骨髓增生异常综合征患者去甲基化治疗后WT1 mRNA水平的变化及其预后意义

Abstract

目的

监测骨髓增生异常综合征（MDS）患者去甲基化治疗后WT1 mRNA水平的变化，评估WT1 mRNA水平变化在判断患者疗效、区分不同疾病稳定（stable disease, SD）状态中的意义。

方法

以2009年11月至2018年3月56例在广东省人民医院接受去甲基化治疗（≥4个疗程）的MDS患者为研究对象，实时定量PCR检测其骨髓或外周血WT1 mRNA的表达，观察WT1 mRNA表达水平的动态变化与患者临床疗效和预后的相关性。

结果

去甲基化治疗3个疗程后，MDS患者WT1 mRNA水平较治疗前显著降低。20例疾病进展患者病情进展或转为急性髓系白血病（AML）后WT1 mRNA表达水平较治疗前明显升高。45例SD的MDS患者，根据SD期间WT1 mRNA表达水平变化分为WT1升高与未升高两组，SD期间WT1 mRNA表达水平升高的患者中病情进展或转AML的比例为95.65%（22/23），而SD期间WT1 mRNA表达水平未升高的患者中病情进展或转为AML的比例为9.09%（2/22）（χ²=33.852，P<0.001）。与SD期间WT1 mRNA表达水平未升高的患者相比，SD期间WT1 mRNA表达水平升高的患者的总生存期[17（95%CI 11~23）个月对未达到，P<0.001]和无进展生存期[13（95%CI 8~18）个月对未达到，P<0.001]明显缩短。

结论

WT1 mRNA表达水平是评估MDS患者去甲基化治疗后疗效变化有效的实验室指标，尤其对于SD的患者，动态检测WT1 mRNA表达水平，可预测病情演变，从而指导临床治疗。

目前去甲基化药物阿扎胞苷和地西他滨是骨髓增生异常综合征（MDS）的标准治疗之一[1]–[2]，临床上采用修订的国际工作组（IWG）标准来评估去甲基化治疗的疗效以及判断是否需要更改治疗方案[3]。但IWG标准中疾病稳定（stable disease, SD）的患者预后存在显著不同，一部分患者持续稳定或缓解，而另一部分患者却出现疾病进展或快速转化为急性髓系白血病（AML）。WT1基因是白血病原始细胞肿瘤负荷的标志物，WT1 mRNA高表达与AML预后不良相关[4]–[5]。WT1表达水平也与MDS患者的预后显著相关[6]。本研究我们通过检测MDS患者去甲基化治疗前后WT1转录本水平的变化，评估WT1转录本变化在判断患者疗效、区分不同SD状态患者中的意义。

病例与方法

1．病例：以2009年11月至2018年3月我院确诊的临床资料齐全并接受了至少4个疗程去甲基化治疗的56例MDS患者为研究对象，诊断及分型参照WHO 2008标准。

2．去甲基化治疗方案及疗效判断：地西他滨：20 mg·m⁻²·d⁻¹×5 d，静脉滴注，4~6周为1个疗程；阿扎胞苷：75 mg·m⁻²·d⁻¹×7 d，皮下注射，4~6周为1个疗程。根据IWG 2006标准[3]判断疗效，SD定义为疗效未能达到最低程度的部分缓解，但至少两个月无证据显示疾病进展。

3．RNA提取和cDNA合成：收集患者治疗前、每个去甲基化治疗疗程开始前骨髓或外周血标本。56例患者中，有28例患者标本采自骨髓，其余28例采自外周血，每一例患者不同时间点WT1评估标本均为同一类型标本（全部骨髓或外周血）。用红细胞裂解液裂解红细胞，按TRIzol提取试剂盒（美国Invitrogen公司产品）说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，按操作说明进行。

4．定量PCR（Q-PCR）检测WT1 mRNA表达：以ABL1基因为内参，ABL1和WT1转录本Q-PCR引物和探针序列参照文献[7]–[8]，由上海英潍捷基生物科技有限公司合成。由于ABL1与WT1引物和探针的扩增效率接近，故二者共用ABL1标准曲线进行计算[9]。每一标本分别进行2次WT1和ABL1基因的定量检测，总反应体系为20 µl，其中含标准品或样品cDNA 1 µl，引物0.3 µmol/L，探针0.2 µmol/L，2×Taqman Universial Master Mix 10 µl（ABI），反应条件为：50 °C 2 min，95 °C 10 min，95 °C 15 s，62 °C 1 min，45个循环。骨髓WT1水平正常范围为0~15.94，外周血WT1水平正常范围为0~1.12，WT1水平超过正常范围的上限则定义为表达水平升高[10]。每例患者中位检测WT1 5（3~12）次。在检测区间内，WT1水平持续升高的患者归为WT1升高组，WT1水平持续降低或在正常范围附近波动的患者归为WT1未升高组；对于WT1水平波动的患者，如果最后一个检测点的结果仍明显高于正常范围，归为WT1升高组，如果降低至正常或接近正常范围，归为WT1未升高组。

