Abstract
目的
基于网络药理学和分子对接技术分析清肺排毒汤治疗COVID-19的作用靶点、信号通路和生物学功能。
方法
利用TCMSP、SwissTarget Prediction、CooLGeN、GeneCards、DAVID等数据库，分析清肺排毒汤中麻黄、半夏等21味药所含的活性成分及其靶点蛋白，筛选与COVID-19疾病共有的靶点蛋白及其信号通路与生物学功能，采用Gephi软件构建清肺排毒汤药味-活性成分-作用靶点-生物学功能网络图。
结果
清肺排毒汤中麻黄、半夏、甘草、冬花、紫菀、枳实等18味药的MOL000519、MOL000554、MOL004798、MOL004824、MOL010428、MOL013443等163个活性成分通过调控ACE、ACE2、AGTR1、FURIN、TNF、CASP3、CASP6、DPP4、MCL1、POLD1等10个蛋白靶点激活肾素-血管紧张素系统信号通路和细胞凋亡信号通路，发挥肾素-血管紧张素对血容量的调节、肾素-血管紧张素对全身动脉血压的调节等42种生物学功能治疗COVID-19。初步分子对接结果显示，核心活性成分MOL000519（来自半夏）、MOL000554（来自冬花）、MOL004798（来自麻黄）、MOL004824（来自甘草）、MOL010428（来自紫菀）、MOL013443（来自枳实）等与SARS-CoV-2 3CL水解酶有较好的亲合力，可形成稳定构象，具有较好结合活性（结合能≤-5 kJ/mol）。
结论
清肺排毒汤以多药味、多靶点、多信号通道和多生物学功能发挥治疗COVID-19作用，该研究可为深入阐释清肺排毒汤治疗COVID-19的药理作用及机制提供参考。
Keywords: 网络药理学, 分子对接, 清肺排毒汤, COVID-19, 生物学功能
Abstract
Objective
To explore the target, signaling pathways and their biological functions of Qingfei Paidu Decoction in the treatment of COVID-19 based on network pharmacology and molecular docking technology.
Methods
The active components and target proteins in 21 drugs such as Ephedrae Herba and Pinelliae Rhizoma in Qingfei Paidu decoction were analyzed, and the signaling pathways and biological functions of the target proteins common with COVID-19 were screened by using TCMSP, Swiss Target Prediction, CooLGeN, GeneCards, DAVID and other databases. The network diagram of Qingfei Paidu decoction was constructed using Gephi software.
Results
We identified 163 active ingredients, including MOL004798, MOL000519, MOL004824, MOL000554, MOL010428, and MOL013443, from 18 drugs in Qingfei Paidu decoction (such as Ephedrae Herba, Pinelliae Rhizoma, Glycyrrhizae Radix Et Rhiizoma, Farfarae Flos, Asteris Radix Et Rhizoma and Aurantii Fructus Immaturus). These ingredients activate renin-angiotensin system signaling pathway and apoptosis signaling pathway by regulating 10 protein targets (ACE, ACE2, AGTR1, FURIN, TNF, CASP3, CASP6, DPP4, MCL1 and POLD1) to execute 42 biological functions such as renin-angiotensin regulation of blood volume and systemic arterial blood pressure to treat COVID-19. The results of preliminary molecular docking showed that MOL000519 (from Pinelliae Rhizoma), MOL000554 (from Farfarae Flos), MOL004798 (from Ephedrae Herba), MOL004824 (from Glycyrrhizae Radix Et Rhiizoma), MOL010428 (from Asteris Radix Et Rhizoma), and MOL013443 (from Aurantii Fructus Immaturus) had good affinity with SARS-CoV-2 3CL hydrolase to form complexes with stable conformations and high binding activity (binding energy ≤- 5 kJ/mol).
Conclusion
Qingfei Paidu decoction can treat COVID-19 through its multiple medicinal ingredients that have multiple targets and involve multiple signaling pathways for different biological functions. Our finding provides reference for further investigation into the pharmacological mechanism of Qingfei Paidu decoction in treating COVID-19.
