肠道微生物与移植物抗宿主病研究进展

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）已广泛应用于治疗各种血液系统疾病，然而，移植物抗宿主病（GVHD）显著影响移植疗效。GVHD主要是由供者T细胞攻击受者同种异型抗原所致，多累及皮肤、肝脏、消化道等器官。从人类胃肠道样本可检测出1 000多种约10¹⁴个肠道微生物[1]。肠道微生物主要由细菌构成，也包括真菌、古细菌及病毒[2]。肠道微生物对于营养物质代谢、人体自身发育、免疫及疾病的产生等方面都起到了重要的作用。近年来，我们可以通过聚合酶链反应（PCR）、16S rRNA测序、宏基因组测序[3]等技术了解肠道微生物的组成，加速了肠道微生物与肥胖、糖尿病、炎症性肠病、心血管疾病、风湿免疫性疾病、肿瘤等多种疾病的研究。近几年有很多研究证实肠道微生物与免疫调节密切相关。笔者对近年来肠道微生物与肠道GVHD的相关研究进行综述。

一、肠道屏障的组成及肠道微生物的免疫调节作用

1．肠道屏障的组成及其作用：肠道屏障由肠道黏膜上皮组织及其分泌物、肠相关淋巴组织及免疫活性物质、肠道微生物等共同构成，防止肠内的有害物质（如细菌和毒素）透过肠黏膜进入人体内其他组织、器官和血液循环，包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障与肠蠕动。

肠黏膜上皮由多种不同类型细胞构成。柱状细胞间形成紧密连接，在吸收营养物质的同时保持黏膜的完整性，防止致病微生物的入侵；杯状细胞可分泌黏液，有润滑和保护作用；帕内特细胞（Paneth cell）分泌防御素、溶菌酶等抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP），有一定的灭菌作用；肠道干细胞可分化成为各种类型肠黏膜细胞，不断补充衰老细胞，维持肠黏膜上皮的正常生理机能。此外，近年研究显示，肠黏膜上皮细胞表达模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）[包括Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）、Nod样受体（Nod-like receptor, NLR）和Rig-I样受体（RIG-I like receptors, RLR）]可识别多种微生物相关分子模式（Microbial-associated molecular pattern，MAMP）并与病原体MAMP结合，启动细胞内信号传导，导致效应分子表达和分泌，从而参与机体免疫反应，是肠道重要的机械及化学屏障。

肠道免疫屏障由肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissue, GALT）、肠系膜淋巴结、肝脏Kupper细胞和浆细胞产生的分泌型抗体等构成。肠相关淋巴组织是位于肠黏膜下的淋巴组织，由派尔集合淋巴结（peyer patch）、孤立淋巴滤泡、上皮内淋巴细胞及固有层中弥散分布的淋巴细胞等组成。M细胞（microfold cell）是一种特化的抗原转运细胞。M细胞摄取抗原并转运至巨噬细胞或树突细胞，巨噬细胞或树突状细胞识别抗原后进入派尔集合淋巴结，激活T、B细胞。激活的T、B细胞也可进入肠系膜淋巴结并最终进入血液循环[4]。固有淋巴细胞（ILC）是近年来新发现的一群淋巴细胞。RORγt⁺固有淋巴细胞来源的IL-22与肠黏膜上皮细胞IL-22受体结合后可活化STAT3途径，诱导抗菌肽生成并促进肠黏膜上皮细胞分泌黏液以抵御肠道致病菌[5]。这些免疫结构的损害或缺失会导致微生物失调。例如，缺失孤立淋巴滤泡小鼠的体内的革兰阴性菌明显增加[6]。

成年人肠道内有数万亿的细菌，以拟杆菌、厚壁菌、变形杆菌及放线杆菌占主导地位，合成多种人体必须的维生素和氨基酸、参与糖类和蛋白质的代谢、促进多种矿物元素的吸收。各种细菌按一定的比例分布，互相制约，互相依存，形成一种生态平衡，抵御病原菌生长，维持肠道微环境稳态，构成肠道屏障的生物屏障[4]。

