
||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 0 | 1.01±0.18aA | 0.71±0.09bA | 0.68±0.08cA |
| 1 | 1.40±0.10aB | 3.20±0.36bB | 10.01±0.29cB |
| 5 | 2.15±0.50aC | 11.42±1.22bC | 23.65±1.07cC |
| 10 | 3.70±0.34aD | 16.68±0.53bD | 27.08±1.02cD |
注：组内变量和组间变量交互作用F=51.639，P<0.05，二者存在交互作用。同一浓度不同时间比较，F=17.833，P=0.000，进一步两两比较，a、b、c、d字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。同一时间不同浓度比较，F=616.630，P=0.000，进一步两两比较，A、B、C、D字母相同为无统计学差异字母不同为有统计学差异（P<0.05）。
表 5. TAE226作用下HSC-4细胞Vimentin mRNA的表达.
Tab 5 The relative expression of Vimentin mRNA in HSC-4 cells with TAE226
| TAE226浓度/µmol·L−1 | 作用时间 |
||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 0 | 0.98±0.10aA | 1.87±0.38bA | 3.22±0.65cA |
| 1 | 0.97±0.32aA | 0.73±0.68bB | 0.45±0.17cB |
| 5 | 0.75±0.27aB | 0.41±0.07bC | 0.20±0.09cC |
| 10 | 0.45±0.21aC | 0.07±0.20bD | 0.04±0.01cD |
注：组内变量和组间变量交互作用F=41.108，P<0.05，二者存在交互作用。同一浓度不同时间比较，F=17.576，P=0.000，进一步两两比较，a、b、c、d字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。同一时间不同浓度比较，F=106.251，P=0.000，进一步两两比较，A、B、C、D字母相同为无统计学差异，字母不同为有统计学差异（P<0.05）。
2.3. TAE226作用下HSC-3、HSC-4细胞E-cadherin、Vimentin蛋白的表达
TAE226作用下HSC-3、HSC-4细胞的E-cadherin、Vimentin蛋白表达见图2、3和表6、7。HSC-3、HSC-4细胞的E-cadherin蛋白的表达随TAE226浓度的增加而增加（P<0.05），Vimentin蛋白的表达随TAE226浓度的增加而降低（P<0.05）。表明，TAE226对HSC-3细胞和HSC-4细胞的E-cadherin的蛋白表达有促进作用，对Vimentin的蛋白表达有抑制作用，且该效应具有剂量依赖性。
图 2. Western blot检测HSC-3细胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表达.
Fig 2 Level of E-cadherin and Vimentin protein expression in HSC-3 cells by Western blot
1~4分别为0、1、5、10 µmol·L−1的TAE226。
图 3. Western blot检测HSC-4细胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表达量.
Fig 3 Level of E-cadherin and Vimentin protein expression in HSC-4 cells by Western blot
1~4分别为0、1、5、10 µmol·L−1的TAE226。
表 6. HSC-3细胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表达（灰度比值）.
Tab 6 Grayscale ratio of E-cadherin and Vimentin protein in HSC-3 cells
| TAE226浓度/µmol·L−1 | E-cadherin | Vimentin |
| 0 | 0.63±0.15 | 1.54±0.02 |
| 1 | 0.95±0.04 | 1.12±0.12 |
| 5 | 1.13±0.02 | 0.79±0.19 |
| 10 | 1.28±0.10 | 0.57±0.15 |
注：不同浓度E-cadherin蛋白比较，F=15.683，P=0.001，进一步两两比较，各组间均有统计学差异（P<0.05）。不同浓度Vimentin蛋白比较，F=18.745，P=0.001，进一步两两比较，各组间均有统计学差异（P<0.05）。
表 7. HSC-4细胞E-cadherin及Vimentin蛋白的表达（灰度比值）.