5．随访：随访至2018年3月1日，中位随访时间为23（5~100）个月。总生存（OS）期按确诊日期至任何原因死亡或随访结束日计算。无进展生存（PFS）期按确诊日期至疾病进展或死亡或随访结束日计算。

6．统计学处理：采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。WT1水平以中位数（范围）表示，两组间比较采用配对Wilcoxon符号秩检验。两组间疾病进展率的比较采用卡方检验。生存分析使用Kaplan-Meier法，Log-rank检验进行组间比较。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．一般临床资料：56例MDS患者中，男36例（64.3%），女20例（35.7%）。中位年龄61（21~75）岁。WHO 2008分型：难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）-1 13例，RAEB-2 27例，难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD）4例，慢性粒单核细胞白血病（CMML）11例，5q−综合征1例。15例患者经阿扎胞苷治疗，41例患者经地西他滨治疗，中位去甲基化治疗7（4~23）个疗程。IPSS危险度分层：中危-1 18例，中危-2 26例，高危12例。IPSS染色体核型分组：预后好32例，预后中等10例，预后差14例。

2．去甲基化治疗后WT1水平变化及与疗效关系：56例MDS患者去甲基化治疗3个疗程后WT1 mRNA水平[57.310（0.010~3 309.510）]较治疗前[114.354（0.175~6 249.793）]明显降低（z=−4.845，P<0.001）。15例接受阿扎胞苷治疗的患者治疗后WT1 mRNA水平[55.397（0.271~3 309.510）]较治疗前[103.429（6.550~6 249.793）]明显降低（z=−2.613，P=0.009）。41例接受地西他滨治疗的患者治疗后WT1 mRNA水平[59.222（0.010~1 307.644）]较治疗前[125.279（0.175~2 282.547）]亦明显降低（z=−4.024，P<0.001）。

按照治疗过程中达到的最佳反应分析，入组的56例患者治疗后均获得了SD以上的疗效：骨髓完全缓解（mCR）31例（55.4%），血液学改善（HI）2例（3.6%），SD 23例（41.0%）。最终24例患者发生疾病进展或转化为AML，其中阿扎胞苷治疗组11例，地西他滨治疗组13例。4例患者进展后未进行WT1表达水平检测，余20例患者病情进展或转AML后的WT1 mRNA表达水平[626.421（11.717~11 878.792）较治疗前[142.266（6.361~6 249.793）]明显升高（z=−3.435，P=0.001）。

3．SD期间WT1水平变化与预后的关系：56例患者中45例SD期持续至少2个疗程，可以对其SD期间的WT1水平变化情况进行分析。其中23例患者SD期间WT1 mRNA表达水平升高（WT1升高组），22例患者的WT1 mRNA水平在SD期间降低或在正常范围附近波动（WT1未升高组）。

WT1升高组中，22例（95.65%）患者转化为AML或进展后死亡，其余1例死于消化道出血，死亡前无疾病进展。WT1未升高组中，2例（9.09%）疾病进展，12例（54.55%）在达到SD后维持SD或获得骨髓缓解，且直至随访结束时仍然存活，6例（27.27%）死亡前无疾病进展，分别死于出血性休克、呼吸衰竭和肺部转移；其余2例失访。WT1升高组患者疾病进展和转化为AML的比例显著高于WT1未升高组（χ²=33.852，P<0.001）。

4．SD期间WT1水平变化与生存期的关系：SD期间WT1升高组患者中位OS时间为17（95%CI 11~23）个月，中位PFS时间为13（95%CI 8~18）个月。WT1未升高组中，中位OS与PFS时间均未达到。SD期间WT1 mRNA水平升高的患者OS和PFS时间均明显短于WT1 mRNA水平非升高患者（P值均<0.001）（图1）。

图1. 疾病稳定期间骨髓增生异常综合征患者按WT1 mRNA水平变化分组的总生存（A）和无进展生存（B）比较.