Keywords: network pharmacology, molecular docking, Qingfei Paidu decoction, COVID-19, biological function
COVID-19属于β属的冠状病毒，其基因特征与SARSr-Cov和MERSr-Cov有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。人群普遍易感，以发热、乏力、干咳为主要表现。虽然特定的疫苗和抗病毒药物是预防和治疗病毒感染的最有效方法，但目前还没有针对COVID-19的有效治疗方法。药物再利用是一种从现有药物中发现药物的有效策略，与新药物发现相比，可以缩短时间，降低成本[1]。传统中药为实现这一目标提供了一种潜在的宝贵资源。中药治疗的应用主要以中药的种类（根据中药经典文献目录）和病人的症状或体征为指导。通常没有足够的信息来预先确定中药是否可以直接针对病毒病因[2]。现有临床治疗效果显示，中医药在COVID-19的治疗中发挥了重要作用[3-5]。中华人民共和国中医药管理局关于推荐在中西医结合救治COVID-19中使用“清肺排毒汤”的通知（国中医药办医政函〔2020〕22号）[6]，将“清肺排毒汤”推荐用于COVID-19的治疗，中华人民共和国卫生健康委员会和中华人民共和国中医药管理局关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）的通知（国卫办医函〔2020〕145号）中也将“清肺排毒汤”用于COVID-19临床治疗期（确诊病例）的治疗[7]并取得了很好的临床疗效[8-9]。
以系统生物学理论为基础的网络药理学，通过对生物系统的网络分析来选取特定信号节点，构建活性成分-蛋白靶点-信号通路之间的复杂网络来探讨药物的作用机制[10-11]。通过网络药理学以“pneumonia”即“肺炎”为关键词检索肺炎相关靶点并进一步筛选与清肺排毒汤有效化合物靶点交集探讨清肺排毒汤的作用机制[12]。有学者鉴于ACE2是SARS-CoV-2受体，ACE2与Spike蛋白相互作用，可能也介导COVID-19感染肺Ⅱ型肺泡细胞，通过ACE2的共表达基因筛选与清肺排毒汤的交集靶标[13]。为更精准地通过网络药理学探讨清肺排毒汤治疗COVID-19作用机制，本文以“2019-nCoV”、“COVID-19”为疾病关键词，选取清肺排毒汤中麻黄、甘草等21味中药，对涉及到的2795种活性成分进行筛选，通过网络药理学方法进行清肺排毒汤抗COVID-19潜在作用靶点和信号通路及生物学过程的预测，根据构建的网络模型分析其对COVID-19疾病可能存在的药理作用及作用机制，为清肺排毒汤治疗COVID-19的深入研究提供参考和借鉴。
1. 资料和方法
1.1. 数据来源
1.1.1. 处方来源与组成[6]
处方来源：中华人民共和国中医药管理局关于推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒汤”的通知（国中医药办医政函〔2020〕22号）。清肺排毒汤的处方组成：麻黄9 g，炙甘草6 g，杏仁9 g，生石膏15~30 g（先煎），桂枝9 g，泽泻9 g，猪苓9 g，白术9 g，茯苓15 g，柴胡16 g，黄芩6 g，姜半夏9 g，生姜9 g，紫菀9 g，冬花9 g，射干9 g，细辛6 g，山药12 g，枳实6 g，陈皮6 g，藿香9 g。用法：传统中药饮片，水煎服。1付/1 d，早晚2次（饭后40 min），温服，3付1个疗程。适用范围：适用于轻型、普通型、重型患者，在危重型患者救治中可结合患者实际情况合理使用。
1.1.2. 活性成分来源
通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及《中国药典》（ChP）（2015年版），分别以清肺排毒汤中的21味药来检索活性成分，其中：炙甘草、杏仁、姜半夏、冬花、藿香分别按甘草、苦杏仁、半夏、款冬花、广藿香进行检索。选择符合口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18并合并各药味中相同的活性成分，绘制结构式并以MDL SDfile（*.sdf）格式保存（检索日期：2020年2月10日）。将这些活性成分的MDL SDfile（*.sdf）格式结构式导入SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），检索符合Probability≥0.05的活性成分靶点蛋白（检索日期：2020年2月21日）。
1.1.3. 候选靶标来源
利用CooLGeN (http://ci.smu.edu.cn/CooLGeN/Home.php)、GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，以“2019-nCoV”、“COVID-19”为关键词，收集疾病靶点蛋白（选择标示符为All human genes），选择与活性成分相匹配的靶点蛋白。
1.2. 靶点通路及生物学功能注释分析
将基因靶点复制至DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）的列表中，选择标示符为official_gene_symbol，物种注释为Homo sapiens，进行靶点蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_D IRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）_PATHWAY通路注释分析。
1.3. 活性成分-蛋白靶点-生物学功能网络分析和构建
根据预测结果，使用Gephi0.9.2软件将筛选出来的活性成分、蛋白靶点和生物学功能构建活性成分-蛋白靶点-生物学功能网络。
2. 结果
2.1. 清肺排毒汤各药味中活性成分
通过TCMSP及ChP（2015年版）共检索到清肺排毒汤各药味中所含活性成分2795个。符合口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的活性成分有368个。合并各药味中相同的活性成分，共得到活性成分309个（表 1）。
1.
