PSMB5对多发性骨髓瘤细胞增殖和硼替佐米耐药的影响及其机制研究

Abstract

Objective

To investigate the effects of proteasome beta 5 subunit (PSMB5) on proliferation and bortezomib (BTZ) chemo-sensitivity of multiple myeloma (MM) and its related molecular mechanisms.

Methods

We used two MM cell lines, RPMI 8226 and BTZ drug-resistant cell line RPMI 8226/BTZ100 (hereinafter referred to as BTZ100), as the research object. PSMB5 was overexpressed or knocked down in two myeloma cell lines via lentivirus transfection. CCK8 assay was used to detect the impact of PSMB5 on cell viability and bortezomib sensitivity in human myeloma cells; Using flow cytometry to test the effects of PSMB5 on apoptosis rate of human myeloma cells under the treatment of bortezomib; Apoptosis-related gene expression of Bax, Bcl-2, p-Akt and cleaved caspase-3 were detected by Western blot.

Results

①PSMB5 overexpression and knockdown were successfully constructed in RPMI 8226 and BTZ100 cells. ②PSMB5 expression was positively correlated with cell proliferation of RPMI 8226 and BTZ100 cells (P<0.05). ③The cell viability was lower after PSMB5 knockdown in RPMI 8226 cells than control cells under the same concentration of BTZ [IC₅₀ at 24 h: (7.01±0.47) and (9.64±0.55) nmol/L respectively, t=6.289, P=0.003]. The cell viability was higher after PSMB5 overexpression in RPMI 8226 cells than control cells under the same concentration of BTZ [IC₅₀ at 24 h: (10.99±0.58) and (9.51±0.37) nmol/L respectively, t=3.724, P=0.020). PSMB5 expression was negatively correlated with the sensitivity of RPMI 8226 cells to BTZ. The results of BTZ100 cells were similar. ④The expression of PSMB5 was negatively correlated with the apoptosis of RPMI 8226 and BTZ100 under the treatment of BTZ. ⑤Meanwhile, PSMB5 knockdown could increase the expression of pro-apoptosis gene Bax and cleaved caspase-3 and decrease the expression of anti-apoptotic gene Bcl-2 and p-Akt. PSMB5 over-expression has the opposite results.

Conclusion

PSMB5 knockdown could improve the bortezomib sensitivity of MM cells via activation of apoptosis signaling. PSMB5 may be a potential therapeutic target for MM.

随着人口老龄化，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的发病率逐年增高[1]。目前MM仍然难以治愈。硼替佐米（Bortezomib，BTZ）的应用是MM治疗的里程碑，但是部分患者却对BTZ耐药[2]。蛋白酶体是细胞内蛋白降解的重要途径，其核心颗粒20 S蛋白酶体有重要的酶活性，包括参与细胞增殖和凋亡等多种生命活动过程[3]。蛋白酶体β5亚单位（PSMB5）是其中的一个重要组成部分，位于20 S蛋白酶体活化中心，发挥重要的蛋白水解作用。许多研究表明PSMB5能够影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭[4]–[5]。我们在本研究中拟探讨PSMB5对MM细胞增殖和BTZ敏感性的影响及其相关机制。

材料与方法

1．主要试剂：RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，BTZ购自美国Millennium Pharmaceuticals公司，CCK-8购自日本同仁化学研究所，酶标仪为美国Thermo公司产品，凋亡试剂盒、流式细胞仪均为美国BD公司产品，PSMB5、Bax、Bcl-2、p-Akt、t-Akt、Cleaved caspase-3、caspase-3、GAPDH、Western blot专用二抗均为美国Cell Signaling Technology公司产品。

2．细胞培养：人MM细胞株RPMI 8226细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，BTZ耐药细胞株RPMI 8226/BTZ100（简称BTZ100）细胞由阿姆斯特丹自由大学的J. Cloos教授惠赠。细胞传代培养于含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，5% CO₂、37 °C、饱和湿度条件下培养。

3．细胞转染：PSMB5过表达病毒（OE-PSMB5）及其对照（Con）、PSMB干扰病毒（Sh1-PSMB5、Sh2-PSMB5、Sh3-PSMB5）及其对照（Scramble）均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。转染前1 d收集对数生长期的RPMI 8226和BTZ100细胞，将细胞铺于24孔板中（每孔2×10⁵个细胞）。次日，将病毒液按MOI=45加入细胞中；6~8 h后，补加500 µl的完全培养基。72 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。并加入1.0 µg/ml嘌呤霉素来筛选稳定感染的细胞克隆。30 d后，当荧光率>90%时即可认为获得了稳定转染的细胞株。将1.0 µg/ml嘌呤霉素降低至0.5 µg/ml维持培养。待转染后的细胞扩增较多时，即可进行下一步实验。

4．转染鉴定：取对数生长期的各组转染细胞，PBS离心洗涤2次，细胞裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，按参考文献[6]方法进行Western blot。一抗为PSMB5，通过Image Quant LAS 4000mini凝胶成像仪曝光成像，以GAPDH为内参照。

