弥漫大B细胞淋巴瘤患者HBV、HCV及EBV感染分析

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）最常见的亚型。欧美国家发病率占NHL的30%~40%，而亚洲国家略高于40%[1]。DLBCL病因学及发病机制尚不清楚，多年来，病毒感染与淋巴瘤的关系一直备受关注。近年来，许多研究表明病毒感染可增加DLBCL的发病风险。本研究中，我们通过检测DLBCL患者病理组织中乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、EB病毒（EBV）感染情况，探索病毒感染相关性DLBCL的临床特征。

病例与方法

1．临床资料：收集2009年1月至2015年1月在我院确诊的87例DLBCL患者资料及活检标本。87例患者的标本中61例为冰冻标本，26例为石蜡包埋标本。87例患者在诊断时均进行外周血HBV及HCV的筛查，78例患者在病理诊断时根据Hans分类法进行了免疫亚型的分型，81例患者进行了EBER (EBV编码的小RNA）检测。

2．血清HBV、HCV感染判定标准：血清HBV感染判定标准：HBV感染分为经典感染组（HBsAg、HBeAg任一阳性）和既往HBV感染且存在HBV再激活风险组（HBeAb、HBcAb任一阳性），并将任意一项阳性作为血清HBV检测阳性组纳入分析研究。血清HCV感染判定标准：抗HCV抗体阳性作为判断HCV感染的指标。

3．组织标本的准备：①冰冻标本冻存于−80 °C冰箱或液氮中。−20 °C行冰冻切片，厚度5 µm，以备行免疫组化检测；另取50~100 mg组织立即提取总RNA、取10~30 mg组织立即提取总DNA以备行HCV-RNA及HBV-DNA检测。②石蜡包埋标本收集于2014年1月至2015年1月。切片厚度5 µm，以备行免疫组化检测；10 µm切片4片置于无RNA酶的EP管中提取总RNA、10 µm切片6片置于EP管内提取总DNA以备行HCV-RNA及HBV-DNA检测。

4．主要试剂：HBsAg抗体购于美国Life Technologies公司，HCV非结构蛋白NS5（HCV-NS5）抗体购于美国AbD Serotec公司，EBER试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，生物素化的羊抗人第二抗体及免疫组化第三抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，冰冻组织总DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，石蜡组织总RNA及总DNA提取试剂盒购于德国QIAGEN公司，RNA逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher Scientific公司，PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，HBV-DNA及HCV-RNA引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

5．检查方法：免疫组化染色采用免疫酶法，冰冻标本免疫组化染色无需抗原修复。EBER检测采用原位杂交方法。PCR及RT-PCR扩增组织中的HBV-DNA及HCV-RNA，根据文献[2]–[3]直接引用HBV及HCV引物，并自行设计STAT3 exon13外显子引物及β-actin引物。

结果判断：免疫组化评分标准采用阳性细胞百分比和染色强度综合计分。阳性细胞数<25％计0分，≥25％且<50％计1分，≥50％且<75％计2分，≥75％计3分；不着色及微弱着色计0分，着浅黄色计1分，着棕黄色计2分，着深棕色计3分；两者相加<4分为低表达，两者相加≥4分为高表达。原位杂交结果判断标准采用阳性细胞占肿瘤细胞百分比≥20％为表达，<20％为不表达。PCR及RT-PCR扩增结果采用琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带出现即为阳性表达。

6．统计学处理：应用SPSS13.0软件进行统计学分析。免疫组化及PCR结果均为定性数据，采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1．一般临床特征：纳入研究的87例患者中，男51例，女36例，中位发病年龄57 (20~79）岁。血清HBV阳性者69例（79.3%），其中HBsAg阳性率为16.1%（14/87），HBsAg阴性而HBcAb阳性率为60.9%（53/87），HBsAg阴性而HBeAb阳性率为2.3%（2/87）。87例患者中无血清HCV抗体阳性者。

2．HBV检测结果：组织中HBsAg表达定位于细胞质，阳性表达者42例（48.3%），其中高表达者10例（11.5%），低表达32例（36.8%）（图1A）。血清HBV阳性者中组织HBsAg阳性率为47.8%（33/69），血清HBV阴性者为50.0%（9/18），差异无统计学意义（P=0.869）。冰冻标本组织HBsAg阳性率为65.6%（40/61），高于石蜡包埋标本的7.7%（2/26）（P= 0.000）（表1）。

图1. 弥漫大B细胞淋巴瘤患者病理组织标本HBV、HCV及EBV染色结果.

A：免疫组化法检查示胃部冰冻标本HBsAg阳性表达；B：免疫组化法检查示胃部冰冻标本HCV-NS5阳性表达；C：原位杂交方法检查示淋巴结标本EBV编码的小RNA阳性表达

表1. 弥漫大B细胞淋巴瘤患者患者血清HBV与组织HBsAg、HBV-DNA表达情况[例（％）].