清肺排毒汤中各药味所含活性成分数量
Quantity of active components in each medicinal ingredient of Qingfei Paidu decoction
| Traditional Chinese medicine in Qingfei Paidu decoction | Latin name (from ChP) | Number of active ingredients | Number of components complying with OB and DL rules |
| Ephedra | Ephedrae herba | 363 | 14 |
| Honey-fried licorice root | Glycyrrhizae radix et rhiizoma | 280 | 91 |
| Almond | Armeniacae semen amarum | 113 | 11 |
| Gypsum | Gypsum fibrosum | 1 | 0 |
| Cassia twig | Cinnamomi ramulus | 220 | 7 |
| Rhizoma alismatis | Alismatis rhizoma | 46 | 9 |
| Grifola | Polyporus | 31 | 11 |
| Atractylis ovata | Atractylodis macrocephalae rhizoma | 55 | 7 |
| Tuckahoe | Poria | 34 | 15 |
| Chinese thorowax root | Bupleuri radix | 349 | 17 |
| Scutellaria baicalensis | Scutellariae radix | 143 | 37 |
| Rhizoma pinelliae | Pinelliae rhizoma | 116 | 16 |
| Ginger | Zingiberis rhizoma recens | 265 | 6 |
| Radix asteris | Asteris radix et rhizoma | 91 | 19 |
| Fuyuka | Farfarae flos | 148 | 22 |
| Belamcanda sinensis | Belamcandae rhizoma | 56 | 17 |
| Asarum | Asari radix et rhizoma | 192 | 14 |
| Chinese yam | Dioscoreae rhizoma | 71 | 16 |
| Fructus aurantii immaturus | Aurantii fructus immaturus | 65 | 23 |
| Citri reticulatae pericarpium | Citri reticulatae pericarpium | 63 | 5 |
| Agastache rugosa | Pogostemonis herba | 94 | 11 |
2.2. 靶点的预测
将表 1中符合口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的活性成分以MDL SDfile（*.sdf）格式导入Swiss Target Prediction数据库，获得蛋白靶点信息29 596条，涉及1428个化学靶点蛋白。筛选符合Probability≥0.05的活性成分靶点蛋白，获得蛋白靶点信息19 994条，涉及1235个化学靶点蛋白。利用CooLGeN、GeneCards数据库，以“2019-nCoV”“、COVID-19”为关键词，共收集疾病靶点蛋白（All human genes）31个。筛选与活性成分相匹配的靶点蛋白有10个：血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素转化酶2（ACE2）、血管紧张素Ⅱ (AT1R/AGTR1)、弗林蛋白酶（FURIN）、肿瘤坏死因子（TNF）、胱天蛋白酶3（CASP3）、胱天蛋白酶6（CASP6）、二肽基肽酶-4（DPP4）、髓样细胞白血病蛋白1（MCL1）、DNA聚合酶δ催化亚基基因（POLD1），涉及18味药、163个活性成分（本文活性成分均以Mol ID表示，具体成分名称可检索TCMSP数据库）。