miR-223靶向调控SOX11在套细胞淋巴瘤中的预后意义

Abstract

Objective

To explore the expression and prognostic significance of miR-223 in patients with mantle cell lymphoma (MCL) and to investigate the possible mechanism.

Methods

Twenty-one newly diagnosed MCL patients with bone marrow involvement were enrolled in the present study, 20 healthy donors as normal control. The expression level of miR-223 and SOX11 mRNA was determined by RQ-PCR. CCK-8 and flow cytometer assays were used to analyze cell proliferation, cell cycle and apoptosis of the constructed miR-223 overexpressing MCL cell line, Granta519 cells. SOX11 protein expression level was determined by Western blot. The target gene of miR-223 was confirmed by dual luciferase reporter assay.

Results

①Of the 21 newly diagnosed MCL patients, 15 were male and 6 female, the median age was 58 (37–72) years. The expression level of miR-223 was significantly down regulated in MCL patients compared with that of healthy donors (14.7±10.5 vs 1 244.1±1 935.2, P<0.001). The lower expression of miR-223 was inversely correlated with high-risk mantle international prognostic index (P=0.001), elevated LDH (P=0.001), ECOG score ≥2 (P=0.035). ②Using the median relative expression level of miR-223 as the cutoff value, 21 MCL patients were divided into high-expression group (n=10) and low-expression group (n=11) and found that the high-expression group had a significantly superior OS (median OS: 36 vs 12 months, P=0.021). ③In vitro results showed that compared with the control group, the proliferation of miR-223 overexpressed Granta519 cells was inhibited (the most significant reduction on 96h, P<0.001), manifested by lower proportion of cells in G2/M phase (P<0.001) and increased apoptosis (P<0.001), and the expression level of SOX11 protein in Granta519 cells was significantly lower than that of the control group. ④miR-223 could inhibited the 3′ untranslated region of SOX11, and the expression level of miR-223 was significantly negatively correlated with mRNA level of SOX11 in MCL patients (r=−0.81, P<0.001).

Conclusion

The expression of miR-223 was repressed in MCL and was associated with poor clinical outcomes, which may be probably attributed to its direct targeting SOX11.

miRNA是一类包含21–23个核苷酸的非编码单链RNA分子，其结合靶mRNA的3′非翻译区（UTR）并引发mRNA的降解或翻译抑制[1]。套细胞淋巴瘤（MCL）占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的5%~10%，其重要的临床特征t（11;14）的出现导致细胞周期蛋白D1（CCND1）过表达，从而造成细胞周期紊乱而导致疾病发生[2]。然而，约10%的MCL患者无CCND1过表达[3]，而且在转基因小鼠中的研究结果亦表明单独出现t（11;14）不足以导致淋巴瘤发生[4]，提示还有其他基因异常参与了MCL的发病。为此我们在前期工作的基础上进行本研究，以探讨miR-223在MCL中的作用。

病例与方法

1．病例：以21例骨髓受累的初治MCL患者为研究对象，所有患者经FISH检测t（11;14）均呈阳性，在治疗前收集相关临床特征指标。在获得患者知情同意后，采集3~5 ml外周血经Ficoll梯度离心获得单个核细胞（MNC），并采用抗CD19磁珠进行分离纯化，作为肿瘤细胞供后期检测使用。所有标本均经流式细胞术检测以保证纯度≥90%。以20例健康正常供者为正常对照。

2．miR-223过表达MCL细胞系的建立：用含hsa-pre-miR-223序列的GFP标记GV208载体转染293T细胞获得病毒颗粒，并感染MCL细胞系Granta519细胞（购自American Type Culture Collection细胞库），流式细胞术分选GFP阳性细胞，获得稳定过表达miR-223的Granta519细胞。

3．RQ-PCR法检测miR-223表达水平：取MCL患者和健康供者分离纯化后保存的MNC，按照miRNA定量检测试剂盒（美国ABI公司产品）说明书进行操作，检测CD19⁺淋巴细胞miR-223表达水平，以RNU48 miRNA为内参照，采用2^−ΔΔCt方法计算miR-223的表达水平。每组设3个复孔以保证其重复性。

4．Western blot法检测SOX11蛋白表达：通过搜索数据库miRanda、Pictar、Targetscan和miRbase，我们发现SOX11的3′-UTR包含与miR-223完全匹配的序列。将MCL患者细胞和细胞系细胞提取物上样于SDS-PAGE胶进行分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，50 g/L脱脂牛奶溶液封闭、PBST洗涤3次后，与抗SOX11（英国Abcam公司产品）、抗β-actin抗体（美国Santa Cruz公司产品）4 °C孵育过夜。次日与偶联辣根过氧化物酶的二抗孵育后，进行蛋白条带显影。

