长链非编码RNA在多发性骨髓瘤中的作用研究进展

在组成人类基因组DNA的30亿个碱基对中，约有5%~10%被稳定转录，而蛋白质编码基因只占人类基因组的一小部分（<2%），其余约3%~8%的转录序列中绝大多数为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）[1]–[3]，由于不能编码蛋白质，因此大部分ncRNA的功能被忽视。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度>200个核苷酸的转录片段，位于细胞核或细胞质中，无蛋白编码功能。近年来，随着对肿瘤发病机制研究的深入，lncRNA在基因转录过程中的重要作用逐渐成为研究的热点之一。lncRNA调控基因表达的机制涉及组蛋白甲基化、基因印迹、染色质重塑和转录时及转录后调控[4]–[7]，与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关[8]。目前发现多种表达异常的lncRNA，如HOTAIR、MALAT1、MEG3等[9]–[11]，与多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）发病密切相关。在本文中我们以MM相关的lncRNA为重点，对lncRNA参与MM的发病机制及调控方式展开综述，为MM发病机制的研究、诊断及治疗提供新的思路。

一、lncRNA表达与MM临床特征的相关性

Sedlarikova等[12]分选了6例MM患者和6名健康供者的骨髓浆细胞，采用PCR芯片进行lncRNA表达谱的筛选，在83种lncRNA中，27种lncRNA在MM患者中存在差异表达（与健康供者相比，在MM患者中14种lncRNA表达下调，13种lncRNA表达上调）。进一步选取异常表达的UCA1和NEAT1进行测试和验证，发现NEAT1灵敏度为55.0%，特异性为79.0%，而UCA1灵敏度为85.0%，特异度为94.7%。UCA1水平与白蛋白、单克隆免疫球蛋白水平、细胞遗传学及MM患者生存期存在相关性，UCA1高表达与del（13q14）、1q21扩增和t（4;14）之间存在显著相关性。而UCA1的低表达与超二倍体状态有关。Ronchetti等[13]采用芯片技术研究了95例初诊MM患者、30例浆细胞白血病患者和4名正常供者，检测了235个lncRNA和459个miRNA，并对其进行目标预测分析，发现了11种lncRNA-miRNA表达水平之间存在显著相关性，提示在MM中存在lncRNA-miRNA相互作用的新型竞争性内源RNA网络，其中包括lnc-MCL1-2和mir-17基因家族，lnc-AGBL1-4和mir-185-5p，lnc-DLEU2和miR-3175以及LINC00173和miR-221。Isin等[9]采用RQ-PCR技术检测了68例CLL患者、62例MM患者和36名健康供者的血浆lncRNA（TUG1、p21、MALAT1、HOTAIR和GAS5）的表达水平，发现与健康供者比较，MM患者TUG1表达显著升高，而MALAT1、HOTAIR和GAS5表达显著降低，并与患者的临床分期显著相关。

与此相反，其他研究中心的临床数据提示，MALAT1在MM患者中表达升高。Cho等[10]采用RQ-PCR技术检测了124例MM患者骨髓单个核细胞MALAT1表达水平，其中初诊45例，治疗后61例，复发或进展18例，结果显示：①初诊患者MALAT1表达水平较健康供者和治疗后患者明显升高，且升高程度与疾病状态呈相关性；②治疗后患者MALAT1表达水平的下降程度与预后也呈相关性：将MALAT1变化程度以ΔCt表示，早期进展者较晚期进展者ΔCt值小，以ΔCt值1.5为界将患者分为下降明显组（ΔCT≥1.5）和下降不明显组（ΔCT<1.5），前者的无进展生存（PFS）期较后者明显延长（24个月对11个月，P=0.001）。Handa等[14]研究发现，MM患者的MALAT1表达水平较意义未明的单克隆免疫球蛋白血症（MGUS）患者明显升高，髓外浆细胞瘤患者的MALAT1表达水平较髓内骨髓瘤患者明显升高，并且升高水平与总生存（OS）期和PFS期缩短相关；MALAT1表达水平与HSP90AA1、HSP90AB1和HSP90B1的表达呈正相关，而与TP53表达无关；硼替佐米及柔红霉素化疗可使MALAT1表达水平显著上调，提示MALAT1作为应激反应基因，通过化疗诱导表达，并与化疗后继发髓外浆细胞瘤形成相关。

