Abstract
目的
分析霉酚酸酯（MMF）预防疗程对于“北京方案”单倍体相合造血干细胞移植（haplo-HSCT）后急性移植物抗宿主病（GVHD）的影响。
方法
回顾性分析2016年9月至2017年3月在北京大学血液病研究所接受haplo-HSCT的237例标危成人（≥14岁）血液肿瘤患者，男140例（59.1%），女97例（40.9%），中位年龄30（14~60）岁。根据MMF疗程分为长疗程组（MMF 500 mg/d口服，−9 d开始，+30 d减半，+45~+60 d停药，合并CMV血症、EBV血症或迟发出血性膀胱炎者提前停用）和短疗程组（MMF 500 mg/d口服，−9 d开始，中性粒细胞植活后停药）。
结果
长疗程组（102例）、短疗程组（135例）MMF中位用药时间分别为27（7~71）、15（9~24）d。两组患者在性别、年龄、疾病类型、HLA不合位点、供受者关系、供受者血型、供者性别、供者年龄方面差异均无统计学意义。长疗程组、短疗程组Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率分别为31.1%、17.6%（P=0.018）、Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD发生率分别为7.4%、7.8%（P=0.900）。多因素分析未发现MMF预防疗程长短对Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD有显著影响。两组CMV血症、EBV血症、出血性膀胱炎发生率及总生存率差异均无统计学意义（P值均>0.05）。
结论
短疗程MMF预防并未增加“北京方案”haplo-HSCT患者急性GVHD发生率，对总生存亦无显著影响，可能是一种安全可行的方案。
Keywords: 造血干细胞移植, 移植物抗宿主病, 霉酚酸酯
Abstract
Objective
To investigate the impact of mycophenolate mofetil (MMF) prophylaxis duration on acute graft-versus-host disease (aGVHD) after haploidentical stem cell transplantation (haplo-HSCT) using ‘Beijing Protocol’.
Methods
Adult patients (≥14 years) received haplo-HSCT in Peking University Institute of Hematology from Sep, 2016 to Mar, 2017 were retrospectively reviewed if they fulfilled the criterias: ①diagnosed with hematological maligancies; ②standard-risk status at haplo-HSCT. A total of 237 patients [including 102 patients with long MMF duration (defined as started on day −9 with 100 mg/d, adjusted to 500 mg/d from day +30 and discontinued on day +45 to +60 or occurrence of CMV/EBV reactivation or late-onset hemorrhagic cytitis), and 135 patients with short MMF duration (defined as started on day −9 with 500 mg/d and discontinued on the day achieved neutrophil engraftment)] were reviewed. The incidence of aGVHD, virus infection and overall survival (OS) were compared between the two groups.
Results
The median durations of MMF prophylaxis of long and short duration groups were 27(7–71) and 15(9–24) days, respectively after haplo-HSCT. There were no differences of baseline characteristics (including sex, patient age, disease, mismatched HLA loci, donor-recipient relation, donor-recipient sex and donor age) between the two groups. The incidences of the grade Ⅱ–Ⅳ and Ⅲ/Ⅳ aGVHD in long and short duration groups were 31.1% versus 17.6% (P=0.018) and 7.4% verus 7.8% (P=0.900), respectively. The duration of MMF prophylaxis was not found to be associated with gradeⅡ–Ⅳ aGVHD by the multivariate analysis. There were no significant differences in terms of CMV viremia, EBV viremia, hemorrhagic cytitis and OS between the two groups.
Conclusion
Prophylaxis with short duration MMF in the setting of ‘Beijing protocol’ haplo-SCT was not associated with increased acute GVHD with no impact on OS, which indicated that short duration MMF might be a feasible GVHD prophylaxis regimen.