5．功能实验：实验分组：①实验组（过表达组）：稳定过表达miR-223的Granta519细胞系；②对照组（非过表达组）：转载空质粒的Granta519细胞系。采用CCK8法检测细胞增殖（试剂盒为美国Sigma-Aldrich公司产品），以5 000个细胞/孔进行铺板后，在不同的时间段分别收集细胞，检测450 nm处的吸光度（A）值并计算细胞活力。采用流式细胞术Annexin Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡和细胞周期（CantoⅡ流式细胞仪，美国BD公司产品），采用FlowJo软件进行数据分析。每组设3个复孔，实验重复3次。

6．双荧光素酶报告基因实验验证miR-223的靶基因：按照双荧光素酶检测试剂盒（上海吉凯基因化学技术有限公司产品）说明书进行操作。将hsa-miR-223载体和含有SOX11野生型或突变体3′-UTR的GV272-萤光素酶载体共转染293 T细胞，以TRAF6 3′-UTR的萤光素酶载体为阳性对照。采用共转染的海肾萤光素酶报告载体为内对照，以标准化荧光素酶活性。在转染后48 h收获细胞，进行检测。

7．统计学处理：采用SPSS 20.0软件进行数据分析。由于临床标本中miR-223表达水平不符合正态分布，故使用非参数检验进行miR-223表达的比较。总生存（OS）时间定义为从诊断到死亡或失访的间隔时间。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，并应用Log-rank检验进行组间比较。功能实验及双荧光素酶报告基因实验均采用Student's t检验进行分析。应用Spearman相关性评估临床标本中miR-223和SOX11的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．miR-223在MCL患者中的表达：21例患者中，男15例，女6例，中位年龄为58（37~72）岁。其中MCL国际预后指数（MIPI）评分中高危组17例，低危组4例。MCL患者组miR-223表达水平较正常对照组明显下调（14.7±10.5对1 244.1±1 935.2，P<0.001）。

2．miR-223在不同临床亚组患者中的表达及预后意义：如表1所示，miR-223低表达与患者MIPI评分高危组（P=0.001）、LDH升高（P=0.001）、美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分≥2分（P=0.035）等高危临床特征相关。

表1. 不同临床亚组套细胞淋巴瘤（MCL）患者miR-223表达比较（均数±标准差）.

组别	例数	miR-223表达水平	P值
MIPI评分			0.001
低危组（0～3分）	4	26.9±13.9
中危组（4～5分）	7	18.3±7.1
高危组（6～11分）	10	7.2±2.9
LDH			0.001
正常	13	19.9±10.2
升高	8	6.2±2.2
ECOG评分			0.035
<2分	14	18.0±10.6
≥2分	7	8.0±6.9
WBC			0.085
<50×109/L	16	16.9±11.0
≥50×109/L	5	7.6±4.3

注：MIPI评分：MCL国际预后指数评分；LDH：正常值范围为109~245 U/L；ECOG评分：美国东部肿瘤协作组评分

为了解miR-223表达水平对MCL患者的预后意义，我们以MCL患者组的miR-223中位表达水平（11.5）为阈值，将患者分为miR-223高表达组（10例）和低表达组（11例）进行生存分析，结果显示miR-223高表达组患者的OS时间明显较低表达组延长（36个月对12个月，P=0.021）（图1）。

图1. miR-223表达水平对套细胞淋巴瘤患者总生存的影响.

3．miR-223过表达对MCL细胞增殖和凋亡的影响：结果显示，miR-223过表达的Granta519细胞miR-223表达水平较对照组增高，miR-223过表达后可明显抑制MCL细胞的增殖（在培养96 h时最为明显），差异有统计学意义（P<0.01）（图2）。miR-223过表达时处于G₂/M期的细胞明显减少，进入G₀/G₁期的细胞增多；miR-223过表达时细胞凋亡比例较对照组显著增高，差异有统计学意义（P值均<0.05）（图3）。

图2. miR-223过表达对套细胞淋巴瘤细胞增殖的影响（*P<0.001）.

图3. miR-223过表达对套细胞淋巴瘤细胞凋亡的影响（*P<0.05，**P<0.001）.