清肺排毒汤中主要药味、活性成分及与COVID-19相关的潜在靶点信息为：ACE靶点蛋白：MOL000519、MOL006956（半夏），MOL000490（柴胡），MOL000554、MOL010017（冬花），MOL000273、MOL000276、MOL000280、MOL000289（茯苓），MOL000211（甘草、杏仁），MOL004824、MOL004860、MOL004917（甘草），MOL002935（黄芩），MOL004798（麻黄），MOL013276、MOL013428、MOL013440（枳实）；ACE2靶点蛋白：MOL013443（枳实），MOL010428（紫菀）；AGTR1靶点蛋白：MOL000519、MOL006937（半夏），MOL013187（柴胡），MOL010027、MOL010038、MOL010060（冬花），MOL000273、MOL000276、MOL000280、MOL000285、MOL000289、MOL000290、MOL000291、MOL000300（茯苓），MOL000211、MOL002311、MOL004903（甘草、杏仁），MOL004810、MOL004812、MOL004820、MOL004838、MOL004855、MOL004856、MOL004857、MOL004864、MOL004882、MOL004898、MOL004905、MOL004924、MOL004945、MOL004948、MOL004959、MOL004980、MOL005001、MOL005013（甘草），MOL002879（黄芩、藿香），MOL010415（黄芩），MOL001494（麻黄），MOL005465（山药），MOL003742（射干），MOL009053、MOL013276（枳实），MOL010428、MOL010478（紫菀）；CASP3靶点蛋白：MOL006937、MOL006967（半夏），MOL000490、MOL004653、MOL013187（柴胡），MOL002776（柴胡、半夏），MOL000554、MOL010027、MOL010055、MOL010060（冬花），MOL000290（茯苓），MOL000500、MOL004808、MOL004812、MOL004882、MOL004891、MOL004905、MOL004917、MOL004924、MOL005007（甘草），MOL004903（甘草、杏仁），MOL001490、MOL002935（黄芩），MOL005922、MOL005923（藿香），MOL004798、MOL010489（麻黄），MOL000310、MOL000322、MOL005430（山药），MOL006129（生姜），MOL009849（细辛），MOL010922（杏仁），MOL013276、MOL013352、MOL013428、MOL013430、MOL013436、MOL013440、MOL013443（枳实），MOL010478（紫菀）；CASP6靶点蛋白：MOL006967（半夏），MOL000490、MOL013187（柴胡），MOL002776（柴胡、半夏），MOL000554（冬花），MOL004808（甘草），MOL004903（甘草、杏仁），MOL000228、MOL001490、MOL002935（黄芩），MOL004798、MOL010489（麻黄），MOL006129（生姜），MOL013276、MOL013428（枳实），MOL010478（紫菀）；FURIN靶点蛋白：MOL006956、MOL006957（半夏）；DPP4靶点蛋白：MOL006956、MOL006957、MOL006967（半夏），MOL000490、MOL004628、MOL004648（柴胡），MOL000291（茯苓），MOL004810、MOL004811、MOL004815、MOL004824、MOL004856、MOL004879、MOL004891、MOL004924、MOL004948、MOL005003（甘草），MOL004908（甘草、杏仁），MOL002879（黄芩、藿香），MOL005884（藿香），MOL004798（麻黄），MOL001559（山药），MOL003773（射干），MOL002501、MOL012141（细辛），MOL007207、MOL012922（杏仁），MOL000820（猪苓）；MCL1靶点蛋白：MOL000519、MOL006944、MOL006967（半夏），MOL004598、MOL004609、MOL013187（柴胡），MOL010012、MOL010028、MOL010060（冬花），MOL000239、MOL000392、MOL000417、MOL000500、MOL003656、MOL003896、MOL004811、MOL004814、MOL004828、MOL004856、MOL004857、MOL004860、MOL004863、MOL004864、MOL004935、MOL004961、MOL004974、MOL005008、MOL005016、MOL005020（甘草），MOL000354（甘草、柴胡、射干、紫菀），MOL002311（甘草、杏仁），MOL000173、MOL000552、MOL001458、MOL001689、MOL002908、MOL002909、MOL002911、MOL002915、MOL002926、MOL002927、MOL002928、MOL002932、MOL002933、MOL002934、MOL008206、MOL012266（黄芩），MOL002879（黄芩、藿香），MOL005