Tab 7 Grayscale ratio of E-cadherin and Vimentin protein in HSC-4 cells
| TAE226浓度/µmol·L−1 | E-cadherin | Vimentin |
| 0 | 0.57±0.12 | 1.39±0.12 |
| 1 | 0.95±0.04 | 1.13±0.03 |
| 5 | 1.17±0.47 | 0.96±0.04 |
| 10 | 1.34±0.06 | 0.51±0.27 |
注：不同浓度E-cadherin蛋白比较，F=65.291，P=0.001，进一步两两比较，各组间均有统计学差异（P<0.05）。不同浓度Vimentin蛋白比较，F=152.342，P=0.001，进一步两两比较，各组间均有统计学差异（P<0.05）。
3. 讨论
OSCC作为口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，癌细胞易从原发部位经淋巴道、血管或体腔等途径，到其他部位生长、定植并最终形成新的肿瘤病灶，即OSCC早期即可发生转移，严重影响预后[4]–[5]。研究[6]表明，EMT在肿瘤转移，尤其是单个肿瘤细胞从肿瘤组织上脱离的过程中起着重要作用。EMT作为生物胚胎发生过程中最基本的过程，在许多慢性病及恶性肿瘤的发生、进展中亦发挥重要作用。当细胞发生EMT时，上皮细胞失去极性，细胞之间黏附连接能力下降，演变为具有间质细胞形态和特性的细胞，并获得了浸润性和游走迁移能力，进而增强了侵袭和转移的能力[7]。
FAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，是细胞内重要的骨架蛋白与多种信号通路的关键分子。FAK在整合生长和细胞基质黏附信号方面具有关键作用，是癌症侵袭和转移的主要驱动力，目前已成为研究抗肿瘤药物的重要靶点之一[8]。TAE226是针对FAK的一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂。Lietha等[9]在体外细胞实验以及体内动物模型诱癌实验中证实，TAE226可有效抑制肿瘤的生长及侵袭，延长胶质瘤或卵巢肿瘤植入小鼠的寿命。Hehlgans等[10]研究也发现，TAE226作用于三维细胞培养模型中的头颈部鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，HNSCC）细胞后，细胞的放射敏感性增强，这也说明TAE226在临床上可能会提高HNSCC放射治疗的有效性。Kurio等[11]研究发现，TAE226可抑制破骨前细胞RAW264.7转变为破骨细胞，抑制成熟破骨细胞的微核和肌动蛋白环的形成，提示TAE226在破骨前细胞、成熟破骨细胞、骨基质细胞中均参与了溶骨性转移和活化，可有效治疗肿瘤性骨转移。本课题组的前期研究发现，TAE226对OSCC细胞有明显的抗增殖、迁移、侵袭作用，本实验旨在研究TAE226对OSCC细胞转移阶段的EMT进程是否有抑制作用，探索TAE226的抗癌机制，以期为TAE226的临床应用提供依据，为口腔黏膜癌变的防治提供新的策略。
肿瘤细胞发生EMT时伴有多种上皮标志物的下调，如E-cadherin、β-连环蛋白（β-catenin）等，同时间质标记物上调，包括N-cadherin、Vimentin、纤连蛋白等[12]–[14]。E-cadherin是广泛分布于上皮组织的跨膜糖蛋白，是一种维持上皮细胞形态、结构的完整性和极性的细胞黏附分子，Hermiston等[15]发现E-cadherin表达水平的降低可显著増强小鼠卵巢癌细胞株体外迁移能力。Perl等[16]在Rip-Tag小鼠实验中证实了E-cadherin表达下调是腺瘤进展为浸润性癌的先决条件。E-cadherin的表达与肿瘤的分化程度、发展转移密切相关，E-cadherin表达缺失或降低可使肿瘤细胞黏附能力下降，促进上皮性肿瘤细胞顺利实现浸润及转移，是肿瘤转移的抑制因素，也是EMT发生的关键性蛋白，E-cadherin转录的抑制是EMT的主要机制[17]。Vimentin是一种进化上保守的中间纤维蛋白，作为一种重要的骨架蛋白以维持细胞的完整性，与细胞骨架构成和细胞黏附密切相关[18]。Vimentin主要表达于间充质，在正常上皮组织中不表达或低表达，是间质型细胞的标志蛋白之一。研究[19]表明，当Vimentin表达于上皮源性的肿瘤细胞时，赋予了上皮源性细胞成纤维细胞样的特征，使细胞更易迁移和运动，细胞间黏附能力下降，迁移、侵袭和转移能力增强，发生上皮-间质转变，因此E-cadherin、Vimentin的表达水平反映了肿瘤细胞EMT的发生程度。在已有的相关研究中，不同细胞所用的TAE226浓度不尽相同，从500 nmol·L−1至10 µmol·L−1不等[20]。本课题组的前期研究发现，1 µmol·L−1的TAE226对HSC-3细胞的增殖、迁移、侵袭已有明显的抑制效果，本实验为寻找适宜的浓度，设置1 µmol·L−1到10 µmol·L−1作为检测浓度。在本实验中，TAE226作用下的人OSCC HSC-3细胞的上皮标志物E-cadherin表达增加及间质标志物Vimentin表达下降，且该药物效应具有剂量和时间的依赖性，这说明HSC-3细胞的EMT水平随TAE226的增加而下降。Kurio等[21]研究发现，TAE226可抑制FAK pTYr（397）和AKT pSer（473）的表达，TYr（397）是FAK最主要的自磷酸化位点。Jones等[22]发现，磷酸化后的Tyr397通过与Src的SH2结构域结合，进而激活下游PI3K/Akt通路，而后者激活后可以参与诱导细胞EMT的发生，且经TAE226处理后的OSCC细胞，其黏附丧失速度下降，本实验结果与之相符，TAE226可能通过下调FAK pTYr（397）的表达而抑制HSC-3细胞EMT进程的。
综上，TAE226作为FAK的强效抑制剂之一，能有效抑制OSCC细胞EMT过程，从而发挥抑制肿瘤细胞侵袭转移能力，但具体分子机制还需进一步研究。单独使用TAE226或与其他药物联合使用可有望成为治疗OSCC的一种有效方法，为进一步探索口腔肿瘤的防治策略提供参考。
Funding Statement
[基金项目] 四川省科技计划（2018JY0401）
Supported by: Sichuan Science and Technology Program (2018JY0401).
Footnotes
利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。
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