Keywords: Hematopoietic stem cell transplantation, Graft vs host disease, Mycophenolate mofetil
单倍体相合造血干细胞移植（haplo-HSCT）对于需要接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）而又缺乏同胞相合供者的患者而言是一个很好的替代选择[1]–[3]。急性移植物抗宿主病（GVHD）是haplo-HSCT的重要并发症及死亡原因之一[4]。有效的GVHD预防对于提高haplo-HSCT临床疗效具有重要意义，然而预防方案过于强烈时又可能会延缓免疫重建而增加感染并发症的发生，因此理想的急性GVHD预防方案应达到免疫抑制与免疫重建之间的平衡，然而目前并没有适用于haplo-HSCT的急性GVHD标准预防方案。
作为近年来成功的haplo-HSCT方案之一，“北京方案”采用G-CSF动员的移植物以及含抗胸腺细胞球蛋白（ATG）预处理方案，同时给予环孢素A（CsA）加短程甲氨蝶呤（MTX）联合霉酚酸酯（MMF）作为急性GVHD预防方案，取得了良好效果，Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD发生率约为10%[5]。MMF通过抑制嘌呤核苷酸代谢途径选择性抑制T细胞和B细胞的增殖和功能从而发挥免疫抑制作用，已广泛用于造血干细胞移植后急性GVHD的预防和治疗。但MMF增加了巨细胞病毒（CMV）感染的发生率[6]。“北京方案”也应用MMF预防急性GVHD，但MMF的最佳预防疗程却尚无答案。本研究探讨缩短MMF预防疗程对急性GVHD发生率和病毒感染并发症发生率的影响。
病例与方法
1．病例纳入标准：本回顾性研究纳入符合以下条件的患者：①2016年9月至2017年3月在北京大学血液病研究所接受首次haplo-HSCT；②年龄≥14岁；③原发病为急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、骨髓增生异常综合征（MDS）；④移植前疾病状态为标危（急性白血病处于第1次或第2次完全缓解）；⑤不包括供者为母亲、旁系并采用后置环磷酰胺（PTCY）方案进行GVHD预防的病例。本研究经北京大学人民医院伦理委员会批准。
2．移植方案：移植方案见文献[7]。预处理方案为改良白消安（Bu）/环磷酰胺（Cy）+ATG方案：阿糖胞苷4 g/m2静脉滴注，−10、−9 d；白消安0.8 mg/kg静脉滴注每6 h 1次，−8 d~−6 d；Cy 1.8 g·m−2·d−1静脉滴注，−5、−4 d；司莫司汀250 mg/m2口服，−3 d；ATG 2.5 mg·kg−1·d−1静脉滴注，−5 d~−2 d。
3．GVHD预防方案及分组：采用CsA加短程MTX联合MMF预防GVHD。根据MMF疗程分为：①长疗程组：2016年10月前的所有患者从−9 d开始口服MMF 500 mg/d，+30 d减半，+45 d~+60 d停药[合并CMV血症、EB病毒（EBV）血症或迟发出血性膀胱炎（HC）者提前停药]。②短疗程组：MMF 500 mg/d，−9 d开始，中性粒细胞植活后停用。
4．定义：中性粒细胞植活：ANC>0.5×109/L连续3 d。血小板植活：PLT>20×109/L连续7 d并脱离血小板输注。急性GVHD的诊断及分级采用西雅图标准[8]。难治性CMV血症：抗病毒治疗2周未转阴。
5．随访：采用门诊、电话等方式随访。随访截止日期为2017年5月24日，存活者中位随访时间为移植后181（56~412）d。
6．统计学处理：分类变量采用χ2检验或Fisher精确检验，连续变量采用Student's t检验或Mann-Whitney检验。总生存（OS）时间：末次移植物回输至末次随访或死亡的日期。OS率的分析采用Kaplan-Meier曲线法，复发率和移植相关死亡率计算采用含竞争风险的累计发生率。多因素分析采用Cox风险比例回归模型，双侧P<0.05为差异有统计学意义，采用SPSS11.5软件进行数据分析。累积发生率采用R软件计算。
主要研究终点为移植后100 d Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率。次要研究终点为Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD、CMV血症发生率、难治性CMV血症发生率、EBV血症发生率、HC发生率、6个月OS率。
结果
1．患者特征：本研究共纳入237例患者，其中短疗程组135例（57.0%），长疗程组102例（43.0%）。男140例（59.1%），女97例（40.9%）。中位年龄30（14~60）岁。AML 107例（45.1%），ALL 104例（43.9%），MDS 26例（10.9%）。HLA配型1个位点不合6例（2.5%），2个位点不合27例（11.4%），3个位点不合204例（86.1%）。供者为父亲104例（43.9%），供者为同胞65例（27.4%），供者为子女68例（28.7%）。供受者血型相合148例（62.4%），主要不合42例（17.7%），次要不合35例（14.8%），双向不合12例（5.1%）。供者中男184例（77.6%）、女53例（22.4%），中位年龄38（13~61）岁。中性粒细胞植活中位时间为13（9~26）d，血小板植活中位时间为17（9~170）d。CMV血症发生率为84%（199/237），中位发生时间为36（14~72）d，难治性CMV占CMV血症患者的42.2%（84/199）。HC发生率为40.9%（97/237），其中Ⅲ/Ⅳ度HC发生率为6.3%（15/237）。急性GVHD中位发生时间为22.5（10~89）d，Ⅰ~Ⅳ度急性GVHD发生率为54.9%（130/237），Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率为25.3%（60/237），Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD发生率为7.6%（18/237）。EBV血症发生率为31.2%（74/237）。存活者中位随访期为181（56~412）d，移植后6个月OS率为89.0%。
两组患者在性别、年龄、疾病类型、HLA不合位点、供受者关系、供受者血型、供者性别、供者年龄方面差异均无统计学意义（P>0.05）。长疗程组MMF中位用药时间长于短疗程组[27（7~71）d对15（9~24）d，P<0.001]。两组患者临床特征比较见表1。
表1. 不同霉酚酸酯预防疗程单倍体相合造血干细胞移植患者基线特征比较.
