溶血磷脂酸对骨组织细胞生物学调控功能的研究进展

Abstract

溶血磷脂酸（LPA）是一种结构简单的生物学磷脂，广泛存在于真核细胞组织和血浆中。作为胞外信号分子的LPA可以通过至少6种G蛋白偶联受体激活多条信号通路，产生广泛的细胞学效应，从而在组织发育、创伤愈合和肿瘤的发生发展中发挥重要作用。近年来研究表明，LPA对多种骨组织细胞亦表现出显著的生物学调控功能，对于骨组织的发育和修复重建具有重要影响，具备应用于骨组织工程的潜能。本文就LPA对骨组织细胞生物学调控功能的研究进展进行综述。

溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是机体内天然存在的一种结构简单的小分子甘油磷脂，也是一类具有相似分子结构并具有近似生物学功能的磷脂类分子的总称。其相对分子质量为43×10⁴~48×10⁴。目前研究最广泛的LPA通常是指1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸。研究[1]–[2]表明，LPA可以作为一种关键的胞外信号分子对多种细胞功能进行调控，包括增殖、分化、凋亡、趋化性、细胞形态发生以及细胞因子分泌等。LPA广泛地参与了机体组织的多种生理学和病理学过程，对神经系统发育、血管形成、炎症、创伤愈合以及癌症进程均具有重要影响[2]–[3]。近年来，LPA对骨组织细胞的生物学效应正逐渐受到关注。LPA不仅可以干预包括骨髓间充质干细胞、成骨细胞、骨细胞以及破骨细胞在内的多种骨组织细胞的细胞学行为，也具有作为生长因子应用于骨组织工程的潜力。本文就LPA对骨组织细胞生物学调控功能的研究进展进行综述。

1. LPA的生成和LPA受体信号传导

LPA在机体内广泛存在。生理状况下，LPA微量存在于各种真核细胞组织中，而在血浆中浓度较高[4]。在某些病理状况下，如血栓类疾病、创伤或者肿瘤类疾病发生时，病变微环境中LPA的浓度将显著上调[5]–[7]。机体内LPA的合成途径主要有2种。1）磷脂前体在磷脂酶A₁或A₂的作用下生成溶血磷脂，随后该溶血磷脂在自毒素（autotaxin，ATX）的作用下转化为LPA；2）磷脂前体在磷脂酶D的作用下或二酰基甘油在二酰基甘油激酶的作用下首先生成磷脂酸，接着磷脂酸在磷脂酶A₁或A₂的作用下转化为LPA。常见的相关磷脂前体有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。除此以外，LPA还存在一些其他的合成途径，比如通过甘油磷酰基转移酶对3-磷酸甘油进行酰基化生成等。

依据LPA存在于细胞内或外，可以将其分为胞内LPA和胞外LPA。其中，胞内LPA是中性脂质和磷脂合成早期的关键中间体；胞外LPA则通过与细胞膜表面的LPA受体结合进而引发生物学效应。目前发现的LPA受体主要有6种G蛋白偶联受体，分别为LPA₁~LPA₆。而根据这6种LPA受体间的同源性，又将其分属于内皮分化基因（endothelial differentiation gene，EDG）家族和非-EDG家族两类[8]。其中LPA₁、LPA₂、LPA₃属于EDG家族受体，可与Gα_i/o、Gα_q/11和Gα_12/13蛋白相偶联，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/ Akt，PI3K/Akt）、Ras同源物蛋白（ras homologue，Rho）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）或磷脂酶C（phospholipase C，PLC）等信号通路，发挥促细胞增殖、抗凋亡、促细胞迁移和改变细胞骨架等作用[9]–[13]。LPA₄、LPA₅、LPA₆属于非-EDG家族受体，当与其相偶联的Gα_i/o、Gα_q/11、Gα_12/13或Gα_s蛋白活化后，可通过Rho信号通路的激活或胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的增加和钙离子的动员等，影响细胞集聚、黏附或者细胞形态的改变[14]–[18]。LPA受体的多样性和下游信号通路的复杂性是其可以对多种细胞产生广泛生物学效应的基础。

