PD-1抑制剂Nivolumab对CD19嵌合抗原受体T细胞体外增殖和杀伤活性的影响

Abstract

目的

评估程序性细胞死亡受体1（PD-1）抑制剂Nivolumab对CD19-CAR-T细胞体外增殖和杀伤活性的影响。

方法

收集5例外周血PD-1高表达恶性淋巴瘤患者的外周血T细胞制备CD19-CAR-T细胞，在培养第8天加入终浓度分别为72、36、18 µg/ml的Nivolumab，同时设患者T细胞联合72 µg/ml Nivolumab及正常人CD19-CAR-T细胞为对照，采用CCK-8法、LDH细胞毒性检测、ELISA法比较各组的增殖活性、杀伤活性及炎症因子水平。

结果

①PD-1高表达患者CD19-CAR-T细胞转染率与正常人接近[（32.80±7.22）%对（35.10±5.84）%，t=−0.554，P=0.593]。②72 µg/ml Nivolumab联合CD19-CAR-T细胞不影响其增殖，但联合应用24、48 h对Pfeiffer细胞的杀伤率均优于单用患者CD19-CAR-T细胞及患者来源T细胞+72 µg/ml的Nivolumab（P值均<0.001），其中48 h时各组的杀伤率分别为（71.61±9.50）%、（6.77±1.26）%、（15.33±4.11）%。72、36 µg/ml Nivolumab联合来源CD19-CAR-T细胞对Pfeiffer细胞的杀伤率差异无统计学意义（P值分别为0.281、0.267），二者均高于患者来源CD19-CAR-T细胞+18 µg/ml Nivolumab组（P值均<0.001）。③不同剂量Nivolumab联合患者来源CD19-CAR-T细胞，不影响炎症因子IFN-γ、TNF-α水平（P值均>0.05）。

结论

终浓度为36 µg/ml的Nivolumab与CD19-CAR-T细胞联合应用，可在减轻药物毒副作用同时增强CD19-CAR-T细胞的杀伤活性。

嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T细胞）治疗已成为最具应用前景的肿瘤免疫治疗方法之一，但程序性死亡因子1受体（programmed cell death-1，PD-1）/程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）免疫抑制性途径的存在削弱了其治疗效果，通过PD-1抑制剂进行抗体封闭可增强CAR-T细胞的杀伤活性[1]。PD-1/PD-L1信号通路在削弱抗肿瘤免疫应答方面发挥重要作用[2]–[3]，靶向这一途径的检查点治疗如PD-1抗体Nivolumab、Pembrolizumab及PD-L1抗体BMS-936559、MEDI4736已取得突破性进展[4]–[5]。PD-1抑制剂与CAR-T细胞联合应用，可否进一步提高疗效，我们对此开展了相关的体外研究，现报道如下。

材料与方法

1．细胞及主要试剂：人肾上皮细胞系293T细胞、弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株Pfeiffer细胞均购自美国模式培养物集存库（ATCC），大肠杆菌感受态细胞株DH5а细胞购自宝生物工程（大连）有限公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Lenti-Pac慢病毒颗粒包装试剂盒购自上海伯易生物科技有限公司。磁珠分选试剂盒购自德国美天旎生物技术有限公司。CARTEST-19检测试剂盒购自上海近岸科技有限公司。LDH细胞毒性检测试剂盒、ELISA检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购自日本同仁化学研究所。第三代（共刺激分子为CD28和4-1BB）抗CD19 CAR质粒购自美国Creative Biolabs公司。CD19单克隆抗体购自美国BD公司。PD-1抑制剂Nivolumab购自美国百时美施贵宝公司。

2．质粒转化、扩增、提取：DH5а菌株置于冰上解冻，加入抗CD19 CAR质粒，冰中放置30 min，42 °C放置30~60 s，再次置于冰中2~3 min。加入37 °C预温的SOC培养基，振荡培养1 h。取适量菌液，三区划菌，过夜培养后挑取单个白色菌落扩增培养12~16 h。取500 µl培养后的菌液加入SOC培养基中，37 °C振荡培养12~16 h。采用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒后进行定量。