组别	例数	组织HBsAg表达			组织HBV-DNA表达
		阳性	阴性	P值	阳性	阴性	P值
所有患者	87			0.869			0.419
血清HBV表达阳性组	69	33（47.8）	36（52.2）		49（71.0）	20（29.0）
血清HBV表达阴性组	18	9（50.0）	9（50.0）		11（61.1）	7（38.9）
冰冻标本患者	61			0.929			0.173
血清HBV表达阳性组	49	32（65.3）	17（34.7）		31（63.3）	18（36.7）
血清HBV表达阴性组	12	8（66.7）	4（33.3）		5（41.7）	7（58.3）
石蜡包埋标本患者	26			0.347			0.585
血清HBV表达阳性组	20	1（5.0）	19（95.0）		18（90.0）	2（10.0）
血清HBV表达阴性组	6	1（16.7）	5（83.3）		6（100.0）	0

87例患者标本中60例（69.0%）肿瘤组织HBV-DNA表达阳性，其中冰冻标本36例（60.0%）、石蜡包埋标本24例（40.0%）。血清HBV阳性者中组织HBV-DNA阳性率为71.0%（49/69），血清HBV阴性者为61.1%（11/18），差异无统计学意义（P=0.419）。石蜡包埋标本组织HBV-DNA阳性率为92.3%（24/26），高于冰冻标本的59.0%（36/61）（P=0.002）（表1）。

将组织HBsAg及HBV-DNA任意一项阳性作为组织HBV检测阳性的标准，并与血清HBV感染情况进行对比发现：血清及组织HBV均阳性者共计60例，血清HBV阳性率为79.3%（69/87），组织中HBV阳性率为87.4%（76/87），差异无统计学意义（P=0.827）（表2）。

表2. 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血清及组织HBV表达情况.

组织HBV表达	血清HBV表达		合计
	阳性	阴性
阳性	60	16	76
阴性	9	2	11
合计	69	18	87

78例可进行Hans分型的患者中，生发中心（GCB）和非生发中心（non-GCB）两种亚型间无论是血清HBV阳性率（26.9％对52.6%，P=0.786）还是组织HBV阳性率（28.2％对59.0%，P=0.273）差异均无统计学意义。

3．HCV检测结果：组织HCV-NS5表达定位于细胞质，阳性表达者共10例（11.5%），高表达者2例（2.3%）、低表达者8例（9.2%）（图1B）。所有肿瘤组织中HCV-RNA均呈阴性表达。

4．EBV检测结果：进行肿瘤组织EBER检测的81例患者中5例阳性（6.2%），其中2例为GCB亚型，2例为non-GCB亚型，1例免疫亚型未定，3例同时伴组织HBV检测阳性。EBER阳性结果见图1C。

讨论

早在1977年，就有学者提出HBV感染可能与淋巴细胞增殖性疾病相关[4]。随着人们对淋巴瘤认识的提高，近年来多项Meta分析及多中心研究结果均表明HBV及HCV感染使B-NHL发病率增加2~3倍[5]–[8]。Hermine等[9]的研究甚至发现，干扰素联合利巴韦林治疗HCV感染的脾淋巴瘤后疾病获得缓解。我国作为HBV感染高流行区，DLBCL患者血清HBsAg阳性率高达25%~61%[10]。在本研究中我们将一组DLBCL患者血清及组织HBV阳性表达情况进行对比后发现，患者组织中HBV阳性率较血清中更高（87.4％对79.3%），甚至在18例血清HBV检测阴性患者组织中检测出HBV阳性表达。由于免疫组化及PCR方法是在细胞及分子水平进行病毒检测，可发现病毒复制不明显、或者正处于静止期的病毒感染情况，因此其检测的敏感性较血清中更高。而组织HBV阳性患者中，冰冻标本HBsAg阳性率明显高于石蜡包埋标本，与以往研究结果不一致，推测与使用冰冻标本有关。冰冻标本能更好地保持抗原活性及DNA的完整性，避免切片制作过程中抗原被封闭甚至破坏，因此冰冻标本中检测组织抗原表达较石蜡包埋标本更为敏感可靠。而石蜡包埋标本HBV-DNA阳性表达率高于冰冻标本，或许是因为实验中使用匀浆机研碎冰冻标本时组织细胞破坏而致DNA流失所致。另外本研究从10例血清抗HCV抗体阴性患者的肿瘤组织中检出HCV-NS5抗原阳性表达，与El-Sayed等[11]以及Paydas等[12]的研究结果相似，他们认为无论是采用免疫组化还是RT-PCR法，组织中HCV阳性检出率均高于血清。

我们通过免疫组化及PCR、RT-PCR方法在DLBCL组织中发现了HBV及HCV的存在。病毒的长期慢性刺激所致B细胞继发性基因突变或染色体易位等异常，可能是肿瘤发生的原因[13]–[15]。临床上HBV及HCV感染相关性DLBCL患者发病年龄更早、IPI评分更低、总生存期更短，预后更差[16]–[17]。治疗上R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）仍是主要方案。然而，利妥昔单抗化疗期间诱发患者HBV再激活成为临床关注的焦点之一。我国HBsAg阳性淋巴瘤患者接受化疗时HBV再激活发生率为21%~60%，HBsAg阴性者为2%~25%[10]。本研究中血清HBsAg阴性而HBcAb阳性者比例为60.9%，明显高于流行病学调查水平[10]（20%~44%），且血清HBsAg阴性而HBeAb及HBcAb均阳性者组织中HBsAg及HBV-DNA阳性率也更高，值得进一步进行多中心大样本研究。不足之处在于，本研究未检测患者血清HBV-DNA阳性情况，无法与组织中HBsAg及HBV-DNA检测结果进行比较。

在本研究中我们发现DLBCL患者组织EBV阳性检出率为6.2%，略低于亚洲地区的水平（8.7%~11.4%）[18]，其中3例组织中同时检出HBV阳性，且这些患者外周血淋巴细胞计数均低于正常，这或许是其更容易合并多种病毒感染的原因。

本研究我们通过检测组织中HBV、HCV及EBV感染情况，并与血清病毒感染情况进行对比发现，组织中HBV、HCV两种肝炎病毒感染阳性检出率高于血清，且血清HBsAg阴性而HBeAb及HBcAb阳性者组织中均有HBV阳性表达。对于接受免疫抑制剂治疗的淋巴瘤患者，追踪观察其血清HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb中任意一项阳性在治疗过程中的变化，对判定淋巴瘤患者HBV是否再激活是十分重要的风向标。