2. LPA在不同骨组织细胞中的生物学功能

2.1. LPA对骨髓间充质干细胞的生物学作用

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种具有很强的自我复制能力的多能干细胞，具有在适宜的条件下分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞的潜力[19]。LPA可通过LPA₁受体诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的迁移和细胞内钙离子浓度的升高[20]。这一发现提示LPA对于MSCs的细胞学效应应该存在调控功能。

学者[21]–[22]研究发现，通过LPA₁受体和细胞内钙离子动员，LPA可以显著上调BMSCs的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表达。而ALP是成骨细胞早期分化的重要标志物之一。这一结果证实了LPA具有直接作用于BMSCs促使其向成骨细胞分化的能力。研究[21]还发现，LPA₄受体的活化存在抑制BMSCs成骨向分化的功能，并且敲除LPA₄受体基因的小鼠表现出了骨小梁体积、数量和厚度的明显增加。这些结果说明，LPA对于BMSCs的成骨向分化并非单一的正向调节，而是依据微环境以及不同LPA受体的活化程度而存在着复杂的协调机制。微重力环境能够抑制BMSCs中ALP的活性以及成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）的表达，是失重性骨缺失的主要原因之一。Chen等[23]研究发现，LPA能上调微重力环境中BMSCs的ALP活性并增加Runx2的表达，从而在失重条件下诱导BMSCs成骨向分化。这一研究提示，当骨缺损发生时，LPA有可能作为促进成骨的诱导因子而维持骨稳态。此外，研究[24]–[25]还发现，LPA能够通过与G_i蛋白相偶联的LPA₁受体或者LPA₃受体的活化，经由下游的PI3K/Akt信号通路以及细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，Erk1/2）信号通路有效保护BMSCs免受缺氧、血清剥夺以及过氧化氢等致凋亡的影响，从而增强细胞的生存能力。

2.2. LPA对成骨细胞的生物学作用

成骨细胞是骨组织细胞中促进骨形成和骨再生的主要细胞类型。生理条件下，成骨细胞具有分泌LPA的能力，并且其细胞表面至少表达4种LPA受体（LPA₁~LPA₄）[26]–[27]。这说明LPA可能是生理状况下骨稳态的调控因子之一，同时其可通过旁分泌和自分泌的方式影响成骨细胞本身的细胞学行为。在这些影响中，LPA对成骨细胞数量的相关效应受到了学者的关注。Caverzasio等[28]对MC3T3-E1成骨细胞有丝分裂现象的研究发现，G_i蛋白引起的Erk信号分子的激活是涉及成骨细胞增殖的一条重要的信号通路，而LPA是引起G_i蛋白活化的有效激动剂。随后，Grey等[29]分别使用原代大鼠成骨细胞和UMR106-01成骨细胞系观察了LPA对成骨细胞增殖的影响，结果发现，经过24 h的培育，LPA处理组增加的细胞数量明显上调。进一步的研究[30]–[31]证实，LPA还具有维持成骨细胞存活能力的作用。在这些研究中，LPA水平的增加能够显著抑制血清剥夺或者糖皮质激素诱导的细胞凋亡。LPA对成骨细胞数量的影响提示，这种天然小分子磷脂可能在骨发育和改建中的成骨向调控上具有重要作用，这对于一些代谢类骨疾病（如骨质疏松症）的治疗具有积极意义。

随着人们逐渐认识到血小板的活化可以产生大量的LPA，而LPA在多种细胞中可以表现出生长因子样作用，从而有利于软组织再生和损伤愈合[9],[32]。学者猜测，创伤后产生的LPA可能对于骨组织损伤后的骨再生也具有重要意义，因此对LPA与成骨细胞间的生物学作用进行了更多的探讨。学者[33]–[34]研究观察了LPA对MC3T3-E1成骨细胞迁移的影响，结果表明，LPA是成骨细胞的有效趋化因子，其机制涉及了LPA₁受体的活化和Erk1/2信号分子的激活。Panupinthu等[35]研究发现，LPA具有使成骨细胞膜产生发泡变化的效应，而这种变化与细胞的有丝分裂、运动性以及细胞凋亡可能存在相关性。学者[36]–[37]研究发现，在1α,25二羟基维生素D3的辅助作用下，LPA具有显著增加MG63成骨细胞ALP活性和骨钙素表达的能力，同时也可诱导成骨细胞肌动蛋白应力纤维的形成并引起细胞骨架的变化，这些结果为LPA具有促成骨细胞成熟的功能提供了直接的证据。