二、lncRNA在MM中的作用机制

lncRNA在MM中的调控机制目前研究较少。Li等[15]探讨了MM患者间充质干细胞（MSC）中MALAT1的生物学功能，发现MALAT1可以与转录因子sp1相互作用，并招募sp1至LTBP3的启动子区，从而增强LTBP3基因的表达，而LTBP3可以特异性地调节TGF-β的生物学活性。Gao等[16]通过RQ-PCR和Western blot检测发现，在未治疗MM患者中，MALAT1和HMGB1蛋白表达水平明显升高，而在完全缓解MM患者，MALAT1和HMGB1表达水平下降；在MM细胞系KM3和U266细胞中，MALAT1和HMGB1也呈现一致性高表达。当利用构建的慢病毒载体敲低MM细胞中MALAT1表达水平后，HMGB1通过泛素化水平升高而降解。进一步研究发现，MALAT1通过上调HMGB1表达，可促进MM细胞的自噬。小鼠体内实验验证，敲低MALAT1表达水平可抑制肿瘤生长，同时，发现肿瘤细胞中HMGB1、Beclin-1、LC3B自噬相关蛋白表达水平下降。Zhuang等[11]研究发现，在成骨分化过程中，MM患者MSC内lncRNA MEG3的表达水平低于健康对照组。MEG3敲低可以显著下调成骨标志物（如RUNX2、Osterix及骨钙素）的表达水平，同时抑制转录骨形态发生蛋白4（BMP4）的转录。进一步通过染色质免疫沉淀、RNA免疫共沉降、荧光素酶报告等方法发现，MEG3位于BMP4基因附近，MEG3下调可导致转录因子SOX2与BMP4的启动子分离，MEG3、SOX2和BMP4结合区共同组成稳定复合物，而MEG3通过直接影响SOX2而激活BMP4转录，因此证实MEG3对MSC成骨细胞分化起关键作用，并且可作为MM潜在的生物标志和治疗靶点。另外，MEG3的启动子区高甲基化也与MM发病有关。Benetatos等[17]通过检测21例MM患者发现，64.7%IgG型和所有IgM型MM患者均出现MEG3高甲基化，IgA型MM却无MEG3高甲基化，并且甲基化水平与疾病分期和进展呈相关性。MEG3甲基化后可能通过上调促癌基因DLK1（Delta-1ike 1）的表达而诱导肿瘤的发生，但具体的作用机制未见明确报道。

近年来，lncRNA与miRNA之间的相互作用机制也逐渐成为研究热点之一。Meng等[18]发现，在MM细胞系及MM患者中，lncRNA CRNDE表达水平升高，并与肿瘤进展及预后呈显著相关性，在MM细胞系中，敲低CRNDE表达可显著抑制MM细胞增殖，使细胞周期停滞在G₀/G₁期，并促进细胞凋亡。进一步通过siRNA沉默CRNDE表达，发现miR-451表达水平升高，利用生物信息学和荧光素酶报告分析，揭示了CRNDE和miR- 451之间互补成键的相互作用方式。在MM患者中，Pearson's相关性分析证实了CRNDE与miR- 451表达呈负相关。随后，在CRNDE敲低后增殖受抑的肿瘤细胞中，加入miR-451阻断剂后可使肿瘤细胞增殖恢复。由此表明CRNDE通过作为一种竞争性内源RNA或分子海绵，通过负向调控靶点miR-451促进MM细胞增殖和抗凋亡，从而可作为MM一种新的诊断标志物和治疗靶点。Yang等[19]研究发现，在初诊和复发的MM患者瘤细胞和MM细胞系中，mir-410表达增加。临床分析表明miR-410与ISS高分期呈正相关，MM患者miR-410高表达预示OS期和PFS期缩短；体内外实验结果显示，miR-410可促进细胞增殖、细胞周期进展及抑制细胞凋亡。此外，KLF10被认为是MM细胞中miR-410的直接下游靶点，介导miR-410在MM中的功能，导致PTEN/AKT激活。在MM患者中，miR-410与KLF10呈负相关。改变KLF10的表达或采用AKT抑制剂，可部分抵消miR-410对MM细胞的生物学效应。此外，lncRNA oip5-as1在MM组织中表达下调，与miR-410表达呈负相关。lncRNA oip5-as1的缺失能够调控miR-410表达升高，通过激活MM中的PTEN/PI3K/AKT通路来抑制KLF10表达，从而促进细胞增殖、周期进展和抑制细胞凋亡。