573、MOL005916、MOL005922（藿香），MOL002881（麻黄），MOL005465（山药），MOL000351、MOL001735、MOL003758、MOL003759、MOL003773（射干），MOL001558、MOL009849（细辛），MOL002372（杏仁），MOL005828（枳实、陈皮），MOL013277、MOL013279、MOL013430（枳实），MOL002563、MOL004096（紫菀）；POLD1靶点蛋白：MOL002776（柴胡、半夏），MOL000554（冬花），MOL002935（黄芩）；TNF靶点蛋白：MOL002776（柴胡、半夏），MOL004648（柴胡），MOL010006、MOL010007（冬花），OL000273、MOL000275、MOL000280、MOL000285、MOL000287、MOL000289、MOL000290、MOL000291、MOL000292、MOL000300（茯苓），MOL000279（茯苓、猪苓），MOL000392、MOL000417、MOL004810、MOL004827、MOL004848、MOL004898、MOL004905、MOL004907、MOL004917、MOL004935、MOL004948、MOL004959、MOL005013、MOL005016（甘草），MOL002911、MOL002935（黄芩），MOL005923（藿香），MOL001755（麻黄、半夏），MOL005461、MOL005465（山药），MOL002322、MOL003757、MOL003758、MOL003759、MOL003773（射干），MOL000832（泽泻），MOL000796、MOL000797、MOL000816、MOL000822（猪苓），MOL010456（紫菀）。
2.3. 靶点信号通路与Gene Ontology（GO）分析
将清肺排毒汤中各药味活性成分与COVID-19共有的10个靶点蛋白导入DAVID数据库，进行靶点蛋白的GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT富集分析和KEGG_PATHWAY通路注释分析。信号通路主要涉及肾素-血管紧张素系统（RAS）信号通路、细胞凋亡、肌萎缩侧索硬化症和肥厚性心肌病（HCM）信号通路。清肺排毒汤中的163个活性成分通过ACE、ACE2、AGTR1、FURIN、TNF、CASP3、CASP6、DPP4、MCL1、POLD1等靶点蛋白参与与COVID-19相关的生物过程、细胞组成和分子功能。生物过程主要与肾素-血管紧张素对血容量的调节、肾素-血管紧张素对全身动脉血压的调节、血管舒张调节、激素对全身动脉血压的调节作用、内分泌过程等有关，细胞组成主要与质膜、细胞外区、细胞表面等有关，分子功能主要与肽酶活性（作用于L-氨基酸肽）、肽酶活性、肽结合等有关（图 1、2）。
1.
清肺排毒汤中活性成分潜在靶点与COVID-19相关的GOTERM_BP_FAT富集分析
Enrichment analysis of the potential targets of the active components in Qingfei Paidu decoction and the biological function of GOTERM_BP_FAT related to COVID-19 disease (P < 0.01).
2.
清肺排毒汤中活性成分潜在靶点与COVID-19相关的GOTERM_CC_FAT（A）和GOTERM_MF_FAT（B）富集分析
Enrichment analysis of the potential target of active components in Qingfei Paidu decoction and the biological function of GOTERM_CC_FAT(A) and GOTERM_MF_FAT(B) realted to COVID-19.
2.4. 活性成分-靶点蛋白-生物学功能网络的构建
使用Gephi 0.9.2软件构建药味-活性成分-靶点蛋白-生物学功能网络（图 3）。清肺排毒汤中麻黄、半夏、甘草、冬花、紫菀、枳实等18味药的MOL000519、MOL000554、MOL004798、MOL004824、MOL010428、MOL013443等163种活性成分通过ACE、ACE2、AGTR1、FURIN、TNF、CASP3、CASP6、DPP4、MCL1、POLD1等靶点蛋白以多种生物学功能发挥治疗COVID-9作用。
3.
清肺排毒汤中药味（
）-活性成分（
）-靶点蛋白（
）-生物学功能（
）网络图
Network diagram of medicinal ingredients () -active component () -target protein () -biological function () in Qingfei
Paidu decoction.