3．慢病毒包装、转染及滴度测试：转染前2 d在平板上接种（1.3~1.5）×10⁶ 293T细胞。采用Lenti-Pac慢病毒颗粒包装试剂盒包装慢病毒并转染至293T细胞，转染48 h后收集病毒颗粒，提取病毒RNA，采用real-time PCR检测病毒滴度。用无血清的DMEM培养基悬浮病毒沉淀、分装，−80 °C保存。

4．T细胞制备及慢病毒感染：收集5例外周血PD-1高表达恶性淋巴瘤患者、5例健康志愿者的外周血标本，作为本实验CAR-T细胞培养的T细胞来源，采用淋巴细胞分离液提取单个核细胞。采用磁珠分选试剂盒从提取的单个核细胞中富集CD3⁺ T细胞。获得的细胞沉淀用含有IL-2、谷氨酰胺的T细胞专用培养基培养，培养第4天接种慢病毒，培养第8天加入Nivolumab培养第12天收获CAR-T细胞。

5．实验分组：（1）5例PD-1高表达患者来源CD19-CAR-T细胞；（2）5例PD-1高表达患者来源CD19-CAR-T细胞联合终浓度分别为72、36、18 µg/ml Nivolumab；（3）5例PD-1高表达患者来源T细胞联合终浓度为72 mg/L的Nivolumab；（4）5例健康志愿者CD19-CAR-T细胞。

6．CD19-CAR-T细胞转染效率的检测：按CARTEST-19检测试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测CD19-CAR-T细胞的转染效率。

7．CD19-CAR-T细胞体外增殖能力的检测：将收获的CD19-CAR-T细胞于含10% FBS的RPMI 1640培养基，37 °C、饱和湿度、5%CO₂培养箱中培养。按CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒说明书进行操作，培养0、24、48 h时采用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值，计算其增殖能力。共5例患者，每组设3个复孔，实验重复3次。

8．体外杀伤活性的检测：以Pfeiffer细胞为靶细胞（细胞计数为2×10⁵），各组T细胞作为效应细胞进行实验，效靶比为4∶1。按LDH细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作，共培养0、24、48 h时采用酶标仪检测490 nm处A值，计算其杀伤率。共5例患者，每组设3个复孔，实验重复3次。

$$杀伤率(\%)=\frac{A_{效应细胞自发释放}-A_{靶细胞自发释放}}{A_{效应细胞最大释放}-A_{靶细胞自发释放}}\times 100\%$$

9．CD19-CAR-T细胞引起靶细胞炎症因子释放的检测：按ELISA检测试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪检测450 nm处A值。共5例患者，每组设3个复孔，实验重复3次。

10．统计学处理：实验数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本的t检验，各时点的组间比较行单因素方差分析，两两比较采用q检验，双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．CD19-CAR-T细胞的转染效率：5例患者平均外周血T细胞PD-1表达率为（62.3±15.67）%，其中1例患者PD-1表达率达到82.95%。CD19-CAR-T细胞病毒滴度为3×10⁸ TU/ml，5例PD-1高表达患者外周血T来源CD19-CAR-T细胞的转染率为（32.80±7.22）%，与健康供者T细胞来源CD19-CAR-T细胞转染效率[（35.10±5.84）%]相近，差异无统计学意义（t=−0.554，P=0.593）。

2．Nivolumab对CD19-CAR-T细胞增殖能力的影响：加入不同浓度Nivolumab的患者CD19-CAR-T细胞，与不加入Nivolumab的患者和健康志愿者CD19-CAR-T细胞组间比较，在培养0、24、48 h时细胞增殖率差异均无统计学意义（F值分别为1.506、2.143、2.576，P值分别为0.250、0.126、0.080）（图1），PD-1高表达患者CD19-CAR-T细胞中加入终浓度分别为72、36、18 µg/ml的Nivolumab培养48 h时，细胞增殖率分别为（81.20±14.01）%、（93.56±13.85）%、（106.32±14.28）%，未加入Nivolumab患者和健康供者CD19-CAR-T细胞收获后培养48 h时，细胞增殖率分别为（104.84±13.05）%、（106.43±15.72）%。

图1. 不同浓度Nivolumab对PD-1高表达患者CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19-CAR-T细胞）增殖的影响（共5份标本，每组设3个复孔，实验重复3次）.