2．肠道微生物的免疫调节作用：

（1）肠道微生物对肠道黏液生成和黏液屏障的影响：无菌小鼠肠道的黏液层比普通小鼠薄，通过口服细菌产物脂多糖（LPS）及肽聚糖可使无菌小鼠黏液层厚度恢复[7]。同时，PRR对肠道微生物MAMP的识别可调控抗菌肽的生成。例如，帕内特细胞分泌再生胰岛衍生蛋白3γ（REGⅢγ）、REGⅢβ和血管生成素4（Angiogenin-4）等抗菌肽时依赖于TLR/MyD88途径。肠道微生物还通过以下途径促进RORγt⁺固有淋巴细胞分泌IL-22[8]：①固有淋巴细胞的芳香烃受体与罗伊氏乳杆菌等乳酸杆菌的色氨酸代谢产物生成的芳香烃受体配体相结合；②肠道微生物的鞭毛蛋白与Toll样受体5（TLR5）结合，诱导CD103⁺固有层树突状细胞分泌IL-23。此外，肠道微生物可控制天然杀伤细胞的发育及成熟，促进淋巴结构的发育及成熟[6]。

（2）肠道微生物对浆细胞分泌免疫球蛋白的影响：肠道固有层浆细胞可通过T细胞依赖性IgA类型转换途径及T细胞非依赖性IgA类型转换途径产生IgA[9]，可侵入肠腔黏膜层或定居在肠黏膜上皮细胞附近的细菌（例如分节丝状杆菌），诱导T细胞依赖性IgA类型转换途径；共生菌来源的抗原则可诱导T细胞非依赖性IgA类型转换途径。在无菌小鼠中，派尔集合淋巴结等黏膜相关淋巴组织产生分泌IgA的浆细胞的数量明显减少，而IgE的分泌量升高。同时，共生菌可诱导肠黏膜上皮细胞和肠道单核巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子（TNF）、转化生长因子β（TGF-β）和增殖诱导配体（APRIL）等细胞因子，参与诱导分泌IgA的浆细胞的分化[10]–[11]。因此，IgA的产生依赖于肠道菌群的存在，而IgE则相反[12]。

（3）肠道微生物及其代谢产物对CD4⁺ T细胞向调节性T细胞（Treg）及Th17细胞分化的影响：梭菌属的Ⅳ型和ⅩⅣa型梭菌可通过上调TGF-β促进Foxp3⁺ Treg的生成[13]，其他如ASF（altered schaedler flora，包括2个乳酸杆菌、1个拟杆菌、1个Flexistipes属的螺旋型细菌、4个氧气极其敏感的梭菌）、脆弱拟杆菌及细菌的代谢产物短链脂肪酸也可促进Treg细胞的分化[14]–[15]。脆弱拟杆菌释放含有荚膜多糖的囊泡，荚膜多糖与树突状细胞的TLR2相结合诱导树突状细胞分化，分化的细胞可促进Treg细胞的生成[8]。肠道分节丝状菌与肠黏膜上皮细胞间的黏附对Th17细胞的分化十分重要[9],[16]–[17]，而Th17细胞在预防致病微生物感染中起着不可或缺的作用。Th17细胞可分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等细胞因子刺激肠黏膜上皮细胞生成抗菌蛋白、加固上皮细胞间紧密连接。Th17细胞还介导IgA的转运和粒细胞的招募。

宿主肠道免疫系统既要与肠道微生物和平共处，同时还需形成抵御病原体入侵的屏障[18]。肠道免疫系统可维持肠道微生物的稳态，同时肠道微生物在肠道免疫平衡中起着重要作用。