5．采用CCK-8法检测PSMB5对细胞增殖和BTZ化疗敏感性的影响：取对数生长期的各组转染细胞，以5×10³/ml的密度接种于96孔板中。按照说明书进行操作，分别检测培养1、3、5、7 d时450 nm处的吸光度（A）值，以判断对细胞增殖的影响。

将各组转染细胞以每孔2×10⁴接种于96孔板中，培养24 h后加入不同浓度的BTZ（RPMI 8226细胞中的浓度梯度为0、2、4、6、8、10、20 nmol/L；BTZ100细胞中的浓度梯度为0、50、100、150、200、250、300 nmol/L）。每组设3个复孔，0 nmol/L组加入等体积的DMSO。加BTZ处理24、48、72 h后检测A值，以IC₅₀值的变化判断PSMB5对MM细胞BTZ化疗敏感性的影响。

6．采用流式细胞术检测PSMB5对细胞凋亡的影响：取对数生长期的各组转染细胞，以5×10⁵/ml的密度接种于6孔板中，RPMI 8226细胞中BTZ浓度为6 nmol/L；BTZ100细胞中BTZ浓度为150 nmol/L；0 nmol/L组加入等体积的DMSO，培养24 h后收集各组细胞。常规重悬后加入AnnexinⅤAPC、7-AAD室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测。早期和晚期凋亡率总和为总凋亡率。

7．Western blot法检测PSMB5对细胞凋亡相关蛋白表达的影响：取对数生长期的各组转染细胞，以5×10⁵/ml的密度接种于6孔板中，RPMI 8226细胞中BTZ浓度为6 nmol/L；BTZ100细胞中BTZ浓度为150 nmol/L，培养24 h后收集各组细胞。参考文献[6]方法进行Western blot，对BTZ作用下两种细胞的Bax、Bcl-2、p-Akt、t-Akt、Cleaved caspase-3、caspase-3进行检测，以GAPDH为内参照。

8．统计学处理：采用SPSS19.0软件进行统计学分析。每组设3个复孔，实验重复3次。数据以x±s表示，两组比较采用t检验，三组及以上采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．成功建立过表达和下调PSMB5表达的MM稳转细胞系：荧光显微镜下观察各转染组细胞均表达绿色荧光蛋白。流式细胞术检测结果提示绿色荧光蛋白表达率超过90%。Western blot法检测显示成功构建了过表达和下调PSMB5表达的RPMI 8226和BTZ100稳转细胞系（图1）。依据过表达和下调效率分别选用OE-PSMB5、Con、Sh1-PSMB5、Scramble四组细胞进行后续实验。

图1. 采用Western blot法检测RPMI 8226细胞（A）和硼替佐米耐药（BTZ100）细胞（B）转染PSMB5过表达和干扰病毒.

1：过表达PSMB5对照；2：过表达PSMB5；3：干扰序列对照；4～6：干扰序列Sh1-PSMB5、Sh2-PSMB5、Sh3-PSMB5

2．PSMB5表达对MM细胞增殖的影响：结果显示在RPMI 8226和BTZ100细胞干扰组，与对照组比较，细胞增殖从第1天开始受到抑制（P<0.05），而RPMI 8226和BTZ100细胞过表达组则相反，PSMB5的表达促进MM细胞增殖（图2）。

图2. 采用CCK-8法检测过表达和干扰PSMB5后对RPMI 8226细胞（A）和硼替佐米耐药（BTZ100）细胞（B）增殖的影响（*与对照组比较，P<0.05；^#与干扰对照组比较，P<0.05；每组设3个复孔，实验重复3次）.

3．PSMB5表达对MM细胞BTZ敏感性的影响：结果详见表1。结果显示下调PSMB5后，在相同浓度的BTZ作用下RPMI 8226细胞活力较对照组降低[作用24 h时IC₅₀分别为（7.01±0.47）、（9.64±0.55）nmol/L，t=6.289，P=0.003]，过表达后的细胞活力较对照组升高[IC₅₀分别为（10.99±0.58）、（9.51±0.37）nmol/L，t=3.724，P=0.020]。BTZ100细胞的结果类似。

表1. 过表达和下调PSMB5表达对MM细胞硼替佐米敏感性（IC₅₀值）的影响（nmol/L，x±s）.

组别	RPMI 8226细胞			BTZ100细胞
	24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h
对照组	9.51±0.37	6.32±0.41	4.33±0.23	119.50±8.92	73.99±5.38	48.70±3.93
过表达PSMB5组	10.99±0.58a	9.22±0.47 a	5.21±0.32a	146.40±10.32 a	93.93±6.42a	103.80±8.39a
干扰对照组	9.64±0.55	6.24±0.36	4.30±0.29	125.50±9.02	74.74±4.72	51.97±4.01
干扰(Sh1)-PSMB5组	7.01±0.47b	4.38±0.28 b	3.59±0.22b	80.06±4.29b	50.11±3.39b	31.34±2.93b

注：BTZ100细胞：RPMI 8226细胞的硼替佐米耐药细胞株；^a与对照组比较，P<0.05；^b与干扰对照组比较，P<0.05；每组设3个复孔，实验重复3次

4．PSMB5表达对BTZ作用下MM细胞凋亡的影响：结果显示PSMB5表达与BTZ作用下的RPMI 8226、BTZ100细胞凋亡有关，下调PSMB5表达可促进BTZ诱导的细胞凋亡，而过表达PSMB5则减少BTZ诱导的细胞凋亡（表2）。

表2. 流式细胞术检测过表达和下调PSMB5表达对硼替佐米作用下多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响（%，x±s）.