4．miR-223靶基因SOX11的表达：Western blot法检测结果显示，过表达miR-223的Granta519细胞SOX11蛋白表达水平明显低于对照组（图4）。RQ-PCR法检测结果显示，MCL患者的miR-223表达水平和SOX11表达水平呈明显负相关（图5）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，当与miR-223质粒共转染后，SOX11野生型3′-UTR产生的荧光素酶强度明显降低，且其抑制程度与阳性对照靶基因TRAF6相似，相反SOX11突变型3′-UTR的荧光素酶活性则无明显变化（图6）。

图4. Western blot法检测SOX11蛋白的表达.

1：对照组；2：miR-223过表达组

图5. RQ-PCR法检测套细胞淋巴瘤患者的miR-223和SOX11表达水平的相关性.

图6. 双荧光素酶报告基因实验验证miR-223的靶基因SOX11（转染细胞为293 T细胞）（*P<0.05）.

讨论

过去几十年中，大量的研究表明miRNA参与多种疾病的发生、发展，可作为相关疾病诊断、预后的生物学指标[5]。作为髓系发育的一个指标，miR-223异常在粒细胞分化及急性髓系白血病中研究较多，尤其是伴t（8;21）的急性白血病，研究发现融合蛋白AML/ETO可引起miR-223的表观遗传沉默，从而影响粒细胞的分化过程，参与白血病的发生[6]。有研究表明miR-223可作为复发性卵巢癌、胃癌、食管鳞状细胞癌的潜在生物学标志[7]–[9]。除了实体肿瘤，在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中亦发现miR-223显著低表达，并与肿瘤负荷相关，更重要的是miR-223与其他指标共同组成的风险分层模型可以很好地区分不同危险度的CLL[10]。结外边缘区淋巴瘤患者的miR-223表达水平上调，并抑制生发中心相关基因LMO227的表达而参与疾病发生[11]。

在本研究中我们的数据显示，与正常对照相比，miR-223在MCL患者中表达下调，且具有高危临床特征的患者（如MIPI高危、LDH升高、体能状态差、高白细胞者）miR-223表达水平更低，且低表达预示患者预后不良。但鉴于本研究纳入的病例数偏少，尚需更大样本的研究以进一步证实该结论。我们在MCL细胞系细胞中通过过表达miR-223来探讨其作用机制，结果显示miR-223过表达可降低细胞活力，导致细胞周期阻滞及凋亡增加，该发现提示miR-223可能为MCL的抑癌基因，但具体的作用机制尚需进一步深入研究。Wu等[12]的研究结果显示miR-223在结直肠癌、宫颈癌和肝癌细胞中的过表达可通过上调p21、p27及下调cyclin D1而阻滞细胞生长。我们的体外实验结果与其一致。然而有研究者报道，当胃癌细胞过表达miR-223后，体内外实验均显示细胞凋亡受抑、增殖加速[13]。

为了进一步阐明miR-223在MCL中的作用，我们搜索了相关的数据库并发现SOX11可能是miR-223的靶基因。在本研究中，我们首先采用Western blot法，发现过表达miR-223的MCL细胞系细胞其SOX11蛋白表达水平较对照组明显降低；而后双荧光素酶报告基因实验的结果显示，miR-223特异性地与SOX11 3′UTR结合并抑制其转录。在MCL患者标本中，我们也发现miR-223和SOX11 mRNA表达水平存在明显的负相关。证实miR-223直接靶向SOX11，从而为miR-223参与MCL的发病提供了一定的理论依据。

自2008年Ek等[14]首次报道SOX11在MCL中特异性表达后，对该转录因子的研究越来越多。目前普遍认为SOX11在经典的MCL细胞中高表达，且与患者的预后相关；在CCND1阴性患者中亦表达升高[15]。然而结论并不完全一致。Wang等[16]的研究结果显示，当原本应在胞核表达的SOX11在胞质中表达时，该类MCL患者的OS时间较阴性者明显缩短。相反，Nygren等[17]则发现SOX11阴性的MCL患者预后较差，其主要表现为较易出现淋巴细胞增多、LDH升高及p53表达。Kuo等[18]通过Meta分析发现MCL患者中SOX11高表达者较低表达者OS时间延长，特别是在接受高剂量化疗的患者中更为明显。而本研究并没有发现SOX11表达水平与MCL患者预后之间的关系，该结论尚需扩大临床样本以进一步证实。

总之，我们的研究结果显示miR-223在MCL患者中低表达且提示预后不良，初步的实验结果提示miR-223可能通过靶向SOX11而发挥作用，针对miR-223、SOX11的靶向策略可能会为MCL患者提供新的治疗选择。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81470336）；河南省科技攻关计划项目（201403201）

Fund program: National Natural Science of China (81470336); Project of Scientific and Technological Breakthrough of Henan (201403201)