二、造血干细胞移植（HSCT）对肠道微环境的影响

1．预处理及GVHD对肠道屏障的影响：HSCT的预处理会损伤肠黏膜，刺激宿主组织分泌TNF-α、IL-1等炎性细胞因子，促进肠道细菌或其产物（如LPS和肽聚糖）穿过肠道上皮层进入全身血液循环，引起感染和败血症[4]。预处理诱导的细菌移位导致中性粒细胞在肠道聚集，造成中性粒细胞的活化、释放活性氧损伤宿主组织、T细胞分化为效应细胞而使GVHD加重[19]。在小鼠模型中，总放疗剂量的增加与肠道屏障功能受损呈正相关。清髓性预处理患者的肠道渗透性增加，减低剂量预处理患者则无此表现[4]。

HSCT患者合并GVHD时，宿主体内帕内特细胞数目及其分泌的防御素α均减少，而随着肠道帕内特细胞数量减少，患者非复发死亡率明显升高[20]。同时，宿主固有淋巴细胞及其分泌的IL-22也减少，可导致肠道干细胞减少、肠道上皮完整性受损[21]–[22]。

2．GVHD对肠道微生物组成的影响：GVHD与肠道微生物多样性及其组成密切相关。Jenq等[23]发现小鼠在骨髓移植后最初的两周内肠道微生物多样性显著降低，GVHD小鼠更为明显，其主要表现在乳杆菌、肠杆菌扩增及梭菌、拟杆菌减少。Taur等[24]发现移植后患者肠道微生物组成主要以某种单一细菌为主，肠球菌最为常见，其次是链球菌、肠杆菌。

Holler等[25]运用16S核糖体RNA测序及尿液吲哚硫酸盐测量分析了31例移植患者及3例健康供者在移植期间粪便微生物组成的变化。他们发现健康供者肠道微生物分布主要以厚壁菌、拟杆菌、变形杆菌及放线菌为主，而缺乏肠球菌；移植前患者的肠道菌群组成与健康供者相似；移植后患者肠球菌数量增加，其中屎肠球菌显著扩增，而厚壁菌等其他共生菌明显减少；在发生活动性胃肠道GVHD的患者中，这种变化最为明显，肠道微生物多样性明显减少。Ubeda等[26]也发现了类似的变化，并认为耐万古霉素肠球菌（VRE）作为优势菌是移植患者发生菌血症的预测因素之一。

某些特定共生菌可能在调节胃肠道炎症中发挥重要作用，例如粪便中厌氧菌，特别是Blautia菌（属于厚壁菌属）的减少与急性GVHD的发生率和死亡率升高相关[27]。以上研究说明，肠道微生物多样性是移植后GVHD患者预测死亡的因素之一。肠道微生物多样性越低，死亡可能性越高[28]。

丁酸盐（肠道微生物来源的短链脂肪酸）在移植后明显减少[29]。丁酸盐可诱导Treg细胞增殖，促进组蛋白乙酰化，补充丁酸盐可加固肠上皮细胞间的紧密连接及缓解GVHD。此研究揭示了微生物代谢产物不为人知的作用，为GVHD的治疗提供了新思路。

三、维持肠道稳态、控制和治疗GVHD

1．合理应用抗生素：过去，人们认为HSCT患者使用广谱抗生素可减缓GHVD的发生发展，甚至会使用大剂量广谱抗生素达到全肠道除菌。近来，Vossen等[30]的研究显示，在112例儿童中，51%成功完成全肠道除菌的儿童发生1例急性GVHD，49%未达到全肠道除菌标准儿童发生8例急性GVHD（P=0.013）。此研究提示全肠道除菌可以防止GVHD发生。

