结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（extranodal natural killer/T-cell lymphoma, nasal-type, ENKTL）是一类高度侵袭性，具有特殊形态、免疫表型和生物学行为的非霍奇金淋巴瘤（NHL），其在亚洲多发而西方国家少见。在中国，占所有淋巴瘤的5%~10%，发病率居T细胞淋巴瘤首位[1]–[2]。有研究证实，以吉西他滨为基础的化疗方案优于传统的以蒽环类为基础的化疗方案，可明显改善ENKTL患者的预后[3]–[5]。但仍有一部分患者出现疾病进展或短期复发。常规的预后因素如IPI评分和EB病毒（EBV）定量有各自的局限性：IPI评分用来评估早期和晚期患者预后[6]；EBV-DNA不是一个独立的预后因素，只是一个肿瘤负荷的标志物，且需要动态监测[7]–[8]。因此，探讨ENKTL预后相关的生物标志物具有重要意义。在前期的研究中，我们应用液相色谱串联质谱（LC-MC/MC）技术，对32例晚期ENKTL患者标本进行差异表达蛋白质筛选鉴定，发现治疗无效组有61种蛋白质表达上调，22种蛋白质表达下调，其中14-3-3ζ蛋白在无效组中表达上调明显（另文发表）。本研究旨在进一步验证其在晚期ENKTL患者中的临床意义。
病例与方法
1．入组患者：以2011年8月至2015年12月郑州大学第一附属医院收治的46例ENKTL患者为研究对象。收集患者治疗前血清标本。所有入组患者符合以下标准：①根据2008年WHO淋巴造血系统肿瘤分类标准进行诊断；②初诊Ⅲ期或Ⅳ期；③之前没有肿瘤发生或第二肿瘤；④临床信息和随访数据完整可靠。所有患者均未进行化疗及放疗，病理诊断均由两位病理医师做出判定。收集每例入组患者临床和生物学资料，包括年龄、性别、诊断时间、EBV-DNA拷贝数、受累部位的CT或者MRI、分期、IPI评分、B症状（发热、盗汗、体重减轻）、LDH、化疗方案、治疗反应、总生存（OS）期、无进展生存（PFS）期。
2．治疗方案和疗效评价：入组患者接受DDGP方案治疗2~8个周期，具体为：吉西他滨1 000 mg/m2，静脉注射，第1、8天；培门冬酶2 500 IU/m2，肌肉注射，第1天；顺铂25 mg/m2，静脉注射，第1~4天；地塞米松12 mg/m2，静脉注射，第1~5天。21 d为1个周期。
疗效评价参照修订的Cheson's standard标准，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）。有效组定义为初始治疗后达到CR、PR，且PFS期>6个月。无效组定义为SD、PD或者短期缓解后6个月以内复发。
3．ELISA法检测14-3-3ζ蛋白表达水平：ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书进行操作。
4．随访：通过电话方式进行随访。随访截止日期为2017年6月30日。
5．统计学处理：采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。采用ROC曲线确定14-3-3ζ浓度的阈值并评估其预测作用。OS时间定义为从开始治疗至因任何原因死亡或末次随访时间。PFS时间定义为从开始治疗至疾病进展或任何原因死亡的时间。采用Mann-Whitney U检验对比有效组和无效组14-3-3ζ蛋白表达水平的差异。采用Kaplan-Meier进行生存分析，Log-rank检验对比两组间的差异。采用Cox比例风险回归模型对影响患者生存的预后因素进行单因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．一般临床特征：46例患者中，男34例，女12例，中位年龄42.5（13~76）岁。LDH升高（正常值范围为≤245 U/L）者29例（63.0%）；有B症状者19例（41.3%）；IPI评分>2分者23例（50.0%）；EBV-DNA≥5 000拷贝/ml者24例（52.2%）。
2．14-3-3ζ蛋白表达水平对疗效的影响：中位疗程数为5（2~8）个。根据初始治疗反应将患者分为有效组和无效组，46例患者中有效者21例（45.7%），无效者25例（54.3%）。Mann-Whitney U检验结果显示，无效组患者14-3-3ζ蛋白表达水平高于有效组，差异有统计学意义[（13.160±2.424）µg/L对（4.798±1.008）µg/L，z=2.393，P=0.005]。
应用ROC曲线确定14-3-3ζ蛋白表达水平的分界值为6.095 µg/L，敏感性为64.0%，特异性为85.7%，曲线下面积为0.707。<6.095 µg/L者定义为低水平组（27例），≥6.095 µg/L者定义为高水平组（19例）。
3．14-3-3ζ蛋白表达水平对预后的影响：中位随访时间为15（4~44）个月，46例患者总的2年OS率和PFS率分别为44.7%和41.1%。高水平组和低水平组的2年OS率分别为17.1%和64.9%，2年PFS率分别为15.8%和58.6%，差异均有统计学意义（P值均<0.001）（图1）。单因素分析结果显示，治疗前EBV-DNA≥5 000拷贝/ml（P<0.001）和14-3-3ζ蛋白表达水平≥6.095 µg/L（P<0.001）是影响患者预后的不良因素（表1）。
图1. 结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型患者不同14-3-3ζ蛋白表达水平组的总生存（A）和无进展生存（B）曲线比较.
表1. 影响结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型患者生存的单因素分析.
| 影响因素 | 总生存 |
无进展生存 |
||
| HR（95%CI） | P值 | HR（95%CI） | P值 | |
| 年龄>60岁 | 2.036（0.603～6.875） | 0.252 | 2.825（0.848～9.404） | 0.091 |
| 女性 | 1.199（0.444～3.233） | 0.720 | 1.470（0.554～3.904） | 0.439 |