| 指标 | 长疗程组（102例） | 短疗程组（135例） | 统计量 | P值 |
| 性别[例（%）] | 0.217（χ2值） | 0.690 | ||
| 男 | 78（76.5） | 62（45.9） | ||
| 女 | 24（23.5） | 73（54.1） | ||
| 年龄[岁，M（范围）] | 30（15～58） | 30（14～60） | 0.100（t值） | 0.854 |
| 原发病[例（%）] | 0.126（χ2值） | 0.939 | ||
| AML | 46（45.1） | 61（45.2） | ||
| ALL | 44（43.1） | 60（44.4） | ||
| MDS | 12（11.8） | 14（10.4） | ||
| HLA不合位点[例（%）] | 2.133（χ2值） | 0.344 | ||
| 1 | 3（2.9） | 3（2.2） | ||
| 2 | 15（14.7） | 12（8.9） | ||
| 3 | 84（82.4） | 120（88.9） | ||
| 供受者关系[例（%）] | 3.141（χ2值） | 0.208 | ||
| 父供子女 | 41（40.2） | 63（46.7） | ||
| 同胞 | 34（33.3） | 31（23.0） | ||
| 子女供父母 | 27（26.5） | 41（30.3） | ||
| 供受者血型[例（%）] | 0.412（χ2值） | 0.938 | ||
| 相合 | 64 | 84 | ||
| 主要不合 | 19 | 23 | ||
| 次要不合 | 14 | 21 | ||
| 主要不合+次要不合 | 5 | 7 | ||
| 供者年龄[岁，M（范围）] | 39.5（13～60） | 30.5（15～61） | 1.047（t值） | 0.443 |
| 供者性别[例（%）] | 0.004（χ2值） | 0.952 | ||
| 男 | 79（77.5） | 105（77.8） | ||
| 女 | 23（22.5） | 30（22.2） | ||
| 霉酚酸酯疗程[d，M（范围）] | 27（7～71） | 15（9～24） | 102.752（t值） | <0.001 |
| 随访时间[d，M（范围）] | 197（7～412） | 158.5（37～384） | 32.130（t值） | <0.001 |
注：AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；MDS：骨髓增生异常综合征
2．MMF短疗程组与长疗程组的移植结果比较：长疗程组与短疗程组患者中性粒细胞植活时间差异无统计学意义[13（10~26）d对13（9~23）d，t=1.171，P=0.343]。两组患者血小板植活时间差异也无统计学意义[17（9~170）d对17（9~128）d，t=0.082，P=0.892]，详见表2。
表2. 不同霉酚酸酯预防疗程单倍体相合造血干细胞移植患者主要移植结果比较.
| 指标 | 长疗程组（102例） | 短疗程组（135例） | 统计量 | P值 |
| 中性粒细胞植活时间[d，M（范围）] | 13（10～26） | 13（9～23） | 1.171（t值） | 0.343 |
| 血小板植活时间[d，M（范围）] | 17（9～170） | 17（9～128） | 0.082（t值） | 0.892 |
| 急性GVHD[例（%）] | ||||
| Ⅰ～Ⅳ度 | 54（52.9） | 76（56.3） | 9.187（χ2值） | 0.057 |
| Ⅱ～Ⅳ度 | 18（17.6） | 42（31.1） | 5.571（χ2值） | 0.018 |
| Ⅲ/Ⅳ度 | 8（7.4） | 10（7.8） | 0.016（χ2值） | 0.900 |
| CMV血症[例（%）] | 88（82.2） | 111（86.3） | 0.709（χ2值） | 0.476 |
| 难治性CMV血症[例（%）] | 47（39.3） | 53（46.1） | 1.108（χ2值） | 0.353 |
| EBV血症[例（%）] | 31（31.9） | 43（30.4） | 0.058（χ2值） | 0.888 |
| 出血性膀胱炎[例（%）] | ||||
| Ⅰ～Ⅳ度 | 36（45.2） | 61（35.3） | 2.351（χ2值） | 0.330 |
| Ⅲ/Ⅳ度 | 6（6.7） | 9（5.9） | 0.060（χ2值） | 0.806 |
注：GVHD：移植物抗宿主病；CMV：巨细胞病毒；EBV：EB病毒
3．急性GVHD发生情况：长疗程组Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率高于短疗程组[（31.1±6.7）%对（17.6±6.8）%，χ2=5.571，P=0.018]，Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD发生率差异无统计学意义[（7.4±4.2）%对（7.8±5.0）%，χ2=0.016，P=0.900]（表2）。对影响Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD的影响因素进行多因素分析，未发现MMF预防疗程长短对Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD有显著影响（χ2=4.033，P=0.062）。
4．病毒感染：长疗程组、短疗程组移植后100 d CMV血症的发生率分别为（82.2±6.4）%、（86.3±6.6）%（χ2=0.709，P=0.476），难治性CMV血症发生率分别为（39.3±11.4）%、（46.1±13.0）%（χ2=1.108，P=0.353），EBV血症发生率分别为（31.9±18.0）%、（30.4±21.8）%（χ2=0.058，P=0.888），HC发生率分别为（45.2±6.4）%、（35.3±8.4）%（χ2=2.351，P=0.330），Ⅲ/Ⅳ度HC的发生率分别为（6.7±2.8）%、（5.9±3.2）%（χ2=0.060，P=0.806）。
5．生存情况：长疗程组、短疗程组移植后6个月OS率差异无统计学意义[（93.0±2.6）%对（84.2±3.4）%，χ2=1.679，P=0.195]（图1）。
图1. 不同霉酚酸酯预防疗程单倍体相合造血干细胞移植患者移植后总生存曲线.