组别	PSMB5过表达				PSMB5干扰
	对照组	过表达组	t值	P值	对照组	干扰组	t值	P值
RPMI 8226细胞组	24.74±1.69	10.99±1.03	12.030	<0.001	24.48±2.18	36.71±4.39	4.322	0.012
BTZ100细胞组	9.52±0.88	4.37±0.39	9.241	<0.001	11.38±0.99	23.19±2.03	9.053	<0.001

注：BTZ100细胞：RPMI 8226细胞的硼替佐米耐药细胞株；每组设3个复孔，实验重复3次

5．PSMB5表达对BTZ作用下MM细胞凋亡相关基因的影响：结果显示，下调PSMB5表达上调促凋亡基因Bax和Cleaved caspase-3表达，同时下调抗凋亡基因Bcl-2和p-Akt表达；相反，PSMB5过表达则下调Bax和Cleaved caspase-3表达并上调Bcl-2和p-Akt表达（图3）。证实PSMB5是通过调节凋亡相关基因的表达影响BTZ作用下的细胞凋亡，从而影响MM细胞对BTZ的化疗敏感性。

图3. 过表达和干扰PSMB5表达对硼替佐米作用下RPMI 8226细胞（A）和硼替佐米耐药细胞（B）凋亡相关基因表达的影响.

1：PSMB5过表达组；2：干扰序列对照组；3：PSMB5干扰序列组

讨论

MM是一种多发于中老年人的血液系统恶性肿瘤[7]–[8]。近年来，蛋白酶体抑制剂BTZ的出现使MM的治疗取得了较大的进步。但是BTZ有效率仅为40%~60%，且易发生快速耐药导致复发[9]。因此，深入研究其发病机制并寻找新的药物作用靶点具有重要意义。

蛋白酶体主要由20 S催化颗粒和2个19 S调节亚单位构成[10]。PSMB5位于20 S蛋白酶体的活性中心，全长为264个氨基酸，参与蛋白酶体的结构形成、功能完善以及蛋白水解功能，在调控机体内特定蛋白质的浓度和除去错误折叠蛋白质中起主导作用[11]。最近有研究表明干扰PSMB5表达能够抑制人间充质干细胞（hMSC）的早期增殖，过表达PSMB5能够抑制hMSC的衰老进程[12]–[13]。另有研究表明BTZ化疗耐药的产生与PSMB5的高表达有关[14]。据此我们可以推测，PSMB5基因可能是调控MM对BTZ化疗敏感性的重要靶点之一。

在前期对PSMB5的研究中，Balsas等[14]和Shuqing等[15]的研究结果显示，对BTZ化疗敏感的MM细胞低表达PSMB5的同时高表达泛素化蛋白，提示蛋白泛素化可能是PSMB5下游调控BTZ化疗敏感性的重要分子机制。另外，Lü等[16]发现过表达PSMB5的T淋巴细胞白血病细胞能够增强对BTZ耐药能力，并且NF-κB信号通路在化疗耐药中发挥着重要作用。在我们的实验中，为了分析PSMB5导致BTZ耐药的机制，我们选取了两种对BTZ具有不同耐药性的MM细胞株，进行PSMB5过表达和下调的相关实验。我们在研究中发现，PSMB5干扰组的MM细胞增殖减慢，对BTZ化疗敏感性增强，同浓度BTZ作用下凋亡细胞的比例增加，同时促凋亡基因Bax和Cleaved caspase-3表达增多，而抗凋亡基因Bcl-2和p-Akt表达下降，并且能够逆转BTZ100细胞对BTZ的耐药性。而PSMB5过表达时则结果相反。我们的结果显示，PSMB5表达上调和下调影响MM细胞的增殖、凋亡以及化疗敏感性，但同时又伴随着凋亡信号通路的抑制与激活，说明凋亡相关蛋白是PSMB5的下游信号通路。改变MM细胞PSMB5的表达水平相当于影响了BTZ所引发的凋亡相关蛋白分子的表达，这是PSMB5不同表达水平的MM细胞表现出不同的BTZ化疗敏感性的重要原因。因此，我们研究结果提示PSMB5可能是MM治疗的潜在靶点。

综上，PSMB5下调可以促进MM细胞凋亡，增强其对BTZ的化疗敏感性，作用机制可能与上调Bax、Cleaved caspase-3和下调Bcl-2、p-Akt有关。提示PSMB5可能是MM治疗的潜在靶点。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81272622）

Fund program: National Natural Science Foundation of China（81272622）