3．Nivolumab联合CD19-CAR-T细胞对Pfeiffer细胞体外杀伤活性的影响：分别比较各组效靶细胞共培养0、24、48 h时对Pfeiffer细胞的杀伤率，PD-1高表达患者CD19-CAR-T+72 µg/ml Nivolumab培养48 h时，杀伤率为（71.61±9.50）%；患者T细胞+72 µg/ml Nivolumab培养48 h时，杀伤率为（15.33±4.11）%；单用患者CD19-CAR-T细胞培养48 h时，杀伤率为（6.77±1.26）%；正常人CD19-CAR-T细胞培养48 h时，杀伤率为（79.73±11.01）%。共培养0 h时差异无统计学意义（F=0.811，P=0.512），共培养24、48 h时差异均有统计学意义（F值分别为51.808、28.245，P值均<0.001）。行两两比较，患者CD19-CAR-T细胞+72 µg/ml Nivolumab联合应用与正常人CD19-CAR-T细胞对Pfeiffer细胞的杀伤率在24、48 h时差异均无统计学意义（P值分别为0.347、0.417），联合应用在24、48 h时对Pfeiffer细胞的杀伤率均高于单用患者CD19-CAR-T细胞（P值均<0.001），亦均优于患者T细胞+72 µg/ml Nivolumab（P值均<0.001）（图2）。

图2. 72 µg/ml Nivolumab联合PD-1高表达患者CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19-CAR-T细胞）对Pfeiffer细胞杀伤活性的影响（共5份标本，每组设3个复孔，实验重复3次）.

4．联合不同剂量的Nivolumab对Pfeiffer细胞体外杀伤活性的影响：PD-1高表达患者CD19-CAR-T细胞+终浓度分别为72、36、18 µg/ml Nivolumab三组分别比较效靶细胞共培养0、24、48 h时其对Pfeiffer细胞的杀伤率，共培养48 h时，杀伤率分别为（71.61±9.50）%、（75.28±6.41）%、（43.74±8.35）%。共培养0 h时差异无统计学意义（F=0.211，P=0.814），共培养24、48 h时差异均有统计学意义（F值分别为43.059、53.902，P值均<0.001）。行两两比较，患者CD19-CAR-T细胞+72 µg/ml Nivolumab与患者CD19-CAR-T细胞+36 µg/ml Nivolumab联合应用对Pfeiffer细胞的杀伤率在24、48 h时差异均无统计学意义（P值分别为0.281、0.267），二者均高于患者CD19-CAR-T细胞+18 µg/ml Nivolumab（P值均<0.001）（图3）。

图3. 不同浓度Nivolumab联合PD-1高表达患者CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19-CAR-T细胞）对Pfeiffer细胞杀伤活性的影响（共5份标本，每组设3个复孔，实验重复3次）.

5．Nivolumab对CD19-CAR-T细胞炎症因子分泌水平的影响：PD-1高表达T细胞来源CD19-CAR-T体外培养第8天加入不同浓度Nivolumab，与不加入Nivolumab的患者和正常人CD19-CAR-T相比，共培养0、24、48 h时IFN-γ、TNF-α水平差异均无统计学意义（P值均>0.05）。PD-1高表达患者CD19-CAR-T细胞加入终浓度分别为72、36、18 µg/ml的Nivolumab培养48 h时，IFN-γ水平分别为（247.33±33.25）、（269±28.25）、（273±36.79）pg/ml，TNF-α的分泌水平分别为（656.33±35.23）、（676.67±50.27）、（664.12±82.65）pg/ml，未加入Nivolumab患者和健康供者CD19-CAR-T细胞收获后培养48 h时，IFN-γ水平分别为（256.33±39.24）、（281.67±28.00）pg/ml，TNF-α水平分别为（656.67±44.11）、（660.00±33.11）pg/ml（图4）。

图4. 不同浓度Nivolumab对PD-1高表达患者CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19-CAR-T细胞）炎症因子IFN-γ（A）、TNF-α（B）分泌水平的影响（共5份标本，每组设3个复孔，实验重复3次）.