讨论
MMF作为一种免疫抑制剂最早应用于实体器官移植后预防移植排斥，其疗效已经被大量临床研究证实[9]。MMF随后也被成功用于造血干细胞移植后GVHD的预防和治疗[10]。在同胞相合移植模式下，MMF+CsA方案与MTX+CsA方案预防GVHD疗效相似，同时伴有植入较快和口腔黏膜炎发生率低的优点[11]。在非血缘移植模式下，MMF也广泛用于GVHD的预防[12]。目前haplo-HSCT没有统一的GVHD预防方案，“北京方案”及“PTCY模式”haplo-HSCT方案中GVHD的预防中均包含了MMF。但目前尚无探讨MMF疗程对于GVHD影响的研究结果。
本研究结果显示，MMF早期停药（短疗程）并未增加GVHD的发生率。尽管此结论尚需前瞻性研究证实，但也提示“北京方案”的免疫抑制可能比较强烈，在此基础上缩短MMF疗程不会对GVHD产生影响。但是同时必须注意到研究本身固有缺陷：如MMF使用剂量偏低、总体疗程偏短，此外也未对霉酚酸浓度进行监测。
强烈免疫抑制带来的不利影响是免疫重建延迟和感染发生率升高。“北京方案”模式下CMV感染发生率达80%以上[13]–[14]。本研究结果显示，MMF短疗程组CMV、EBV血症的发生率并未降低。体外研究显示MMF不仅可以抑制T细胞和B细胞的增殖与功能，还可以抑制NK细胞的功能，对病毒激活有促进作用[15]。以往研究结果显示，allo-HSCT后使用MMF组较不使用MMF组CMV感染发生率明显升高[16]。但另一项减低强度预处理HSCT的研究发现MMF的使用并未影响CMV感染发生[16]，推测可能与MMF的剂量和疗程有关。在Hambach等[6]的研究中，MMF的中位应用时间为111 d，而McSweeney等[16]和本组病例的MMF疗程均短于30 d，因此推测小剂量短疗程MMF可能对CMV感染发生率无显著影响，但仍需进一步研究证实。此外，Kerbauy等[17]的研究结果显示，在PTCY模式haplo-HSCT中，MMF预防疗程<40 d时CMV感染发生率下降。而本组病例MMF疗程非常短（<30 d），且剂量仅为500 mg/d，这可能也是本研究中MMF疗程未能对CMV感染发生率产生影响的原因之一。此外，“北京模式”和PTCY模式本身的差异也可能是得出不同结果的原因之一。
综上，本研究结果显示短疗程MMF预防并未增加北京方案haplo-HSCT患者急性GVHD发生率，对患者的OS亦无显著影响，提示可能是一种安全可行的方案。但本研究存在以下缺陷：①为回顾性分析，存在选择偏倚；②随访时间较短且未评估对慢性GVHD的影响；③对生存的影响还需进一步随访观察。未来可以通过前瞻随机对照研究对MMF的疗程进行进一步优化。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金创新群体基金（81621001）；国家自然科学基金（81400143、81770189、81600103）；北京市自然科学基金（7164303）
Fund program: Innovative Research Groups of the National Natural Science Foundation of China (81621001); National Natural Science Foundation of China (81400143, 81770189, 81600103); Beijing Natural Science Foundation (7164303)
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