实时定量PCR检测BCR-ABL (P210）转录本水平室内长期质控体系的建立及应用

Abstract

目的

制备BCR-ABL (P210）实时定量PCR（RQ-PCR）检测的室内质控物，建立RQ-PCR检测BCR-ABL (P210）转录本水平的室内质控方法。

方法

取K562细胞和HL-60细胞，制备RQ-PCR检测BCR-ABL（P210）转录本水平的高、低浓度质控物，2013年8月至2015年10月用RQ-PCR法与临床标本同步检测BCR-ABL（P210）184次，按试剂批号（批号20130303、20131212、20140411和20150327分别简称为R1、R2、R3、R4）统计分析标准曲线斜率、截距及相关系数，并按试剂批号和质控物批号（批号20130725、20140611分别简称为Q1、Q2）统计分析高、低浓度质控物检测结果，对斜率、截距及质控物检测结果采取Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法进行质控判断。

结果

①标准曲线斜率、截距：R1检测53次，斜率、截距均未失控；R2检测37次，斜率失控6次，且第2~8次在x−s限值下侧，第12~37次在x值上侧，截距失控9次，且第1~8次在x+s限值上侧，第12~37次出现在x值下侧；R3检测80次和R4检测14次，斜率、截距均未失控。②质控物结果：Q1批号质控物，R1检测49次未失控，R2检测23次失控1次；Q2批号质控物，R2检测14次、R3检测72次及R4检测14次均未失控。

结论

利用K562细胞和HL-60细胞制备定量检测BCR-ABL（P210）转录本水平的高、低浓度室内质控物，制备方便，检测结果可靠、稳定，使用质控物检测结果结合标准曲线斜率、截距进行室内质控，可更有效地保证临床检测结果的准确性和稳定性。

慢性髓性白血病（CML）是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，Ph染色体和BCR-ABL融合基因是CML诊断的金标准和治疗的分子靶点[1]。检测BCR-ABL（P210）转录本水平有助于CML患者的辅助诊断、疗效监测及预后判断，因此确保BCR-ABL（P210）检测结果的准确性、可靠性、稳定性及可比性，具有极其重要的意义[2]–[8]。实时定量PCR (RQ-PCR）是目前监测BCR-ABL（P210）水平普遍使用且敏感的分子生物学检测技术，人员、技术、试剂、仪器、环境及内参基因等诸多因素都会影响其检测质量，为保证自身实验室的检测质量，实验室须严格执行标准化操作方案，并进行室内质控[3]–[4],[6],[8]–[15]。为了实现检测结果的可比性，2013年10月北京大学人民医院作为地区参比实验室，山东大学齐鲁医院血液病研究室用20130303批号试剂获取并验证了国际标准化（IS）的转换系数（CF）0.36，2014年12月用20140411批号试剂再次验证CF保持为0.36[5]–[6],[15]。更换试剂批号可能会影响检测结果，需要在试剂、标准曲线、质控物三个层次上通过室内质控进行监测[11],[16]。室内质控物是室内质控不可或缺的一部分，目前尚无相应统一的室内质控物，针对本PCR实验室工作的实际情况，我们制备了BCR-ABL（P210）检测的高、低浓度室内质控物，对质控物检测结果及标准曲线的斜率、截距、相关系数进行统计分析，并利用Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法，对BCR-ABL（P210）转录本的定量检测进行室内质控动态监测。

材料与方法

一、仪器、试剂与质控物

ABI7500荧光定量PCR基因扩增仪为美国Life Technologies公司产品。BCR-ABL（P210）融合基因检测试剂盒购自上海源奇生物医药科技有限公司，批号20130303、20131212、20140411和20150327，分别简称为R1、R2、R3、R4；质控物为本实验室制备，批号20130725、20140611，分别简称为Q1、Q2。

二、室内质控物的制备及分装

1．Q1批号质控物：取本实验室培养的K562细胞[BCR-ABL (P210）阳性]并进行细胞计数，430×g离心5 min，去上清，PBS洗涤2遍，加入TRIzol稀释为5 × 10⁵ /ml，作为高浓度质控物，其BCR-ABL（P210）预期检测结果相当于CML患者初诊水平[5],[7]–[8]；按同样方法取HL-60细胞[BCR-ABL（P210）阴性]，PBS洗涤2遍，加入TRIzol稀释为1×10⁶/ml，将K562与HL-60细胞按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000稀释，进行RQ-PCR检测，低浓度质控物的选择原则：选取IS转换后BCR-ABL（P210）结果接近主要分子学反应（MMR）即0.1%[3],[5],[7]–[8],[10]的稀释倍数作为长期低浓度质控物。将上述2种质控物充分混匀，分别分装于去RNAase的Ep管，每管1 ml，−80 °C冰箱冷冻保存。