LPA不仅对成骨细胞本身具有直接效应，还可诱导成骨细胞产生多种细胞因子，从而促进骨组织细胞间的信息交流。白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和白细胞介素-8（interleukin 8，IL-8）对骨改建具有双重作用，既能直接诱导破骨细胞分化，也存在促血管生成偶联促成骨的效应，是调控骨改建的2种重要的细胞因子[38]–[39]。Aki等[40]研究发现，通过LPA₁受体和PLC信号通路，LPA可以显著增加SaM-1成骨细胞系中IL-6和IL-8的分泌。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是CCN基因家族的一员（又称CCN2），是促进成骨细胞增殖和分化的一种重要的细胞因子，可以在骨发育和骨质愈合中发挥重要作用。Yu等[41]研究表明，依赖于LPA₁、LPA₃受体和PKC信号的活化，LPA可以在成骨细胞中显著上调CCN2的表达。除此之外，LPA还被证明可以促进成骨细胞中类几丁质酶（chitinase 3-like-1，CHI3L1）的表达升高，而CHI3L1的生成则与细胞间基质的改建密切相关，LPA的这种功能被认为可能影响了骨关节炎中的异常骨代谢[41]。

2.3. LPA对骨细胞的生物学作用

骨细胞是骨组织中数量最多的细胞类型，主要位于骨陷窝内，由成骨细胞分化而来。骨细胞是骨组织发育和改建中重要的调控者，在激素和机械应力的作用下，可通过对骨硬化蛋白、核因子kappa-B受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）及骨保护素（osteoprotegerin，OPG）等信号分子表达的改变控制成骨细胞和破骨细胞的形成与功能[42]。骨细胞表面的树枝状结构是骨细胞与周围细胞交流的重要通道。Karagiosis等[43]研究表明，LPA不仅是骨细胞有效的趋化因子可影响骨细胞的迁移，同时也可促进骨细胞表面树枝状突起的形成，而这些效应与LPA₁受体有关。Waters等[44]通过基因芯片的方法，对涉及LPA促骨细胞树枝状结构生成的潜在调控基因进行了检测，结果发现与细胞肌动蛋白微丝调节相关的基因表现出显著的表达变化，这说明LPA对骨细胞形态结构的影响和其肌动蛋白动力学密切相关。骨细胞表面至少存在3种LPA受体（LPA₁、LPA₂、LPA₄）[43]，这提示了LPA对骨细胞功能影响以及信号通路调控的多样性。

2.4. LPA对破骨细胞的生物学作用

破骨细胞是一种多核巨细胞，由单核破骨细胞前体融合形成，是骨吸收的主要功能性细胞。在生理状况下，破骨细胞与成骨细胞共同维持骨稳态。而在炎症、代谢紊乱和肿瘤等病理条件下，破骨细胞的过度活化会引起骨质的丢失或者溶解[45]。LPA对破骨细胞分化影响的研究表明，使用脂质清除的培养血清无法实现巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）和RANKL对破骨细胞的诱导分化，而添加LPA后，这种功能得以恢复[46]。这一现象为血清中的LPA能够促进破骨细胞形成提供了有力的证据。破骨细胞前体可以表达除LPA₃以外的其余5种LPA受体，其中LPA₁和LPA₆表达最强[47]。这提示LPA可能通过这2种受体对破骨细胞的分化产生重要影响。而进一步的动物实验则证实，当LPA₁受体基因被敲除，或使用Ki16425等LPA₁受体拮抗剂阻断该信号通路时，破骨细胞的形成会显著减弱[47]–[48]。这说明LPA₁受体在LPA对破骨细胞分化的调控中具有关键作用。