2.5. 清肺排毒汤中核心活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶晶体结构（PDB ID：6LU7）分子对接结果分析
SARS-CoV-2 3CL水解酶作为一种半胱氨酸水解酶，是冠状病毒的主要蛋白酶之一，在病毒的复制过程中起重要作用，因其基因具有高度的保守性，可作为药物设计的关键靶标，其三维高分辨率[0.21 nm（2.1 Å）]晶体结构（PDB ID：6LU7）由上海科技大学饶子和/杨海涛课题组测定[14-16]。RAS信号通路是清肺排毒汤发挥治疗COVID-19的主要通路之一，该通路主要通过激活ACE、ACE2靶点蛋白发挥作用。在清肺排毒汤中涉及到ACE、ACE2靶点蛋白的核心（代表性）活性成分有MOL000519、MOL000554、MOL004798、MOL004824、MOL010428、MOL013443等。为此，通过分子对接技术初步探讨核心活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶晶体结构（PDB ID：6LU7）的亲合力。配体与受体间低能量的稳定构象预示着二者间有较大的作用可能性。一般以结合能≤-5 kJ/moL作为筛选标准。本文以SYBYL-X 2.1.1对接软件进行分子对接，获得Total Score分值，换算成结合自由能（公式ΔG0=-2.303 RT× TotalScore，其中R为分子的理想气体常数，T为理想气体的热力学温度）[17]。分子对接结果表明，MOL000519（来自半夏）结合能为-36.36 KJ/moL、MOL000554（来自冬花）结合能为-41.56 KJ/moL、MOL004798（来自麻黄）结合能为-29.80 KJ/moL、MOL004824（来自甘草）结合能为-36.53 KJ/moL、MOL010428（来自紫菀）结合能为-19.16 KJ/moL、MOL013443（来自枳实）结合能为-11.67 KJ/moL。清肺排毒汤中核心活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能均远小于-5.0 KJ/moL（图 4）。
4.
核心活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶二维（A）及三维（B）分子对接模式
Two-dimensional (A) and three-dimensional (B) docking models of the core active component and the SARS-CoV-2 3CL hydrolase.
3. 讨论
本研究借助TCMSP、SwissTargetPrediction、CooLGeN、GeneCards等数据库，对清肺排毒汤中麻黄、甘草等21味药及所涉及的活性成分进行网络药理学分析，发现了与COVID-19相关的蛋白靶点，并对蛋白靶点进行了KEGG通路注释分析和GO富集分析，采用Gephi软件将筛选出的清肺排毒汤中的18味药163个活性成分及10个蛋白靶点和42条生物学功能构建活性成分-蛋白靶点-生物学功能网络，发现清肺排毒汤具有多靶点、多种生物学功能的作用特点。
从KEGG富集分析结果可得知，清肺排毒汤用于COVID-9治疗主要涉及的信号通路有：RAS信号通路、细胞凋亡等信号通路。COVID-19与SARS-CoV具有79.5%的同源性，其受体都是ACE2[18]。作为SARSCoV-2细胞内受体的ACE2是SARS-CoV-2感染、入侵机体的关键分子[19]。它在肺、心脏和肾脏中高度表达，主要定位在这些器官的大动脉、小动脉和小静脉内皮细胞上[20-21]。与ACE2受体最为相关的信号通路为RAS系统。RAS系统既存在于循环系统中，也存在于血管壁、心脏、肺部、中枢、肾脏和肾上腺等组织内。SARS-CoV-2可下调ACE2的表达，使细胞因子（尤其促炎因子）表达升高，诱发炎症风暴，出现全身炎症反应，加重病情的发展[22-23]。SARS-CoV-2感染还可能导致淋巴细胞凋亡[24]。
国家卫生健康委员会印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第7版)》（国卫办医函[2020]184号）强调，COVID-19重症患者严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭[7]。ARDS中的ACE/ AGTR1具有促进ARDS炎症反应、肺细胞凋亡及肺纤维化的作用，而ACE2 /Ang1-7能抑制ACE/AGTR1的促进ARDS炎症反应等作用，并且ARDS存在肺组织局部RAS稳态失衡[25]。TNF是炎症的中心细胞因子之一，能促进肺水肿的形成[26]。李鑫等[27]研究表明，COVID-19的S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位点，从而导致COVID-19的感染机制不同于SARS等大部分Beta冠状病毒。鉴于清肺排毒汤良好的治疗COVID-19效果，结合网络药理学结果，由此推测，清肺排毒汤可能通过麻黄、半夏、甘草、冬花、紫菀、枳实等药味中的MOL000519、MOL000554、MOL004798、MOL004824、MOL010428、MOL013443等多种化学成分作用于ACE、ACE2、AGTR1、TNF、FURIN等靶点蛋白，利用RAS信号通路和细胞凋亡信号通路抑制炎症反应、细胞凋亡发挥治疗COVID-19作用。