2．Q2批号质控物：2014年6月11日按上述制备Q1批号质控物的方法制备并分装保存Q2批号质控物。

三、质控物及CML患者标本的检测

1．RNA提取：每批次实验按操作规程严格进行，取高、低浓度质控物各1管，按说明书与临床标本同时提取总RNA。

2．试剂配制及加样：以ABL为内参基因，按照说明书分别配制ABL和BCR-ABL的PCR反应液，加入PCR反应管内，然后在其中分别加入上述提取的临床标本及高、低浓度质控物的RNA，并设置阴性、空白及阳性对照、ABL质粒标准品（10³、10⁴、10⁵、10⁶拷贝），反应总体积15 µl。

3．PCR扩增及结果表示：循环条件设置为42 °C 30 min；94 °C 5min；94 °C 15 s, 60 °C 60 s，40个循环，37 °C 1 min。反应结束后，阈值设置为5 000，根据标准曲线，计算出待测标本的BCR-ABL（P210）和内参基因ABL的拷贝数，结果以BCR-ABL (P210）拷贝数/ABL拷贝数×100％表示（文中所有结果为IS转换前结果）。

四、统计学处理

1．统计学分析：按试剂批号统计分析标准曲线斜率、截距和相关系数，并按试剂批号和质控物批号统计分析高、低浓度质控物检测结果，对标准曲线斜率、截距及质控物检测结果分别用SPSS19.0统计软件进行不同试剂批号间两两比较的方差齐性分析和t检验，以P<0.05为两批号结果差异有统计学意义。并用Graphpad Prism 5软件做直方图，分别对Q1、Q2批号质控物检测结果进行不同试剂批号间的比较。

2．质控判断：用Excel做标准曲线斜率、截距及质控物结果的折线图，并对质控数据采用Levey-Jennings质控图结合1_3s/2_2s/R_4s/4_1s/10x的Westgard多规则质控方法进行评价[17]。质控结果超过x±2s限值时，为“警告”信号，提示本批结果可能有问题，如需进一步判断质控数据是否失控，则启动1_3s、2_2s、R_4s、4_1s、10x质控规则（1_3s失控规则：当质控物数据超过x±3s限值时，为失控；2_2s失控规则：同一质控物连续两次同方向超出x±2s限值，或同批两个质控物结果同方向超出x±2s限值，为失控；R_4s规则：同一批中两个质控结果之差超出4s范围；4_1s失控规则：同一质控物连续4次同方向超出x±s限值，或两个质控物结果同时同方向连续2次超出x±s限值，为失控；10 x失控规则：同一质控物结果连续10次落在x值同一侧，或两个质控物包括本批次两个测定值在内的连续10个测定值落在x值同一侧，为失控）。

结果

一、实验体系的可靠性

每次实验结果，阴性和空白对照为阴性，阳性对照为阳性，且数值在规定范围内，标准品及高、低浓度质控物的扩增曲线呈S型，说明每次实验均成功。

二、质控物浓度的选择

K562与HL-60细胞系列稀释后检测结果如表1所示，根据选择原则，最终以1∶3 000稀释作为长期低浓度质控物。

表1. K562细胞与HL-60细胞系列稀释后BCR-ABL检测结果比较（％）.

浓度	均数	国际标准化值
1∶1 000	1.84	0.66
1∶2 000	0.83	0.30
1∶3 000	0.31	0.11
1∶4 000	0.19	0.07

三、标准曲线的结果分析

1．不同批号试剂盒间斜率、截距的差异分析：不同批号试剂盒标准曲线的斜率、截距、相关系数结果如表2所示，各批号试剂盒间标准曲线差异均有统计学意义或接近统计学意义，说明不同批号试剂存在差异。

表2. 不同批号试剂标准曲线斜率、截距及相关系数.

试剂批号	检测次数	斜率			截距			相关系数
		x	s	CV（%）	x	s	CV（%）	Q25	M	Q75
R1	53	−3.46	0.12	3.34	41.73	0.82	1.96	0.9989	0.9993	0.9997
R2	37	−3.40	0.18	5.41	41.25	1.44	3.48	0.9980	0.9991	0.9996
R3	80	−3.38a	0.08	2.25	40.13ab	0.52	1.30	0.9976	0.9988	0.9996
R4	14	−3.33ac	0.09	2.70	39.04abd	0.43	1.11	0.9979	0.9988	0.9995

注：与R1批号比较，^aP<0.01；与R2批号比较，^bP <0.01；与R3批号比较，^cP<0.05，^dP<0.01

2．斜率、截距不同批号试剂盒间的校正转换及质控图的延续：分别用R1检测53次的标准曲线的斜率、截距绘制L-J质控图即图1、2, R2标准曲线的斜率、截距与R1比较差异无统计学意义（P>0.05），直接使用图1、2, R3和R4标准曲线与R1比较差异均有统计学意义（P<0.05），斜率分别通过倍数0.98、0.96，截距分别通过倍数0.96、0.94转换后使用图1、2。

图1. 标准曲线斜率L-J质控图.