近年来，学者开始探讨LPA对成熟破骨细胞的效应。已有研究揭示了成熟破骨细胞表面LPA₁、LPA₂、LPA₄、LPA₅受体的存在，并且证明了LPA具有上调破骨细胞内钙离子水平、促进破骨细胞板状伪足收缩及增强其抗凋亡能力的作用[49]。另外，封闭区是破骨细胞发挥骨吸收功能所形成的特殊附属结构，而破骨细胞中甲状腺素受体效应蛋白6（thyroid hormone receptor interacting protein 6，TRIP6）的表达对封闭区的周界范围具有显著影响。McMichael等[50]研究则发现，虽然LPA不能引起破骨细胞TRIP6表达总量的上升，但却可以通过上调其磷酸化水平来增强其与封闭区的结合。与此同时，依赖于LPA₂受体的活化，LPA还具有促进破骨细胞融合的能力，能够引起封闭区面积的增大[50]。这些作用与破骨细胞骨吸收活性的强化密切相关。

3. LPA在骨组织工程中的应用前景

LPA对于骨组织细胞的生长因子样作用是其可以用于骨组织工程的前提。但骨组织工程材料的表面特征和化学性质往往会对细胞的反应性造成重要影响。因此，一些学者将LPA添加于不同的骨组织工程材料中，对其成骨潜能进行探讨。Mansell等[51]通过白蛋白作为载体将LPA加载于表面涂覆羟磷灰石的钛金属表面，观察其对成骨细胞成熟的影响，结果表明，在1α,25二羟基维生素D3的辅助作用下，LPA的加入可明显上调成骨细胞的ALP活性。Bosetti等[52]利用体外培养的骨折模型观察富含LPA的胶原凝胶对于成骨的影响，结果发现LPA的加入不仅可以显著促进缺损处成骨细胞的增殖、分化、成熟和迁移等，同时还可以通过对细胞形态学的改变引起胶原凝胶的收缩，进而有利于缺损两侧骨折碎片位置的固定以加速骨折愈合。这些研究对LPA应用于骨组织工程的可能性进行了肯定。

LPA生物学作用的多样性可能有利于其成骨功能的实现。LPA不仅可以通过调控骨组织细胞促进成骨，还具有促内皮细胞有丝分裂和血管生成的效应，而充足的血供对于骨重建和骨折愈合具有重要意义，所以这种成血管成骨的双重潜能是LPA应用于骨组织工程的优势之一[53]。除此以外，与当前骨组织工程中研究广泛的骨形态发生蛋白-2/7和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等大分子蛋白相比，LPA还具有分子结构小、容易加载和释放、来源广泛、制造成本低廉等优点[51],[53]。虽然要实现LPA在骨组织工程中的应用仍有许多工作需要完成，比如如何协调LPA对骨组织细胞的骨形成功能和骨吸收功能的调控，以及在现有工程支架材料的基础上如何实现LPA的有效控释等，但这种天然小分子磷脂在骨组织工程中具有较好的应用前景。

4. 总结

LPA是一种机体内天然存在的生物活性磷脂。在生理状况下，其可以由成骨细胞表达，而病理状况下，则可在损伤区域由血小板大量生成[9],[26]。近年来研究发现，LPA能够通过特异性的LPA受体诱导不同的骨组织细胞产生多种细胞学效应。这说明，LPA在骨组织的发育、重建和修复再生中具有重要意义。鉴于LPA对骨组织细胞（特别是骨髓间充质干细胞和成骨细胞）表现出的显著的生长因子样作用，学者[53]开始探讨其应用于骨组织工程的可能，并认为其具备较好的应用潜力。然而，目前关于LPA对于骨组织细胞的功能学研究并不充分，其信号调控机制的揭示也不完善，另外尚未有添加LPA的组织工程材料在体内成骨的直接证据，所以这些是未来LPA在骨组织细胞生物学研究及其相关再生医学研究中亟待解决的问题。总之，LPA对骨组织细胞生物学功能的深入研究，将为骨组织发育、改建的机制以及骨组织缺损的临床治疗带来新的理论基础。

Funding Statement

[基金项目] 四川省科技计划（2019YFH0153）；广东省基础与应用基础研究基金（2019A1515110810）

Supported by: Sichuan Science and Technology Program (2019YFH0153); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110810).