如今，越来越多的研究提示allo-HSCT及GVHD患者使用广谱抗生素会降低肠道微生物多样性，增加死亡率。Weber等[31]对621例移植患者进行了回顾性研究，早期使用广谱抗生素与晚期使用相比，共生菌梭菌的含量大幅降低，尤其是ⅩⅣa型梭菌；而移植前使用广谱抗生素比移植后使用或不使用抗生素相比具有更高的移植相关死亡率。Taur等[32]对94例allo-HSCT患者的粪便进行了分析，研究发现随着时间的推移，患者肠球菌、变形杆菌和链球菌占主导地位的概率增加。肠球菌的增加与甲硝唑的应用相关，甲硝唑抑制专性厌氧菌的作用很强；链球菌的增加与β内酰胺类抗生素如头孢菌素、含β内酰胺酶抑制剂的复方制剂和碳青霉烯类药物有关。氟喹诺酮类药物（环丙沙星、左氧氟沙星等）的应用可降低变形杆菌占统治地位的概率。肠球菌的增加升高了VRE菌血症的风险，变形杆菌的增加升高革兰阴性菌血症的可能性。应用抗专性厌氧菌抗生素患者的肠道菌群多样性最低，其次是应用万古霉素及氟喹诺酮类抗生素者，β内酰胺类抗生素引起的肠道菌群多样性减低较前两类少。有研究表明，广谱抗生素导致肠球菌数量增加的机制可能是源于AMP的减少[25]。共生细菌对诱导AMP、维持微生物多样性十分重要。长时间使用抗生素后，AMP的含量下降，而AMP有防止肠球菌过度生长的作用。Shono等[33]发现857例移植患者若使用广谱抗生素亚胺培南/西司他丁及哌拉西林/他唑巴坦，则会增加Ⅱ~Ⅳ级GVHD发生率、GVHD相关5年死亡率；使用头孢吡肟和氨曲南对GVHD相关死亡率无明显影响；哌拉西林/他唑巴坦的使用可减少拟杆菌、乳杆菌、梭菌和放线菌，而肠球菌、Akkermansia菌和丹毒斯菌则会增加，肠道微生物多样性降低。Simms等[34]发现儿童移植后GVHD的发生发展与抗生素导致的抗炎梭菌数量下降相关，尤其是使用抗厌氧菌抗生素（克林霉素、美罗培南、甲硝唑、哌拉西林/他唑巴坦等）。此外，抗生素的使用会增加病原体感染的风险。广谱抗生素治疗后，艰难梭菌感染发生频率显著增加，抗生素（不包括治疗艰难梭菌的抗生素）的使用是复发性艰难梭菌感染的危险因素[35]。Weber等[36]研究表明利福昔明可保护allo-HSCT患者肠道菌群的平衡，减弱肠球菌的活动性，降低1年移植相关死亡率。

综上所述，HSCT及GVHD患者使用广谱抗生素仍存在争议，需要进一步的研究。同时，寻找新策略，尽量维护肠道菌群多样性是十分必要的。

2．益生菌治疗GVHD：益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，可改善宿主微生态平衡。目前，我们最常用的益生菌是双歧杆菌和乳酸杆菌。益生菌的作用机制包括微生物群重构、抑制病原体，促进免疫应答、上调抗炎因子和IgA、保护肠道屏障[37]。Delia等[38]进行了一项人体双盲试验，服用益生菌VSL#3的患者与服安慰剂的患者相比，放射性腹泻的发生率分别为51.8%（124/239）及31.6%（77/243）（P<0.001）。Jenq等[23]研究发现，在小鼠骨髓移植前注入氨苄青霉素可使GVHD加重，若此后加入约氏乳杆菌可抑制肠球菌增殖、降低GVHD致死率。

3．粪菌移植治疗GVHD：粪菌移植（FMT）是将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，重建肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。近年来，FMT已成为成功治疗HSCT患者难辨梭菌腹泻的一种有效方法[39]。研究人员运用FMT治疗3例激素难治型GVHD及1例激素依赖型GVHD患者，其中3例完全应答，1例部分应答，GVHD明显改善[40]。Spindelboeck等[41]应用FMT治疗3例肠道Ⅳ级GVHD患者，其中2例腹泻症状消失、GVHD完全缓解、肠道菌群多样性增加。FMT成为胃肠道GVHD的新疗法，但其有效性及安全性还有待进一步研究。