图2. 标准曲线截距L-J质控图.

3．斜率、截距的质控判断：不同批号试剂盒标准曲线斜率和截距质控图如图1、2所示。R1检测53次，斜率第48次出现“警告”，Westgard分析未失控，其余无“警告”、“失控”；R2检测37次，斜率失控6次（第7、11、22、30、31、34次），且第2~8次在x−s限值下侧，第12~37次在x值上侧，截距失控9次（第4、7、28、29、30、31、34、36、37次），且第1~8次在x+s限值上侧，第12~37次都在x值下侧，说明R2不稳定；R3检测80次和R4检测14次，其斜率、截距均无“警告”、“失控”。

四、室内质控物的检测结果分析

不同批号试剂检测不同批号质控物结果见表3。

表3. 不同质控物批号及试剂批号质控物检测结果分析.

试剂批号	质控物批号	时间段	检测次数	浓度水平	检测结果（%）			P值（x的倍数）
					x	s	CV
R1	Q1	2013-08-20–2014-04-11	49	高	185.95	54.46	29.29
				低	0.34	0.11	31.14
	Q2	2014-07-21–2014-07-28	4	高	242.76	41.18	16.96
				低	0.51	0.22	42.34
R2	Q1	2013-12-31–2014-04-11	23	高	300.52	102.37	34.06	0.000（1.62）
				低	0.53	0.22	41.56	0.001（1.56）
	Q2	2014-06-13–2014-08-01	14	高	246.10	38.78	15.76	0.000（1.32）
				低	0.36	0.11	30.94	0.575（1.05）
R3	Q1	2014-08-01–2014-08-26	8	高	221.11	43.67	19.75
				低	0.40	0.15	38.61
	Q2	2014-06-13–2015-10-13	72	高	229.93	52.27	22.73	0.000（1.24）
				低	0.49	0.11	21.54	0.000（1.44）
R4	Q2	2015-04-07–2015-10-28	14	高	172.30	27.75	16.11	0.211（0.93）
				低	0.27	0.05	19.53	0.001（0.79）

注：P值（x的倍数）为更换试剂或质控物批号时，与R1检测Q1质控物结果均数的比较

1．Q1批号质控物检测结果不同批号试剂的比较：如图3A所示，R2的检测结果偏高于R1，差异有统计学意义（P_高=0.000，P_低=0.001）；R3与R1接近（P_高=0.089，P_低=0.184）；R2的检测结果偏高于R3（P_高＝0.005，P_低＝0.126）。

图3. 不同批号试剂检测不同批号质控物结果.

A：Q1批号质控物；B：Q2批号质控物

2．Q2批号质控物检测结果不同批号试剂的比较：如图3B所示，R3的检测结果与R1接近（P_高= 0.631，P_低=0.858）；而R4与R1比较，质控物结果偏低（P_高=0.001，P_低=0.111），R4与R3比较，质控物结果偏低（P_高=0.000，P_低=0.000）。

3．更换试剂或质控物批号时质控物结果的校正转换和质控图的延续：分别用R1检测Q1批号质控物49次的高、低浓度质控物结果绘制L-J质控图，即图4、图5。如表3所示，更换试剂批号或质控物批号时，与R1检测Q1比较，质控物结果差异均有统计学意义，因此分别将R2检测Q1、R2检测Q2、R3检测Q2及R4检测Q2的质控物结果用表3所示均数的倍数转换后使用图4、图5。

图4. 高浓度质控物结果L-J质控图.

图5. 低浓度质控物结果L-J质控图.