讨论

针对于包括淋巴瘤、多发性骨髓瘤（MM）等恶性肿瘤患者PD-1高表达的T细胞，PD-1抑制剂疗效显著[6]–[8]，但很快肿瘤复燃，大多数患者无法长期受益[9]。CAR-T细胞作为目前免疫治疗的另一个热门领域，在B细胞恶性肿瘤的治疗上亦获得了令人鼓舞的临床疗效[10]–[13]。在肿瘤的微环境中，肿瘤细胞能够表达PD-L1，与T细胞表面的免疫卡控点PD-1结合后能通过对其的抑制性作用而促进肿瘤的免疫逃逸，并阻止T细胞进入肿瘤区域或诱导进入肿瘤区域的T细胞凋亡，进而削弱其治疗潜能[14]–[15]。本研究我们尝试将抗PD-1抑制剂Nivolumab与CAR-T细胞治疗结合起来，探索进一步提高疗效的可能性。

本研究结果显示Nivolumab不影响CD19-CAR-T细胞的增殖，其联合患者CD19-CAR-T细胞对淋巴瘤细胞株Pfeiffer细胞的杀伤率明显高于Nivolumab或单用患者CD19-CAR-T细胞，提示Nivolumab能显著增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，这与Cherkassky等[16]、Suarez等[17]在胸膜间皮瘤、肾细胞癌方面的研究结论一致。Chong等[18]报道1例CAR-T细胞治疗失败的复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤患者，应用PD-1抑制剂Pembrolizumab取得了较好的疗效，提示PD-1通路可能在CAR-T细胞免疫治疗中起关键作用。我们收集PD-1高表达的患者T细胞，作为本实验CAR-T细胞培养的T细胞来源，与健康供者T细胞来源CD19-CAR-T细胞相比，T细胞的PD-1高表达并不影响其转染率。有动物实验报道CAR-T细胞与PD-1抑制剂联合使用可提高CAR-T细胞疗效，其方法为CAR-T细胞输注后给予一次PD-1抑制剂[19]，本研究结果与之一致。

PD-1抑制剂虽取得了肯定的临床疗效，但作用难以持久，毒副作用也限制其应用，且对于何时停药仍无定论，我们为了减轻PD-1抑制剂联合CD19-CAR-T细胞治疗的毒副作用，将PD-1高表达患者来源CD19-CAR-T细胞分别联合终浓度为72、36、18 µg/ml的Nivolumab，其中CD19-CAR-T+36 µg/ml Nivolumab与CD19-CAR-T细胞+72 µg/ml Nivolumab以及健康供者来源CD19-CAR-T比较，杀伤率差异无统计学意义。CD19-CAR-T+18 µg/ml Nivolumab组的杀伤活性低于36 µg/ml Nivolumab组，提示36 µg/ml Nivolumab联合CD19-CAR-T细胞治疗，可在减少Nivolumab毒副作用同时保证治疗效果，提高了治疗安全性，但如果进一步降低Nivolumab剂量可能无法保证治疗效果。

另外，CAR-T细胞释放的炎症因子对于CAR-T细胞在体内发挥清除肿瘤细胞的能力尤为重要[20]。为了评估应用Nivolumab后对CAR-T细胞活化的影响，我们检测了炎症因子IFN-γ和TNF-α水平，结果提示不同剂量Nivolumab联合CD19-CAR-T细胞不影响CD19-CAR-T细胞的炎症因子分泌，有良好的效果和安全性。

Funding Statement

基金项目：天津市卫生局科技基金（15KG135）；天津市卫计委重点攻关项目（16KG110）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（15JCQNJC45500）

Fund progran: Science and Technology Fund of Tianjin Municipal Health Bureau (15KG135); Key Projects of Tianjin Municipal Health Planing Commission (16KG110); and Frontier Technology Research Project(15JCQNJC45500)