讨论

使用去甲基化药物进行表观遗传学治疗是现今MDS的标准治疗之一[2],[11]。但是，去甲基化治疗的有效率仍然较低，且较多患者在治疗过程中会失去疗效[12]–[13]。SD患者是否真正处于稳定状态，是否应继续使用去甲基化治疗或更改治疗方案，是临床上常见的问题。

WT1基因是白血病细胞的肿瘤标志[14]。而且，WT1表达水平与MDS的疾病进展过程是显著相关的。Tamaki等[6]报道骨髓和外周血中WT1表达水平随着MDS的疾病进展过程成比例地显著增加。且外周血中WT1表达水平与RAEB或RAEB-t在6个月内进展为明显的AML显著相关。Cilloni等[15]报道MDS各亚型患者的骨髓和外周血样本中WT1 mRNA表达水平均高于健康志愿者。RAEB和MDS转化的继发AML（s-AML）患者中WT1 mRNA表达水平远高于难治性贫血（RA）患者，且在疾病进展期间WT1 mRNA表达水平增加。最近发表的研究结果亦表明恶性程度较高的MDS分型的WT1基因表达水平较高[16]–[17]。根据WHO2016分型标准进行分析亦可发现，随着疾病分型恶性程度增加，WT1表达呈增高趋势[18]。我们通过检测地西他滨或阿扎胞苷治疗的患者多个时间点的WT1 mRNA水平，发现治疗3个疗程后，MDS患者WT1 mRNA水平较治疗前显著降低。患者发生疾病进展后，WT1 mRNA的表达水平较治疗前明显增高，与已发表的研究结果一致。说明在使用去甲基化治疗时，WT1 mRNA水平也可反映MDS病情变化与去甲基化治疗的疗效。

根据IWG2006标准[3]，疾病稳定（SD）指患者的疗效不能达到最低程度的部分缓解（partial remission, PR），但至少8周无证据显示疾病进展。临床发现，去甲基化治疗后处于SD期的MDS患者具有一定的异质性。而且，不同患者的SD持续时间不同，目前仍不清楚SD期患者不良预后的影响因素。我们检测SD期MDS患者的WT1 mRNA表达水平的动态变化，发现SD期间WT1 mRNA表达水平并非恒定，部分患者WT1水平呈升高趋势，部分患者WT1水平持续降低或在正常范围波动。根据WT1水平的变化将患者分为升高与未升高两组。95.65%SD期间WT1 mRNA表达水平升高的患者病情进展，而在未升高组中，只有9.09%患者病情进展。表明MDS患者去甲基化治疗后，WT1 mRNA水平在SD期的变化可确切反映患者的预后，通过监测WT1 mRNA水平在SD期的变化可尽早发现病情可能进展的患者。

近期发表的研究报道WT1 mRNA表达水平较高的MDS患者的OS、PFS、无白血病生存（LFS）时间均较短[16]–[17]。我们随访发现SD期WT1 mRNA表达水平升高的患者OS和PFS时间均较未升高的患者明显缩短，说明WT1 mRNA水平在SD期逐渐升高是生存期较短的可靠预测指标。

迄今很多指标可以用作预测去甲基化药物治疗急性白血病或MDS的临床反应[19]。其中包括性别、年龄、骨髓原始细胞比例、血小板改变、基因突变、基因甲基化水平、基因表达、Micro-RNA、蛋白质表达、细胞信号通路等。叶丽等[20]关于小剂量地西他滨治疗较低危MDS的研究显示，年龄是影响疗效的独立预后因素，年龄<60岁组患者的总体反应率高于年龄≥60岁组（68.2%对31.0%，P=0.010）。同时年龄、基因突变对PFS有显著影响，年龄<60岁组患者中位PFS时间长于≥60岁组（未达到对10.3个月，P=0.001），基因突变阴性患者中位PFS时间长于突变阳性（除单纯SF3B1阳性）者（18.5个月对9.2个月，P=0.008）。赵佑山等[21]报道TP53基因突变、1个疗程后PLT倍增及复杂核型可预测地西他滨完全缓解。上述指标在临床上作为地西他滨治疗MDS的疗效评价及预后评估指标均有一定的实用价值，但其中大部分未作为临床常规检测指标。WT1检测具有易于操作且较经济、已在临床推广、准确性较高等优点，与上述指标结合可取得较全面的评估结果。更重要的是，我们的研究首次表明，WT1 mRNA表达水平对预测SD期患者临床发展趋势具有实用价值。

综上所述，WT1 mRNA表达水平变化是评估MDS患者去甲基化治疗后疗效与疾病进展的有价值的实验室指标。尤其对处于SD的患者，动态检测WT1 mRNA表达水平，可预测病情演变，从而指导临床治疗。由于本研究为单中心回顾性研究，并且对WT1 mRNA表达对OS和PFS仅作了单因素分析，这些因素可能致研究结果存在偏倚。因此，WT1 mRNA在评估和预测MDS患者病情方面的确切临床意义还需在前瞻性、大样本临床研究中进一步明确。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81500012）；广东省科技计划（2014B020212009、2017B020230004）

Fund program: National Natural Science Foundation of China（81500012）; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province（2014B020212009, 2017B020230004）