三、lncRNA在MM诊断及预后判断中的意义

lncRNA在MM中的诊断及预后价值也逐渐引起关注。Zhou等[20]对大规模MM患者lncRNA表达谱进行分析，根据训练数据集开发了针对lncRNA的风险评分模型，然后在测试数据集和另外两个独立的外部数据集进行验证，采用时间依赖的ROC曲线对预后进行评估，最终得出4个lncRNA与MM患者的OS有显著相关性。在训练数据集中，根据所得出的4个lncRNA表达水平将患者分为高危、低危组，结果显示高危组患者OS较低危组缩短。在测试数据集和另外两个独立外部数据集中，以上4个lncRNA对预后价值的预测结果相似。多变量Cox回归和分层分析显示，该预测模型是不依赖临床特征（即包括血清β₂微球蛋白、血清白蛋白和乳酸脱氢酶）的独立预后因素。功能富集分析表明这4个lncRNA可能与MM相应的基因和表观遗传学事件有关。这些lncRNA作为新型且独立的生物标志物，为MM的诊断和预后提供帮助，并有利于认识MM的分子生物学基础。此外有研究者发现PCAT1、CRNDE-h以及GAS5等lncRNA表达水平与患者的临床特征具有相关性，可作为诊断MM的辅助手段[21]。MM中常见异常表达的lncRNA见表1。

表1. 多发性骨髓瘤（MM）中常见异常表达的长链非编码RNA（lncRNA）.

lncRNA	表达水平	表达的意义
CRNDE[18]	上调	CRNDE通过作为一种竞争性内源RNA或分子海绵，通过负向调控靶点miR-451促进MM细胞增殖和抗凋亡
OIP5-AS1[19]	下调	OIP5-AS1的缺失能够调控miR-410表达升高，通过激活MM中的PTEN／PI3K／AKT通路来抑制KLF10表达，从而促进细胞增殖、周期进展和抑制细胞凋亡
MALAT1[15]	上调	MALAT1通过转录因子sp1转录激活LTBP3，特异性调控MM患者间充质干细胞中TGF-β的生物学活性
MALAT1[16]	上调	MALAT1通过上调HMGB1表达，可促进MM细胞自噬，抑制细胞凋亡
MALAT1[14]	上调	MALAT1在硼替佐米和（或）柔红霉素化疗后表达水平上调，可能与髓外浆细胞瘤形成相关
MALAT1[10]	上调	初诊MM患者MALAT1表达水平较健康供者和治疗后患者明显升高，且升高程度与疾病状态呈相关性；治疗后患者MALAT1表达水平的下降程度与预后也呈相关性
MEG3[17]	下调	MM患者MEG3启动子区存在不同区域的高甲基化
MEG3[11]	下调	敲低MEG3可以显著下调成骨关键分子（如RUNX2、Osterix、骨钙素及BMP4）的表达水平
PCAT-1[21]	上调	MM患者血清中PCAT-1水平显著高于健康对照组，并与β2微球蛋白水平显著相关，而与LDH、κ及λ轻链浓度无关
UCA1[12]	异常调控	UCA1表达水平与白蛋白水平呈负相关，与血清M蛋白水平呈正相关；UCA1的高表达与del（13q14）、1q21扩增和t（4；14）之间存在显著相关性，UCA1的低表达与超二倍体状态有关

四、展望

通过基因芯片及基因组测序，发现了越来越多与疾病相关的lncRNA。尽管目前lncRNA在MM中的研究仍处于初步阶段，但是随着新一代测序技术的广泛开展、生物信息学的分析和研究手段的多样化，我们将发现更多与MM疾病相关的lncRNA，从而对MM的发病机制有更加深入的了解，并且lncRNA有可能成为MM临床诊断的新标志物，为治疗提供新的靶点及新的预后指标，因而具有深远的意义。

Funding Statement

基金项目：天津市卫生局重大攻关项目（15KG150）；天津市抗癌重大专项攻关计划（12ZCDZSY18000）