《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第7版)》（国卫办医函[2020]184号）的病理改变项下，根据有限尸检及穿刺组织病理观察，发现肺门淋巴结淋巴细胞数量较少，可见坏死；心肌细胞可见变性、坏死等。COVID-19重症患者多在发病1周后出现呼吸困难和/或低氧血症，静息状态下，指氧饱和度≤93%即可确诊为重型。血氧饱和度持续降低，会引发脏器衰竭，受损的不仅有肺，还可能由于心肌能量物质匮乏，诱发线粒体结构和功能的失衡，使得线粒体依赖的细胞凋亡途径激活，引起心肌细胞变性坏死，这种由细胞线粒体的功能异常或损伤所致内源性凋亡途径也被称为线粒体途径[27]。Caspase是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族[28]，活化的Caspase可水解底物, 并通过级联放大诱发凋亡[29]。CASP3、CASP6在细胞凋亡效应中起着关键作用，且CASP3可激活CASP6。当CASP3被激活后，作用于Bcl-2家族某些成员如Bad，进而引起宿主胞内的结构蛋白及DNA稳定被破坏，引起细胞凋亡[30]。结合网络药理学结果，清肺排毒汤中麻黄、甘草、黄芩等14药味中的MOL004798、MOL000500、MOL004798、MOL000228等42个成分可能通过细胞凋亡信号通路影响心肌细胞中CASP3、CASP6蛋白的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心肌细胞变性、坏死，发挥治疗COVID-19或干预COVID-19病变过程作用。
肾素-血管紧张素系统是人体内重要的体液调节系统，对心血管功能稳态、电解质和体液平衡的维持以及血容量、血管张力和血压调节方面具有重要作用。肾素作为蛋白水解酶，主要由肾近球细胞合成和分泌，可水解血中的血管紧张素原，使其成为10肽的且无生理活性的血管紧张素Ⅰ，在ACE作用下转化成8肽的血管紧张素Ⅱ或在ACE2作用下，生成血管紧张素Ⅰ-9。AGTR1是已知最强的缩血管活性物质之一。血管紧张素作用于血管平滑肌，可使全身微动脉收缩，动脉压升高，刺激肾上腺皮质球状带分泌醛固酮，使水钠潴留，继而引起血容量增加，收缩血管，使血压升高。结合网络药理学结果可知，在生物学功能上，以P < 0.0001的GOTERM_BP_FAT为例，清肺排毒汤主要作用于AGTR1、ACE、ACE2等靶点蛋白通过肾素-血管紧张素对血容量的调节、肾素-血管紧张素对全身动脉血压的调节、血管舒张调节、激素对全身动脉血压的调节作用、内分泌过程等生物学功能发挥治疗COVID-19或干预COVID-19病变过程作用。
初步分子对接结果显示，麻黄、半夏、甘草、冬花、紫菀、枳实等药味中的MOL000519、MOL000554、MOL004798、MOL004824、MOL010428、MOL013443等核心活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶的结合能均小于-5KJ/moL，结合活性较高，发生作用程度较大，来自麻黄、半夏、甘草、冬花、紫菀、枳实等药味中的核心活性成分可能为清肺排毒汤通过RAS信号通路治疗COVID-19的部分物质基础。
综上所述，在网络药理学技术和分子对接技术的指导下，以清肺排毒汤中的18味药163个活性成分与相关靶蛋白、信号通路、生物学功能的网状关联为基础，可为清肺排毒汤多成分、多靶点、多途径、多生物学功能治疗COVID-19的更广泛更深入研究提供参考。
Biographies
鄢海燕，教授，E-mail:yhy0801@126.com
邹妍，在读硕士研究生，E-mail:whzouyanyu@163.com
Funding Statement
安徽省省级质量工程项目(2018jyxm1273)
Contributor Information
鄢 海燕 (Haiyan YAN), Email: yhy0801@126.com.
邹 妍 (Yan ZOU), Email: whzouyanyu@163.com.
邹 纯才 (Chuncai ZOU), Email: zouchc@163.com.
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