4．质控物结果的质控判断：如图4、图5所示，R1检测Q1批号质控物49次，高浓度质控物结果第7、12次“警告”，低浓度质控物结果第40、41次“警告”，经Westgard判断未失控；R2检测Q1批号质控物23次，高浓度质控物结果第2次“警告”，低浓度质控物结果第2、5、8次“警告”，经Westgard判断第2次失控；R2检测Q2批号质控物14次，低浓度质控物结果第10次“警告”，经Westgard判断未失控；R3检测Q2批号质控物72次及R4检测Q2批号质控物14次，质控物结果均无“警告”、“失控”。

讨论

目前室内质控在HBV、HCV、CMV的核酸定量检测方面已相当成熟，多数研究仅采用质控物结果进行质控判断，亦有文献利用质控物结果结合标准曲线斜率、截距作为室内质控的监测手段[16],[18]–[19]。BCR-ABL (P210）转录本水平定量检测的室内质控，目前正处于探索阶段，虽然Adelaide实验室等在此方面做了一定工作[3],[8]–[10]，但目前尚无统一的BCR-ABL (P210）室内质控标准。

本实验室根据自身情况并结合相关研究制备了高、低浓度质控物[3],[9]–[11],[13]。有文献报道，BCR-ABL转录本水平较高时，内参基因的不同可造成检测结果被高估或低估，因而CF值仅适用于BCR-ABL^IS≤10％时；基于MMR的临床指导意义及CF值的适用范围，我们认为低浓度质控物意义更大[3],[6]–[8]。每次检测临床标本时，应同条件进行质控物检测，以保证检验结果的准确性，使得批内重复性和精密度得到最大限度保证[18]。

试剂稳定是进行质量控制和临床检测的前提，试剂稳定性可根据扩增反应的标准曲线斜率、截距的质控来进行判定和动态监控[20]–[21]。在保证试剂、标准曲线有效后，可对质控物结果进行质控判断，从而决定PCR结果是否可靠，报告单能否发放。本实验中我们共使用了4批试剂、两批质控物，质控物结果的变异系数与国际权威的Adelaide实验室一致[3]。R1检测Q1、R3检测Q2及R4检测Q2的质控物结果均无失控，说明质控结果满意，两批号质控物分装、保存后稳定性好。R1、R3及R4标准曲线的斜率、截距均无失控，说明这三个批号试剂稳定可靠。R2检测的37次，标准曲线斜率变异系数大于5%，且斜率、截距变异系数均大于其余三批试剂，结合斜率、截距及质控物的质控判断结果，标准曲线失控11次（违背1_3s、2_2s、4_1s、10 x规则），且多次连续落在x值一侧甚至超出x+s或x−s限值，存在严重系统误差和随机误差[12]–[13],[17]；虽然利用R2得到的质控物结果仅失控1次，但总体波动较大，且低浓度质控物结果多次出现“警告”，因而判定R2批号试剂不稳定，需及时进行更换。

根据Westgard多规则判定方法，检测结果没有超出x+2s限值不属于失控，但如果出现倾向性改变，则提示系统误差，检验人员应尽快寻找原因予以纠正[14],[17]。本研究中，除R2斜率、截距多次连续落在x值一侧甚至超出x+s或x−s限值外，R1、R3、R4的标准曲线斜率、截距及质控物结果也出现倾向性改变，我们发现后及时排查原因，发现与更换加样器、操作人员变动等有关，纠正后恢复正常。

本实验主要为回顾性研究，实际工作中可用前20次的结果绘制L-J图，结合Westgard多规则质控方法进行质控判断，随检测次数增加，定期调整均值、标准差并绘制L-J质控图。更换试剂或质控物批号时，应以新的质控物或试剂重新检测至少20次，累积数据绘制新质控图，也可校正转化后使用原质控图。然而，在质控图的延续方面可能存在很多困难，李金明等[22]提出可以利用回归方程来解决这一问题。本实验更换试剂批号或质控物批号时，与前一批号试剂或质控物在工作日交叉检测，并同时检测约10次，通过对数据进行比较和差异分析，再通过均数的倍数转换后使用原质控图，质控结果满意，我们认为这种转换方法可行，实验室应结合自身情况探索质控图延续方法。

试剂更换可能会影响BCR-ABL转录本水平的检测值，影响CF值，因此不要频繁更换试剂批号，更不要轻易更换生产厂家。要保证获得的CF值持续有效，自身实验室须严格执行标准化操作方案，严格进行室内质控，一旦检测方案有变化，需重新验证CF值[3]–[4],[6],[9]–[10],[15]。若CF值未及时再确认，在保证检测结果准确、可靠的前提下，可将临床标本检测结果经质控物结果均数的倍数转换后使用原CF值，以保证检测结果的可比性。

因而，室内质控物是否在控是能否发放报告最常用也是最主要的依据，室内质控在临床检测中具有极其重要的地位，本实验室制备了高、低浓度质控物，利用其检测结果结合标准曲线斜率、截距进行室内质控，并采用Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法进行质控判断，能更有效地保证BCR-ABL (P210）转录本水平检测结果的可靠性、准确性。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81470319）

Fund program: National Natural Science Foundation（81470319）