| LDH>245 U/L | 1.804（0.775～4.201） | 0.171 | 1.925（0.850～4.360） | 0.116 |
| 有B症状 | 0.508（0.220～1.174） | 0.113 | 0.506（0.225～1.139） | 0.100 |
| IPI评分>2分 | 1.551（0.664～3.628） | 0.311 | 1.409（0.624～3.182） | 0.409 |
| EBV-DNA≥5 000拷贝/ml | 8.751（3.657～20.94） | <0.001 | 6.940（3.008～16.010） | <0.001 |
| 14-3-3ζ蛋白≥6.095 µg/L | 5.480（2.204～13.62） | <0.001 | 5.572（2.300～13.510） | <0.001 |
注：B症状：发热、盗汗、体重减轻
讨论
14-3-3蛋白家族为在真核细胞普遍存在的高度保守的酸性分子[9]–[10]，是一个重要的细胞生长信号分子，参与细胞周期、DNA损伤、凋亡、增殖等[11]–[12]。在哺乳动物中，它包括β/α、ε、η、γ、τ/θ、ζ和σ7个亚型，14-3-3ζ被认为与细胞转化、增殖和抑制凋亡直接相关[13]。已有研究发现，14-3-3ζ高表达与乳腺癌、肺癌和食管癌肿瘤发生、进展及不良预后显著相关[14]–[18]。14-3-3ζ高表达与抗凋亡蛋白、抗肿瘤治疗失败有关，且可能作为一个预示肿瘤复发和治疗耐药的标志物[19]–[20]。
14-3-3ζ表达上调影响预后的机制可能参与PI3K/Akt通路引起抗凋亡有关，14-3-3ζ可以通过调控Bcl-2家族、转录因子、MAPK级联反应等产生抑制凋亡的效应[21]–[23]。14-3-3ζ在细胞质中结合和隔离磷酸化Bad（pBad），将其锚定在细胞质中不能与Bcl-2结合，达到抑制凋亡的作用[21]。14-3-3对Bax的活性有负调控作用，14-3-3高表达时，Bax诱导的细胞凋亡受到抑制[23]。
然而，有关14-3-3ζ蛋白表达在淋巴瘤中的作用研究极少，曾有研究者报道14-3-3ζ蛋白高表达可介导弥漫大B细胞淋巴瘤多药耐药[24]–[25]。但是尚未见14-3-3ζ及其他亚型在ENKTL中的相关研究结果报道。在本研究中我们发现，接受含吉西他滨的化疗方案治疗无效组ENKTL患者较治疗有效组的14-3-3ζ蛋白表达水平显著升高。单因素分析结果显示14-3-3ζ蛋白高表达是影响患者生存的不良预后因素。因此，14-3-3ζ可能成为一个新的针对DDGP方案治疗耐药ENKTL的生物标志物和治疗靶点。
综上，我们首次分析了接受含吉西他滨化疗方案的晚期ENKTL患者治疗有效组和无效组的差异表达蛋白，发现在ENKTL耐药组患者中14-3-3ζ蛋白表达上调，单因素分析结果显示治疗前血清14-3-3ζ水平升高是影响ENKTL患者生存的预后因素。
References
- 1.Au WY, Weisenburger DD, Intragumtornchai T, et al. Clinical differences between nasal and extranasal natural killer/T-cell lymphoma: a study of 136 cases from the international peripheral T-cell lymphoma project[J] Blood. 2009;113(17):3931–3937. doi: 10.1182/blood-2008-10-185256. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Li YX, Liu QF, Fang H, et al. Variable clinical presentations of nasal and Waldeyer ring natural killer/T-cell lymphoma[J] Clin Cancer Res. 2009;15(8):2905–2912. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-2914. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Zhang L, Jia S, Ma Y, et al. Efficacy and safety of cisplatin, dexamethasone, gemcitabine and pegaspargase (DDGP) regimen in newly diagnosed, advanced-stage extranodal natural killer/T-cell lymphoma: interim analysis of a phase 4 study NCT01501149[J] Oncotarget. 2016;7(34):55721–55731. doi: 10.18632/oncotarget.10124. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Wang JJ, Dong M, He XH, et al. GDP (Gemcitabine, dexamethasone, and cisplatin) is highly effective and well-tolerated for newly diagnosed stage IV and relapsed/refractory extranodal natural killer/T-cell lymphoma, nasal type[J] Medicine (Baltimore) 2016;95(6):e2787. doi: 10.1097/MD.0000000000002787. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Wang L, Wang WD, Xia ZJ, et al. Combination of gemcitabine, L-asparaginase, and oxaliplatin (GELOX) is superior to EPOCH or CHOP in the treatment of patients with stage IE/IIE extranodal natural killer/T cell lymphoma: a retrospective study in a cohort of 227 patients with long-term follow-up[J] Med Oncol. 2014;31(3):860. doi: 10.1007/s12032-014-0860-4. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Lee J, Suh C, Park YH, et al. Extranodal natural killer T-cell lymphoma, nasal-type: a prognostic model from a retrospective multicenter study[J] J Clin Oncol. 2006;24(4):612–618. doi: 10.1200/JCO.2005.04.1384. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Ying Z, Zhu J. Extranodal natural killer/T cell lymphoma: we should and we can do more[J] Chin Clin Oncol. 2015;4(1):12. doi: 10.3978/j.issn.2304-3865.2015.03.07. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Kwong YL, Pang AW, Leung AY, et al. Quantification of circulating Epstein-Barr virus DNA in NK/T-cell lymphoma treated with the SMILE protocol: diagnostic and prognostic significance[J] Leukemia. 2014;28(4):865–870. doi: 10.1038/leu.2013.212. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Aitken A. 14-3-3 proteins: a historic overview[J] Semin Cancer Biol. 2006;16(3):162–172. doi: 10.1016/j.semcancer.2006.03.005. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Matta A, Masui O, Siu KW, et al. Identification of 14-3-3zeta associated protein networks in oral cancer[J] Proteomics. 2016;16(7):1079–1089. doi: 10.1002/pmic.201500489. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Neal CL, Yu D. 14-3-3zeta as a prognostic marker and therapeutic target for cancer[J] Expert Opin Ther Targets. 2010;14(12):1343–1354. doi: 10.1517/14728222.2010.531011. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Wilker E, Yaffe MB. 14-3-3 Proteins—a focus on cancer and human disease[J] J Mol Cell Cardiol. 2004;37(3):633–642. doi: 10.1016/j.yjmcc.2004.04.015. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Tzivion G, Gupta VS, Kaplun L, et al. 14-3-3 proteins as potential oncogenes[J] Semin Cancer Biol. 2006;16(3):203–213. doi: 10.1016/j.semcancer.2006.03.004. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Matta A, Bahadur S, Duggal R, et al. Over-expression of 14-3-3zeta is an early event in oral cancer[J] BMC Cancer. 2007;7:169. doi: 10.1186/1471-2407-7-169. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Bajpai U, Sharma R, Kausar T, et al. Clinical significance of 14-3-3 zeta in human esophageal cancer[J] Int J Biol Markers. 2008;23(4):231–237. doi: 10.1177/172460080802300406. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Ralhan R, Desouza LV, Matta A, et al. iTRAQ-multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry-based identification of potential biomarkers of oral epithelial dysplasia and novel networks between inflammation and premalignancy[J] J Proteome Res. 2009;8(1):300–309. doi: 10.1021/pr800501j. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 17.Fan T, Li R, Todd NW, et al. Up-regulation of 14-3-3zeta in lung cancer and its implication as prognostic and therapeutic target[J] Cancer Res. 2007;67(16):7901–7906. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-0090. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 18.Neal CL, Yao J, Yang W, et al. 14-3-3zeta overexpression defines high risk for breast cancer recurrence and promotes cancer cell survival[J] Cancer Res. 2009;69(8):3425–3432. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-2765. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 19.Li Y, Zou L, Li Q, et al. Amplification of LAPTM4B and YWHAZ contributes to chemotherapy resistance and recurrence of breast cancer[J] Nat Med. 2010;16(2):214–218. doi: 10.1038/nm.2090. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 20.Frasor J, Chang EC, Komm B, et al. Gene expression preferentially regulated by tamoxifen in breast cancer cells and correlations with clinical outcome[J] Cancer Res. 2006;66(14):7334–7340. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-4269. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 21.Subramanian RR, Masters SC, Zhang H, et al. Functional conservation of 14-3-3 isoforms in inhibiting bad-induced apoptosis[J] Exp Cell Res. 2001;271(1):142–151. doi: 10.1006/excr.2001.5376. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 22.Fanger GR, Widmann C, Porter AC, et al. 14-3-3 proteins interact with specific MEK kinases[J] J Biol Chem. 1998;273(6):3476–3483. doi: 10.1074/jbc.273.6.3476. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 23.Nomura M, Shimizu S, Sugiyama T, et al. 14-3-3 Interacts directly with and negatively regulates pro-apoptotic Bax[J] J Biol Chem. 2003;278(3):2058–2065. doi: 10.1074/jbc.M207880200. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 24.Maxwell SA, Li Z, Jaye D, et al. 14-3-3zeta mediates resistance of diffuse large B cell lymphoma to an anthracycline-based chemotherapeutic regimen[J] J Biol Chem. 2009;284(33):22379–22389. doi: 10.1074/jbc.M109.022418. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 25.Maxwell SA, Cherry EM, Bayless KJ. Akt, 14-3-3zeta, and vimentin mediate a drug-resistant invasive phenotype in diffuse large B-cell lymphoma[J] Leuk Lymphoma. 2011;52(5):849–864. doi: 10.3109/10428194.2010.551793. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]